專利名稱：一株過表達(dá)木聚糖酶的斜臥青霉工程菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物工程領(lǐng)域；具體地說，本發(fā)明涉及一株過表達(dá)木聚糖酶I的斜 臥青霉工程菌，還涉及該菌株在生產(chǎn)木聚糖酶中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
木聚糖酶(xylanase)是指能專一降解半纖維素木聚糖為低聚木糖和木糖的一 組酶的總稱。它在紡織、造紙、飼料及食品等工業(yè)中顯示了廣泛的應(yīng)用前景，特別在紙漿 漂白工藝中，木聚糖酶的應(yīng)用能夠降低含氯化合物的用量，對(duì)有效降低環(huán)境污染，解決嚴(yán) 重困擾造紙業(yè)的污染問題具有極其重大的現(xiàn)實(shí)意義(Gibbs MD, et al. (1995). Cloning, sequencing, andexpression of a xylanase gene from the extreme thermophile Dictyoglomus thermophilumRt46B. 1 and activity of the enzyme on fiber-bound substrate. Appl Environ Microbiol. 61(12) :4403_8)。木聚糖酶主要來自細(xì)菌和真菌， 報(bào)道較多及產(chǎn)酶活力較高的微生物主要是黑曲霉、木霉和青霉等真菌，它們所產(chǎn)的酶大多 屬酸性木聚糖酶(劉偉豐等.(2004).短小芽孢桿菌β-1，4-木聚糖酶基因在大腸桿菌中 的高效表達(dá).農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào).12 (4) :455-459)。目前，有100多種木聚糖基因被克隆 和表達(dá)在同源或異源的宿主中，通過超表達(dá)木聚糖酶或改變其特性以適應(yīng)商業(yè)應(yīng)用(Ahmed S,et al. (2009). Molecular cloning offungal xylanases :an overview. Appl Microbiol Biotechnol. 84(1) 19-35)。斜臥青霉(Penicillium decumbens)具有很強(qiáng)的降解天然纖維素底物的能力，除 了因?yàn)槠淠墚a(chǎn)生高效的纖維素酶酶系外，它還會(huì)產(chǎn)量大量的木聚糖酶。但是現(xiàn)有的生產(chǎn)方 法中其木聚糖酶產(chǎn)量仍不能很好的滿足目前工業(yè)生產(chǎn)的需求，因此需要構(gòu)建一株能過表達(dá) 木聚糖酶的斜臥青霉(Penicillium decumbens)工程菌以便降低木聚糖酶生產(chǎn)成本，然而， 檢索結(jié)果還未見有相關(guān)工作的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明要解決的問題是提供一株能過表達(dá)斜臥青霉木聚糖 酶I的工程菌及其在生產(chǎn)木聚糖酶中應(yīng)用。利用該工程菌可以明顯提高斜臥青霉的木聚糖
酶產(chǎn)量。本發(fā)明所述過表達(dá)木聚糖酶的斜臥青霉工程菌，其特征在于所述菌株含有來自 斜臥青霉(Penicillium decumbens)的木聚糖酶I (xyll) cDNA基因的過表達(dá)載體pXXT，其 菌命名為斜臥青霉(Penicillium decumbens)X8，并于2010月5日7日保藏于“中國典型 培養(yǎng)物保藏中心”，保藏號(hào)為CCTCC M 2010110。上述斜臥青霉工程菌的特征為菌落形態(tài)小而均勻，質(zhì)地緊密，呈毛氈狀；菌落與 培養(yǎng)基間的連接緊密，不易挑??；在麩皮培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，菌絲體為初期白色，呈不擴(kuò)散 式蔓延，培養(yǎng)4天左右，菌絲體表面出現(xiàn)淡粉色孢子，繼續(xù)培養(yǎng)，孢子顏色逐漸加深為粉色， 深紅色(圖7)；其在液體發(fā)酵時(shí)木聚糖酶活力最高可達(dá)219. 82IU/ml。
上述斜臥青霉工程菌的構(gòu)建方法參照常規(guī)的絲狀真菌基因轉(zhuǎn)化方法，將含有斜 臥青霉(Penicillium decumbens)xyl 1 cDNA基因的過表達(dá)載體pXXT(圖1和圖2)轉(zhuǎn)化斜 臥青霉(Penicillium decumbens) JU-AlO原生質(zhì)體，在含150μ g/ml潮霉素B的選擇培養(yǎng) 基上篩選得到轉(zhuǎn)化子。提取轉(zhuǎn)化子染色體DNA，經(jīng)過PCR和southern驗(yàn)證得到8株遺傳穩(wěn) 定轉(zhuǎn)化子，驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子結(jié)果見圖3和圖4。對(duì)以上斜臥青霉轉(zhuǎn)化子進(jìn)行液體發(fā)酵并對(duì)其木 聚糖酶活力進(jìn)行測(cè)定，其中X8的木聚糖酶活力最高，可以達(dá)到219. 82IU/ml，是出發(fā)菌株斜 (140. 00IU/ml)的 1. 57 倍(見圖 6)，將其命名為斜臥青霉(Penicillium decumbens)X8。本發(fā)明所述斜臥青霉工程菌在生產(chǎn)木聚糖酶中的應(yīng)用。其中所述斜臥青霉工程菌生產(chǎn)木聚糖酶酶液的形式是以液體發(fā)酵方法實(shí)施；其中所述發(fā)酵方法是將斜臥青霉(Penicillium decumbens)Gi31_2 CCTCC M 2010110接種 到裝有50-90ml葡萄糖基本培養(yǎng)基的300-500ml三角瓶中，28_30°C，在80_100rpm往復(fù)式 搖床上培養(yǎng)24-48h，得發(fā)酵種子液；將得到的種子液先抽濾收集濕菌絲，再按Ig 150ml 的比例將濕菌絲接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)100-116h，然后以6000-8000rpm，4°C離心 10-15min,收集的上清液即為木聚糖酶的酶液。其中，上述葡萄糖基本培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖20，(NH4)2S045, KH2PO415, MgSO4O. 6, CaCl2O. 6，F(xiàn)eSO4 ·7Η20 0· 005，MnSO4 · H2O 0· 0016，ZnSO4 · 7Η20 0.0014，CoCl2 0. 002，ρΗ5. 5。發(fā)酵培養(yǎng)基(w/v) =Mandels鹽溶液，2%木糖渣，的微晶纖維素，5%的麩皮汁。本發(fā)明首次采用過表達(dá)斜臥青霉(Penicillium decumbens) xyll cDNA基因的策 略得到高產(chǎn)木聚糖酶的工程菌斜臥青霉(Penicillium decumbens)X8CCTCC M 2010110，其 具有很高的木聚糖酶活力，液體發(fā)酵情況下木聚糖酶活力最高可以達(dá)到219. 82IU/ml，是出 發(fā)菌株(140.00IU/ml)的1.57倍。預(yù)示該工程菌在木聚糖酶生產(chǎn)中有著非常廣泛的應(yīng)用。


圖1. pXXT-hph載體的構(gòu)建。圖2.重組質(zhì)粒pXXT的PCR鑒定瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。其中:Μ,λ DNA/PstI ；1，xyll 基因；2，xyn2 啟動(dòng)子。圖3. X系列斜臥青霉轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定(A和B)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。其中(A) PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子中木聚糖酶II (xyn2)啟動(dòng)子片段；(B)以xyn2pS andxyllca為引物PCR擴(kuò)增包含xyn2啟動(dòng)子和xyll的基因區(qū)。Μ，λ DNA/PstI ；+，陽性對(duì) 照(pXXT-hph 質(zhì)粒)；1，Xl ;2，X2 ；3，X3 ；4，X5 ；5，X8 ；6，X9 ；7，X42 ；8，出發(fā)菌株。圖4. X系列斜臥青霉轉(zhuǎn)化子基因組與800bp xyll探針的Southern雜交結(jié)果。其中:M,Ikb Ladder ；1，Xl ；2，X2 ；3，X3 ；4，X5 ；5，X6 ；6，X8 ；7，X9 ；8，X42 ；9，出發(fā) 菌株；10，陽性對(duì)照(pXXT-hph/Hindlll)。圖5.木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖 6.工程菌株斜臥青霉(Penicillium decumbens) X8CCTCC M 2010110 和出發(fā)菌
株木聚糖酶酶活測(cè)定結(jié)果。其中▲，斜臥青霉(Penicilliumdecumbens)Gi31_2CCTCC M 2010111 ； ，出發(fā)菌株。圖 7.工程菌株斜臥青霉(Penicillium decumbens)X8CCTCC M 2010110 菌落形態(tài)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1.斜臥青霉木聚糖酶I基因的克隆與序列測(cè)定首先對(duì)斜臥青霉的木聚糖酶I基因(xyll)保守區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增及序列測(cè)定，經(jīng)過擴(kuò)增得到503bp保守區(qū)DNA片段。具體過程如下根據(jù)NCBI上提交的部分絲狀真菌木聚糖酶(如Aspergillus fumigatus Af293XynGl> Trichoderma. reesei xynl> Trichoderma sp. SY xylanase、Trichoderma viride strainYNUCC0183endo-l, 4-beta-xylanase> Penicillium citrinum xyll)蛋 白質(zhì)氨基酸保守區(qū)序列設(shè)計(jì)簡并引物對(duì)xyllFA和xyllRC，以斜臥青霉(Penicillium decumbens) 114-2 (曲音波，高培基，王祖農(nóng)，《青霉的纖維素酶抗降解物阻遏突變株的選 育》，菌物學(xué)報(bào)，1984年04期)染色體為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系=IOXbuffer (含 Mg2+) 2. O μ 1 ； dNTPs(10mmol/l)0. 4μ 1 ；xyllFA 和 xyllRC 各 1· 5μ 1 ;EF Taq 0. 1 μ 1 ；模 板 0.01 μ 1 ；用無菌水補(bǔ)充至 20 μ 1。反應(yīng)條件94°C 5min ；94°C 40sec ；51. 1 °C 30sec ； 72°C 18sec ；72°C IOmin ；30個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物經(jīng)PCR純化試劑盒純化后，連接到 PGEM-T Easy載體上，陽性轉(zhuǎn)化子送北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)序。然后使用SEFA-PCR 方法(Self-Formed Adaptor PCR，參考文獻(xiàn) Shiming Wang et al. (2007). Self-Formed Adaptor PCR -.a Simple and Efficient Method for Chromosome Walking. Appl Environ Microbiol, 73 (15) :5048_5051·)擴(kuò)增xyll 基因的 5‘端和 3'端， 過程如下按照SEFA-PCR引物設(shè)計(jì)的規(guī)則，利用上述得到的已知保守區(qū)序列的兩側(cè) 末端序列，分別設(shè)計(jì)引物對(duì)SP1、SP2、SP3，擴(kuò)增保守區(qū)的側(cè)翼序列。以斜臥青霉 (Penicilliumdecumbens) 114-2染色體為模板，按照下面的反應(yīng)體系和表1所示反應(yīng)條件 進(jìn)行PCR擴(kuò)增。表1SEFA-PCR擴(kuò)增條件 第一輪SEFA-PCR 反應(yīng)體系(20 μ 1) 10 X EF Taq buffer (含 Mg2+)或 IOXTrans Taq buffer (含 Mg2+) 2· 0 μ 1 ;dNTPs (10mmol/l) 0· 4 μ 1 ;SP3s、SP3a (lOnmol/μ 1)各 0. 35 μ 1 ；EF Taq或Trans Taq各0. 1 μ 1 ；模板1 μ 1 ；用無菌水補(bǔ)充至20 μ 1。在一個(gè)循環(huán)CN 101845400 A說明書4/8 頁
之后分別加入 1 U 1 (lOnmol/u 1) SPls 和 SPla。第二輪普通PCR 反應(yīng)體系(20iU) :10XEF Taq buffer(含 Mg2+)或 10XTrans Taq buffer (含 Mg2+) 2. 0 ii 1 ； dNTPs (10mmol/l) 0. 4 u 1 ；SP2s、SP2a (lOnmol/u 1)各 1 yl ; EF Taq或Trans Taq各0. 1 yl ；模板1 ii 1 ；用無菌水補(bǔ)充至20 yl。根據(jù)上述的得到的已知序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增xyllcDNA基因并進(jìn)行序列測(cè)定，經(jīng) RT-PCR擴(kuò)增后得到783bp的xyllcDNA產(chǎn)物，過程如下I.菌體的培養(yǎng)在50mL含有10%的麩皮汁基本培養(yǎng)基中，接種100ml斜臥青霉孢 子懸液，30°C 200rpm培養(yǎng)48h后，加入30mL的木聚糖溶液和CF11溶液，繼續(xù)培養(yǎng) 24h。 其中上述10%的麩皮汁基本培養(yǎng)基(w/v) 10%麩皮，煮沸30min，八層紗布過濾， 補(bǔ)足水分，自然PH值。II. RNA的提取RNA提取按百泰克的多糖多酚植物總RNA快速提取試劑盒(離心 柱型)說明書進(jìn)行。III. RT-PCR (1)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(使用Trans Taq聚合酶)。反應(yīng)體系(20ml) :2XES ReactionMix 10u 1 ；EasyScrip RT Enzyme Mix 1 u 1 ；Anchored Oligo(dT) 181u 1；RNA liil。用無 Rnase 水補(bǔ)充至 20iil。反應(yīng)條件42°C 50min ;75°C 15min ; (2) PCR 反應(yīng)。PCR 反應(yīng)體系(20 ill) :10Xpfu buffer (含 Mg2+)2. Oil 1 ;dNTPs(10mmol/L)0. 4ii 1 ;xyllcs、 xyl lea (lOnmol/ill)各 1 yl ；pfu (5U/u L) 0. lu 1 ； cDNA 模板 1 yl ；用無菌水補(bǔ)充至 20ii 1。PCR 反應(yīng)條件:94°C 5min ；94°C 30sec ；55. 3°C 40sec ；72°C 2min ；72°C lOmin ；33 個(gè) 循環(huán)。凝膠回收擴(kuò)增的xyllcDNA基因片段，連接克隆載體pMD18-T，送濟(jì)南力戈有限公司進(jìn) 行序列測(cè)定。將上述擴(kuò)增得到的基因命名木聚糖酶I基因(xyll) (NCBI GenBank序列提交號(hào)為 GU338006)。上述所需引物如下xyllFA :ggctactactactcstwctgga(s = c or g，w = a or t)xyllRC gaccagtaytggknraargt(y = c or t，k = g or t，n = a、c、g or t, r = a or g)SP3s :agcacactcaggtgaaccnnnnnnnnatctccSP3a :gttgttccagttcacactnnnnnnnncagcagSPls :aatgcttacctgggtgtctacggttggaSPla :gcgagaggagggggttttcatggacSP2s :agcacaagggcaccgtctacagcgaSP2a :ggagtctcgagtcatcacttaccgagcaxyllcs :tcaagatcaacatggtttctttcxyllca :cagcatgtgtcattctccgag實(shí)施例2.重組質(zhì)粒pXXT-hph的構(gòu)建及驗(yàn)證構(gòu)建含有潮霉素抗性基因(hph)表達(dá)盒和斜臥青霉(Penicillium decumbens) xyllcDNA基因表達(dá)盒的載體pXXT-hph。其中，hph表達(dá)盒來自pSilent_l質(zhì)粒
6(Nakayashiki H,et al. (2005). RNA silencing as a tool for exploring gene function in ascomycete fungi. Fungal GenetBiol. 42 (4) :275_83)，斜臣卜青霉(Penicillium decumbens) xyllcDNA受到在瑞氏木霉QM9414xyn2啟動(dòng)子和TtrpC調(diào)控，該載體的具體構(gòu)建 過程(圖1)如下根據(jù)瑞氏木霉QM9414xyn2啟動(dòng)子區(qū)的GenBank序列號(hào)(AY263380. 1)設(shè)計(jì)引物 xyn2ps 和 xyn2pa，以 T. reesei QM9414 的染色體 DNA 為模板，pfu DNA 聚合酶擴(kuò)增 1081bp 的啟動(dòng)子區(qū)。PCR 反應(yīng)程序-MV 5min ；94°C 30sec ；60°C 40sec ；72°C 2min ；72°C IOmin ；30 個(gè)循環(huán)。用EcoRI和BamHI雙酶切啟動(dòng)子片段并進(jìn)行凝膠回收。用EcoRI和SalI雙酶切 PGT(王曉東，抗真菌蛋白和幾丁質(zhì)酶基因克隆與表達(dá)研究，山東大學(xué)碩士畢業(yè)論文，2006) 質(zhì)粒，凝膠膠回收3470bp帶有TtrpC的骨架片段。用BamHI和SalI雙酶切pMD18_T-Xyll 質(zhì)粒，凝膠膠回收約800bp xyllcDNA片段。將回收的3個(gè)片段用T4DNA連接酶進(jìn)行連接， 構(gòu)建了表達(dá)載體PXXT。在ρΧΧΤ的基礎(chǔ)上，平端插入來自pSilent-Ι質(zhì)粒的潮霉素表達(dá)盒 PtrpC-hph-TtrpC，構(gòu)建了以潮霉素抗性為選擇標(biāo)記的載體pXXT_hph。
然后對(duì)pXXT-hph載體的進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果電泳結(jié)果見圖2，結(jié)果與預(yù)期相符，證 明該載體構(gòu)建成功。具體驗(yàn)證過程如下以ρΧΧΤ質(zhì)粒DNA為模板，xyn2ps和xyn2pa為引物擴(kuò)增驗(yàn)證啟動(dòng)子片段的存在， 反應(yīng)程序同前。以xyllcs和xyllca為引物擴(kuò)增驗(yàn)證xyll基因片段的存在，反應(yīng)同實(shí)施 例1。用特異性的引物hphl和hph2進(jìn)行PCR反應(yīng)(PCR反應(yīng)程序:94°C 5min ；94°C 30sec ； 55°C 40sec ；72°C 30sec ；72°C IOmin ；30個(gè)循環(huán))，驗(yàn)證hph基因是否連接到ρΧΧΤ載體上。上述所需引物如下xyn2ps :ggaattcatcggagtcgacactcgcatc (EcoRI)xyn2pa :cgggatccgttgatgtcttcttgcttcagctag(BamHI)hphl :aagttcgacagcgtctcchph2 :ttccactatcggcgagta實(shí)施例3. pXXT-hph載體轉(zhuǎn)斜臥青霉(Penicillium decumbens)轉(zhuǎn)化子的構(gòu)建及 分子驗(yàn)證將10μ g pXXT-hph 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化斜臥青霉(Penicillium decumbens) JU-A10 (JU-A10 菌株構(gòu)建參照 Qu Y, Zhao X，GaO P. Appl Biochem Biotechnol，1991，28/29 :363_368)， 轉(zhuǎn)化過程采用常規(guī)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法，方法參照Taina Karhunen, et al. (1993). High frequency one-stepgene replacement in Trichoderma reesei.I.Endoglucanase I overproduction. Mol Gen Genet，241 :515_522.介紹。在含有潮霉素抗性選擇培養(yǎng) 基上對(duì)轉(zhuǎn)化子經(jīng)初篩、復(fù)篩及單孢分離，最終從中得到獲得8株穩(wěn)定遺傳的斜臥青霉 (Penicillium decumbens)X系列轉(zhuǎn)化子。經(jīng)PCR(結(jié)果見圖3)和Southern驗(yàn)證(結(jié)果見 圖4)，證明上述轉(zhuǎn)化子均成功插入pXXT-hph質(zhì)粒。上述原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的具體方法如下原生質(zhì)體的制備①在PDA培養(yǎng)基平板上放置一張玻璃紙，其上涂布斜臥青霉(Penicillium decumbens) JU-AlO 孢子懸液，30°C培養(yǎng) 20hr。②將平板中玻璃紙上的菌絲轉(zhuǎn)移，懸浮于1. 2mol/L山梨醇-lOmmol/L磷酸鉀溶液(ρΗ5· 6，含 5mg/ml-10mg/ml Lysing Enzymes)中，30°C溫浴 1. 5 2hr。在此過程中不時(shí)鏡 檢，觀察原生質(zhì)體的生成情況。③通過G3燒結(jié)漏斗過濾，將原生質(zhì)體與未被消化的菌絲體分離開，并用1.2mol/L 山梨醇-10mmol/L Tris · HCl (pH 7. 5)洗滌 2 次。④4000rpm離心15min，棄上清，收集原生質(zhì)體，并用lmol/L山梨醇-IOmmol/ L Tris · HCl (pH 7. 5)洗滌 2 次。最后重懸于 lmol/L 山梨醇-10mmol/L CaCI2-IOmmo 1/L Tris ‘ HCKpH 7.5)中，使原生質(zhì)體濃度為 5 X 106_5 X 107/ml。原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化 將純化后的質(zhì)粒pXXT-hph 10 μ g 與斜臥青霉(Penicillium decumbens) JU-A10 原生質(zhì)體(100 μ 1)混合，力口入 50 μ 1 25 % PEG6000_50mmol/L CaCl2-IOmmol/ L Tris ‘ HCKpH 7. 5)，冰浴 20min，后加入 Iml 60% PEG4000-50mmol/L CaCI2-IOmmo 1/L Tris · HCl (pH 7. 5)(加入體積為原生質(zhì)的10倍)，室溫放置5min。最后加入2ml lmol/L 山梨醇-10mmol/LCaCl2-10mmol/L Tris · HCl (pH 7. 5)，混勻。再生和選擇將適量(100 μ 1 200 μ 1)上述轉(zhuǎn)化液涂布于轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)化培養(yǎng) 基為含有濃度150 μ g/ml的潮霉素B的山梨醇基本培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)3 4d，挑選在轉(zhuǎn)化培 養(yǎng)基上生長較快菌落較大的轉(zhuǎn)化子。同時(shí)對(duì)于沒有加入目的質(zhì)粒的原生質(zhì)體按同樣的方法 進(jìn)行，按相同的量涂布在相同的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基上作為原生質(zhì)體再生情況檢測(cè)以及陰性對(duì)照。以上轉(zhuǎn)化基本培養(yǎng)基(即選擇培養(yǎng)基)山梨醇lmol/L，(NH4) 2S045g/L, KH2P0415g/ L, MgSO4O. 6g/L, CaCl2O. 6g/L, FeSO4 · 7H20 0. 005g/L, MnSO4 · H2O 0. 0016g/L, ZnSO4 · 7H20 0. 0014g/L, CoCl2O. 002g/L, 150 μ g/ml 的潮霉素 B(pH 5. 5)。將選擇平板上長出的轉(zhuǎn)化子進(jìn)一步挑取到轉(zhuǎn)化基本培養(yǎng)基平板上進(jìn)行復(fù)篩，將復(fù) 篩培養(yǎng)基上挑選到的轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基斜面，30°C培養(yǎng)3 5d左右，洗孢子，進(jìn)行分 單孢，依次傳代5次使轉(zhuǎn)化子性狀得到穩(wěn)定。之后收集孢子并加入80%甘油等體積混合保藏。提取上述轉(zhuǎn)化子即X系列斜臥青霉轉(zhuǎn)化子和出發(fā)菌株的染色體，以xyn2pS和 xyn2pa為引物擴(kuò)增驗(yàn)證啟動(dòng)子區(qū)整合到出發(fā)菌株的染色體上。再以xyn2pS和xyllca為 引物對(duì)擴(kuò)增啟動(dòng)子和xyll基因片段。反應(yīng)程序分別為94°C 5min ；94°C 30sec ；59°C或 55°C 40sec ；72°C 35sec 或 Imin ；72°C IOmin ；30 個(gè)循環(huán)。Southern blot分析轉(zhuǎn)化子xyll拷貝數(shù)，具體過程如下xyll探針的制備以xylls和xylla為引物，pMD18-T-xyll為模板進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，得到的基因片段經(jīng)過凝膠回收試劑盒純化標(biāo)記后作為探針(詳見說明書)。PCR反應(yīng) 程序?yàn)?4°C 5min ；94°C 40sec，59°C 40sec，72°C 30sec，30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0 擴(kuò)增片段 900bpo將X系列斜臥青霉轉(zhuǎn)化子及出發(fā)菌株染色體用限制性內(nèi)切酶HindIII酶切后電 泳，然后按照DIG High Primer DNA Labeling and Detection Starter KitI (Roche)說明 書進(jìn)行Southern blot雜交。實(shí)施例4.工程菌斜臥青霉(Penicillium decumbens) X8CCTCC M 2010110 搖瓶發(fā) 酵及木聚糖酶活力測(cè)定將X系列斜臥青霉轉(zhuǎn)化子和出發(fā)菌株的孢子懸液分別接種到70ml (300ml的三角瓶)葡萄糖基本培養(yǎng)基中，30°C IOOrpm(往復(fù)式搖床)培養(yǎng)36h后，對(duì)菌絲進(jìn)行抽濾，每株取 Ig菌絲分別轉(zhuǎn)接到150ml (500ml的三角瓶)發(fā)酵培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，每隔24h取發(fā)酵液，離 心測(cè)定酶活。通過對(duì)轉(zhuǎn)化子木聚糖酶活力的測(cè)定發(fā)現(xiàn)其中一株轉(zhuǎn)化子X8的酶活力可以達(dá) 到219. 82IU/ml，是出發(fā)菌株(140. 00IU/ml)的1. 57倍，將其命名為斜臥青霉(Penicillium deCUmbens)X8，并于2010年5月7日將其保藏于“中國典型培養(yǎng)物保藏中心”，保藏號(hào)為 CCTCC M 2010110。上述工程菌的特征菌落形態(tài)小而均勻，質(zhì)地緊密，呈毛氈狀；菌落與培養(yǎng)基間的 連接緊密，不易挑取；在麩皮培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，菌絲體為初期白色，呈不擴(kuò)散式蔓延，培養(yǎng) 4天左右，菌絲體表面出現(xiàn)淡粉色孢子，繼續(xù)培養(yǎng)，孢子顏色逐漸加深為粉色，深紅色(圖7)木聚糖酶活力測(cè)定方法如下
在Iml用0. 2M pH4. 8的HAC-NaAC緩沖液配制的1 %的燕麥木聚糖懸浮液中，添 加0. 5ml適當(dāng)稀釋酶液，50°C反應(yīng)30min，加1. 5ml DNS試劑終止反應(yīng)，煮沸5min，冷卻測(cè)定 0D540nm來計(jì)算還原糖的生成量(以木糖為標(biāo)準(zhǔn))。同時(shí)以未加燕麥木聚糖的醋酸Buffer 為空白對(duì)照。酶活的定義在50°C、pH4. 8條件下，將每分鐘產(chǎn)生1 μ mol木糖所需的酶量定為一 個(gè)酶活力單位。其中上述木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備準(zhǔn)確稱取IOOmg分析純的無水木糖(預(yù)先在 105°C干燥至恒重)，用少量蒸餾水溶解后，定量轉(zhuǎn)移到IOOml容量瓶中，再定容到刻度，搖 勻。濃度為lmg/ml。分別取上述溶液0，0. 2,0. 4,0. 6,0. 8，1. 0，1. 2，1. 5ml于干燥的帶刻度 試管中，補(bǔ)加蒸餾水至1. 5ml。加入DNS試劑1. 5ml，煮沸10分鐘后，冷卻，定容到25ml搖 勻，在波長540nm處測(cè)定OD值。OD值的測(cè)定采用美國產(chǎn)型號(hào)為SPECTRAMAX190的“微板光 譜儀”。以木糖濃度(mg/ml)為橫坐標(biāo)，OD540為縱坐標(biāo)作圖即為木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖5)。上述酶活力測(cè)定所需試劑如下醋酸-醋酸鈉緩沖液甲液(0. 2mol/L的NaAC溶液)，稱取27. 22g NaAC ·3Η20在 200ml燒杯中，然后蒸餾水溶解定容至IL ；乙液(0. 2mol/l的HAC溶液)，移液管量取11. 8ml 冰乙酸(99.0%)，定容至1000ml ；待用時(shí)，甲乙溶液按比例混合(甲液乙液=590 410， pH 4. 8)。DNS (3，5 二硝基水楊酸)的配制①NaOH 104g溶于1300ml蒸餾水中；②3，5_ 二 硝基水楊酸30g加入①中混勻，加熱溶解；③酒石酸鉀鈉910g溶于2500ml蒸餾水中；④25g 重蒸酚，加25g無水亞硫酸鈉，加入③中；將以上各步驟的溶液混合，加入1200ml蒸餾水 (總體積5000ml)，放在棕色瓶中，暗處放置一周后即可使用。燕麥木聚糖溶液稱Ig燕麥木聚糖于IOOml燒杯中，加入適量0. 2M pH4. 8的 HAC-NaAC緩沖液，在磁力攪拌器上加熱溶解，然后轉(zhuǎn)移到IOOml容量瓶定容，4°C冰箱保存。實(shí)施例5.工程菌斜臥青霉(Penicillium decumbens) X8CCTCC M 2010110 在生產(chǎn) 木聚糖酶中的應(yīng)用。將斜臥青霉(Penicilliumdecumbens)Gi31_2CCTCC M 2010110 接種到裝有 50ml 葡萄糖基本培養(yǎng)基的300ml三角瓶中，28°C，在SOrpm往復(fù)式搖床上培養(yǎng)24h，得發(fā)酵種子 液將得到的種子液先抽濾收集濕菌絲，再按Ig 150ml的比例將濕菌絲接種到發(fā)酵培養(yǎng) 基中，繼續(xù)培養(yǎng)100，然后以6000rpm，4°C離心lOmin，收集的上清液即為木聚糖酶的酶液。
其中，上述葡萄糖基本培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖20，(NH4)2SO4 5，KH2P0415, MgSO4O.6， CaCl2O. 6，F(xiàn)eSO4 · 7H20 0. 005，MnSO4 · H2O 0. 0016，ZnSO4 · 7H20 0. 0014，CoCl2O. 002，ρΗ5· 5。發(fā)酵培養(yǎng)基(w/v) =Mandels鹽溶液，2%木糖渣，的微晶纖維素，5%的麩皮汁。實(shí)施例6.工程菌株斜臥青霉(Penicillium decumbens) X8CCTCC M 2010110 在生
產(chǎn)木聚糖酶中的應(yīng)用。將斜臥青霉(Penicilliumdecumbens)Gi31_2CCTCC M 2010110 接種到裝有 70ml 葡萄糖基本培養(yǎng)基的300ml三角瓶中，30°C，在90rpm往復(fù)式搖床上培養(yǎng)36h，得發(fā)酵種子 液；將得到的種子液先抽濾收集濕菌絲，再按Ig 150ml的比例將濕菌絲接種到發(fā)酵培養(yǎng) 基中，繼續(xù)培養(yǎng)108h，然后以8000rpm，4°C離心15min，收集的上清液即為木聚糖酶的酶液。其中，上述葡萄糖基本培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖20，(NH4)2S045, KH2PO415, MgSO4O. 6, CaCl2O. 6，F(xiàn)eSO4 · 7H20 0. 005，MnSO4 · H2O 0. 0016，ZnSO4 · 7H20 0. 0014，CoCl2O. 002，ρΗ5· 5。發(fā)酵培養(yǎng)基(w/v) =Mandels鹽溶液，2%木糖渣，的微晶纖維素，5%的麩皮汁。實(shí)施例7.工程菌株斜臥青霉(Penicillium decumbens) X8CCTCC M 2010110 在生 產(chǎn)木聚糖酶中的應(yīng)用。將斜臥青霉(Penicilliumdecumbens)Gi31_2CCTCC M 2010110 接種到裝有 90ml 葡萄糖基本培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，30°C，在IOOrpm往復(fù)式搖床上培養(yǎng)48h，得發(fā)酵種子 液；將得到的種子液先抽濾收集濕菌絲，再按Ig 150ml的比例將濕菌絲接種到發(fā)酵培養(yǎng) 基中，繼續(xù)培養(yǎng)116h，然后以8000rpm，4°C離心15min，收集的上清液即為木聚糖酶的酶液。其中，上述葡萄糖基本培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖20，(NH4)2S045, KH2PO415, MgSO4O. 6, CaCl2O. 6，F(xiàn)eSO4 · 7H20 0. 005，MnSO4 · H2O 0. 0016，ZnSO4 · 7H20 0. 0014，CoCl2O. 002，ρΗ5· 5。發(fā)酵培養(yǎng)基(w/v) =Mandels鹽溶液，2%木糖渣，的微晶纖維素，5%的麩皮汁。
權(quán)利要求
一株過表達(dá)木聚糖酶的斜臥青霉工程菌，其特征在于所述菌含有來自斜臥青霉的木聚糖酶I(xyl1)cDNA基因的過表達(dá)載體pXXT，其菌命名為斜臥青霉(Penicilliumdecumbens)X8，并于2010月5日7日保藏于“中國典型培養(yǎng)物保藏中心”，保藏號(hào)為CCTCCM 2010110。
2.本發(fā)明所述斜臥青霉工程菌在生產(chǎn)木聚糖酶酶液中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征是所述斜臥青霉工程菌生產(chǎn)木聚糖酶酶液的形 式是以液體發(fā)酵方法實(shí)施；其中所述發(fā)酵方法是將斜臥青霉(Penicillium decumbens) Gi31-2CCTCC M 2010110接種到裝有50_90ml葡萄糖基本培養(yǎng)基的300_500ml三角瓶中， 28-30°C，在80-100rpm往復(fù)式搖床上培養(yǎng)24_48h，得發(fā)酵種子液；將得到的種子液先抽濾 收集濕菌絲，再按lg 150ml的比例將濕菌絲接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)100-116h，然 后以6000-8000rpm，4°C離心10-15min，收集的上清液即為木聚糖酶的酶液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株過表達(dá)木聚糖酶的斜臥青霉工程菌，含有過表達(dá)的斜臥青霉木聚糖酶I基因，該菌命名為斜臥青霉(Penicillium decumbens)X8，并已于2010月5月7日保藏于“中國典型培養(yǎng)物保藏中心”，保藏號(hào)為CCTCC M 2010110。本發(fā)明還公開了所述菌株在生產(chǎn)木聚糖酶中的應(yīng)用。本發(fā)明所述工程菌株的木聚糖酶活力最高可達(dá)219.82IU/ml，是原始宿主菌株的1.57倍，預(yù)示該菌株在木聚糖酶生產(chǎn)中有廣泛應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N1/15GK101845400SQ20101017053
公開日2010年9月29日 申請(qǐng)日期2010年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月13日
發(fā)明者張紀(jì)偉, 李忠海, 杜春梅, 汪天虹, 鐘耀華 申請(qǐng)人:山東大學(xué)