專利名稱：：一株過表達(dá)β-葡萄糖苷酶的斜臥青霉工程菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于微生物工程領(lǐng)域；具體地說，本發(fā)明涉及一株過表達(dá)β-葡萄糖苷酶的斜臥青霉工程菌，及其在生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶及降解纖維素中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：β_葡萄糖苷酶(β-glucosidase，Ε.C.3.2.1.21),又名纖維二糖酶(cellobiase)，是纖維素降解過程中的重要酶組分。β-葡萄糖苷酶對于纖維素糖化水解具有關(guān)鍵性作用，它能夠降解纖維二糖，解除纖維二糖過量積累對纖維二糖水解酶和內(nèi)切葡聚糖酶產(chǎn)生的反饋抑制作用，提高整個纖維素酶系降解纖維素底物的效率。但對產(chǎn)纖維素酶絲狀真菌的纖維素酶系組分分析表明，葡萄糖苷酶在纖維素酶系中所占比例很低，這種低的葡萄糖苷酶含量使其成為真菌纖維素酶系降解纖維素成為單糖的限速步驟(MarkkuSaloheimo,JuhaKuja-Panula,Ylosmaki,MichaelWard,andMerjaPenttila(2002).EnzymaticPropertiesandIntracelIularLocalizationoftheNovelTrichodermareeseiβ-GlucosidaseBGLII(CellA).AppliedandEnvironmentalMicrobiology,68(9):4546_4553)。除被應(yīng)用于生物質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，由于具有轉(zhuǎn)糖基作用，葡萄糖苷酶還被廣泛的應(yīng)用于食品和制藥行業(yè)。例如，葡萄糖苷酶在酒的香味增強(qiáng)上起到很重要的作用，并被應(yīng)用于葡萄酒香味提升(C.Lasanta,I.Caro,L.Perez(2009).β-glucosidaseimmobilizationonionexchangeresinsforusingasaromaticenhancementofwines.ChemicalEngineeringTransactions,Vol.17897~902)；對于心臟病禾口癌癥有治療作用的異黃酮可以由β-葡萄糖苷酶催化異黃酮苷產(chǎn)生(ChimzhiZhang,HongshanYu,MingchunLu,JingLiandFengxieJin(2005).EnzymicsynthesisofsalidrosidePurificationandcharacterizationofsalidrosidasefromAspergillasniger.ProcessBiochemistry,40(9):3143_3147)。斜臥青霉(Penicilliumdecumbens)具有較強(qiáng)的纖維素酶生產(chǎn)能力，但是現(xiàn)有的生產(chǎn)方法中其葡萄糖苷酶產(chǎn)量并不能滿足需求，且其纖維素酶系中的較低的葡萄糖苷酶含量仍是限制斜臥青霉(Penicilliumdecumbens)降解纖維素的關(guān)鍵因素。有目的的通過過表達(dá)β-葡萄糖苷酶構(gòu)建工程菌有望克服上述的缺陷，然而，檢索結(jié)果還未見有相關(guān)工作的報道。
發(fā)明內(nèi)容針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明要解決的問題是提供一株能夠高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的斜臥青霉工程菌及其在產(chǎn)β“葡萄糖苷酶和降解纖維素中的應(yīng)用。本發(fā)明所述過表達(dá)葡萄糖苷酶的斜臥青霉工程菌，其特征在于所述菌株含有瑞氏木霉的β-葡萄糖苷酶I(bgll)cDNA基因，其命名為斜臥青霉(PenicilliumdeCUmbens)Gi31-2，已于2010月5日7日保藏于“中國典型培養(yǎng)物保藏中心”，保藏號為CCTCCM2010111。上述斜臥青霉工程菌的特征為含有瑞氏木霉bgllcDNA基因過表達(dá)載體pTBG-1，該工程菌株的0-葡萄糖苷酶活力最高達(dá)到3.47IU/ml，是出發(fā)菌株(1.20IU/ml)的2.90倍(見圖5)；最高濾紙酶活為3.32IU/ml，是出發(fā)菌株(2.71IU/ml)的1.23倍(見圖7)。其菌落形態(tài)小而均勻，質(zhì)地緊密，呈毛氈狀；菌落與培養(yǎng)基間的連接緊密，不易挑?。辉邴熎づ囵B(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，菌絲體為初期白色，呈不擴(kuò)散式蔓延，培養(yǎng)4天左右，菌絲體表面出現(xiàn)淡粉色孢子，繼續(xù)培養(yǎng)，孢子顏色逐漸加深為粉色，深紅色(圖8)。上述斜臥青霉工程菌的構(gòu)建方法參照常規(guī)的絲狀真菌基因轉(zhuǎn)化方法，將含有瑞氏木霉bgllcDNA基因的過表達(dá)載體pTBG-1(圖1)與抗硫胺素基因表達(dá)盒ptrA共轉(zhuǎn)化斜臥青霉(PeniciIliumdecumbens)JU-A10原生質(zhì)體，在含1yg/ml抗硫胺素的選擇培養(yǎng)基上篩選得到轉(zhuǎn)化子。提取轉(zhuǎn)化子染色體DNA，經(jīng)過PCR和southern驗證得到轉(zhuǎn)化子Gi24_2，Gi31-2,Gi53-2，Gi54_2，Gi55_l，Gi72_3，Gi78_2，驗證轉(zhuǎn)化子結(jié)果見圖2和圖3。對以上斜臥青霉轉(zhuǎn)化子進(jìn)行液體發(fā)酵并對其葡萄糖苷酶活力進(jìn)行測定，其中Gi31-2的葡萄糖苷酶活力最高，可以達(dá)到3.47IU/ml，是出發(fā)菌株(1.20IU/ml)的2.90倍(見圖5)，其最高濾紙酶活為3.32IU/ml，是出發(fā)菌株(2.71IU/ml)的1.23倍，該菌株即為目標(biāo)工程菌株，將其命名為斜臥青霉(Penicilliumdecumbens)Gi31_2。上述斜臥青霉工程菌在生產(chǎn)0-葡萄糖苷酶酶液中的應(yīng)用。其中所述斜臥青霉工程菌生產(chǎn)葡萄糖苷酶酶液的形式是以液體發(fā)酵方法實施；其中所述發(fā)酵方法是將斜臥青霉(Penicilliumdecumbens)Gi31_2CCTCCM2010111接種到裝有50-90ml葡萄糖基本培養(yǎng)基的300_500ml三角瓶中，28_30°C，在80-100rpm往復(fù)式搖床上培養(yǎng)24-48h，得發(fā)酵種子液；將得到的種子液先抽濾收集濕菌絲，再按lg150ml的比例將濕菌絲接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)100-116h，然后以6000-8000rpm，4°C離心10-15min，收集的上清液即為0-葡萄糖苷酶酶的酶液。其中，上述葡萄糖基本培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖20，(NH4)2S045,KH2P0415,MgS040.6，CaCl20.6，F(xiàn)eS047H200.005，MnS04H200.0016，ZnS047H200.0014，CoCl20.002，pH5.5。發(fā)酵培養(yǎng)基(w/v):MandelS鹽溶液，2%木糖渣，的微晶纖維素，5%的麩皮汁。本發(fā)明所述斜臥青霉工程菌所生產(chǎn)的纖維素酶酶液在降解天然纖維素底物麥秸粉中的應(yīng)用，其中包括酶液制備和麥秸粉降解。酶液制備將斜臥青霉(Penicilliumdecumbens)Gi31_2CCTCCM2010111接種到裝有70ml葡萄糖基本培養(yǎng)基的300ml三角瓶中，30°C往復(fù)式搖床上90rpm培養(yǎng)36h后，得發(fā)酵種子液；將得到的種子液先進(jìn)行抽濾收集濕菌絲，再將lg抽濾得到的種子菌絲接種到150ml發(fā)酵培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)108h，然后以6000rpm，4°C離心15min，收集上清即為所需的含有纖維素酶的酶液。麥秸粉降解以每克麥秸粉加入5ml上述纖維素酶酶液的比例將酶液與底物混合，于pH5.0，溫度50°C，轉(zhuǎn)速200-300rpm條件下降解48_56h。本發(fā)明首次采用過表達(dá)瑞氏木霉的0_葡萄糖苷酶I(bgl1)cDNA基因的策略得到工程菌斜臥青霉(Penicilliumdecumbens)Gi31_2CCTCCM2010111，其具有很高的葡萄糖苷酶活力，液體發(fā)酵情況下0-葡萄糖苷酶活力最高可以達(dá)到3.47IU/ml，是出發(fā)菌株的2.90倍。該菌株的最高濾紙酶活為3.32IU/ml，是出發(fā)菌株斜臥青霉(Penicilliumdecumbens)JU-A10(2.71IU/ml)1.23倍，對纖維素的降解能力也有較高提高。預(yù)示該工程菌在生產(chǎn)3-葡萄糖苷酶和降解纖維素中有著非常廣泛的應(yīng)用。圖1.pTBG-1載體的構(gòu)建過程。圖2.PCR擴(kuò)增Gi系列斜臥青霉轉(zhuǎn)化子中bgll基因電泳結(jié)果。其中:M,DL2000；1，陽性對照pTBG-1；2，Gi24_2；3，Gi31-2；4，Gi53-2；5，Gi54-2；6，Gi55-1；7，Gi72_3；8，Gi78_2；CK,出發(fā)菌株。圖3.Gi系列斜臥青霉轉(zhuǎn)化子與1.69kbbgll探針的Southern雜交結(jié)果。其中:M,lkbLadder；CK,出發(fā)菌株；1，Gi24_2；2，Gi31_2；3，Gi53_2；4，Gi54_2；5，Gi55-1；6，Gi72-3；7，Gi78_l；8，陽性對照(pTBG-1/XhoI)。圖4.對硝基酚(pNP)標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖5.斜臥青霉(Penicilliumdecumbens)Gi31_2CCTCCM2010111和出發(fā)菌株的3-葡萄糖苷酶酶活酶活測定結(jié)果。其中▲，斜臥青霉(Penicilliumdecumbens)Gi31_2CCTCCM2010111；，出發(fā)菌株。圖6.葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖7.斜臥青霉(Penicilliumdecumbens)Gi31_2CCTCCM2010111和出發(fā)菌株的濾紙酶活測定結(jié)果。其中▲，斜臥青霉(Penicilliumdecumbens)Gi31_2CCTCCM2010111；，出發(fā)菌株。圖8.斜臥青霉(Penicilliumdecumbens)Gi31_2CCTCCM2010111菌落形態(tài)。具體實施例方式實施例1.葡萄糖苷酶過表達(dá)載體pTBG-1轉(zhuǎn)化斜臥青霉(Penicilliumdecumbens)JU-A10首先采用Double-jointPCR(DJ-PCR)技術(shù)(Jae-HyukYuetal.(2004).Double-jointPCR:aPCR—basedmoleculartoolforgenemanipulationsinfilamentousfungi.FungalGeneticsandBiology.41973-981)克隆瑞氏木霉的bgllcDNA基因(GenBank序列U09580.1)。分別以B1S/B1A、B2S/B2A和B3S/B3A為引物對，抽提的瑞氏木霉QM9414(ATCC26921)染色體DNA為模板，擴(kuò)增bgll基因的3個外顯子片段，凝膠回收89bp、1760bp和442bp的擴(kuò)增片段，再利用嵌合引物對3個回收片段進(jìn)行組裝。最后以B1S和B3A為引物，以自行組裝的PCR產(chǎn)物為模板，擴(kuò)增bgllcDNA。凝膠回收約2.3kb的PCR產(chǎn)物，將其連接到pMD18-T中，送上海生物工程有限公司進(jìn)行序列測定，序列測定結(jié)果顯示瑞氏木霉的bgllcDNA基因被成功克隆。上述引物對具體如下(其中下劃線表示相應(yīng)酶切位點)BIS:ccgctcgaggaaatgcgttaccgaacagc(Xhol)B1A:ctcagccgaggcccccgatgttgagtgactgtctgccctagcaaaB2S:ctcaacatcgggggcctcggB2A:acagtccatagccgaactcgB3S:cggtacgagttcggctatggactgtcttacaccaagttcaactacB3A:gctctagactacgctaccgacagagtgct(XbaI)然后用Xhol/Xbal雙酶切帶有bgllcDNA的載體pMD18-T_bgll，將得到的bgllcDNA基因片段和經(jīng)過同樣酶處理載體pTHP進(jìn)行連接，構(gòu)建誘導(dǎo)型表達(dá)載體pTBG-Ι(載體構(gòu)建過程如圖1)。其中上述含4拷貝cbhl啟動子的載體pTHP的構(gòu)建方法參照LiuTiWangT，LiX，LiuX.(2008).ImprovedheterologousgeneexpressioninTrichodermareeseibycbhlpromoteroptimization.ActaBiochimBiophysSin.40(2)，158-165介紹。上述強(qiáng)cbhl啟動子為在cbhl啟動子基礎(chǔ)上構(gòu)建的4拷貝(每拷貝序列長200bp，含有CCAAT盒、轉(zhuǎn)錄激活因子Ace2結(jié)合位點、XlnR結(jié)合位點)人工啟動子。將純化的質(zhì)粒pTBG-Ι和ptrA表達(dá)盒各5μg(lμg/μ1)混合后共轉(zhuǎn)化斜臥青霉(Penicilliumdecumbens)JU-A10(QuY,ZhaoX,GaOP.ApplBiochemBiotechnol,1991，28/29=363-368)，轉(zhuǎn)化過程采用常規(guī)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法，方法參照TainaKarhunen,etal.(1993).Highfrequencyone-stepgenereplacementinTrichodermareesei.I.Endoglucanase!overproduction.MolGenGenet,241:515_522.介紹。其中上述含抗硫胺素標(biāo)記基因的ptrA表達(dá)盒由PCR擴(kuò)增得到。以pPTRII質(zhì)f立TakafumiKUB0DERA,etal.(2000).PyrithiamineResistanceGene(ptrA)ofAspergillusoryzae:Cloning,CharacterizationandApplicationasaDominantSelectableMarkerforTransformation.Biosci.Biotechnol.Biochem.,64(7)1416-1621為模板，Ptra-S和Ptra-A為引物，PCR擴(kuò)增得到長約2.2Kb的抗硫胺素標(biāo)記基因PtrA表達(dá)盒。PCR程序為95°C2min；95°C30s,55°C30s,72°Clmin30s，30個循環(huán)；72°C5min。上述所需引物如下Ptra-S,5_ccccaggctttacactttat_3；Ptra-A,5-ccgctcttgcatctttgtt_3。上述原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的具體方法如下原生質(zhì)體的制備①在PDA培養(yǎng)基平板上放置一張玻璃紙，其上涂布斜臥青霉(Penicilliumdecumbens)JU-AlO孢子懸液，30°C培養(yǎng)20hr。②將平板中玻璃紙上的菌絲轉(zhuǎn)移，懸浮于1.2mol/L山梨醇-lOmmol/L磷酸鉀溶液(ρΗ5·6，含5mg/ml-10mg/mlLysingEnzymes)中，30°C溫浴1.52hr。在此過程中不時鏡檢，觀察原生質(zhì)體的生成情況。③通過G3燒結(jié)漏斗過濾，將原生質(zhì)體與未被消化的菌絲體分離開，并用1.2mol/L山梨醇-10mmol/LTris·HCl(pH7.5)洗滌2次。④4000rpm離心15min，棄上清，收集原生質(zhì)體，并用lmol/L山梨醇-IOmmol/LTris·HCl(pH7.5)洗滌2次。最后重懸于lmol/L山梨醇-10mmol/LCaCI2-IOmmo1/LTris‘HCKpH7.5)中，使原生質(zhì)體濃度為5X106_5X107/ml。其中上述PDA培養(yǎng)基去皮土豆200g切成塊加水IOOOml煮20min后用紗布過濾取濾液，加20g葡萄糖至濾液中溶解后定容至1000ml。加1.5%瓊脂成固體培養(yǎng)基。pH為天然PH。原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化將純化后的質(zhì)粒pTBG-1和ptrA表達(dá)盒各5iig與斜臥青霉(PeniciIliumdecumbens)JU-A10原生質(zhì)體(100yl)混合，加入50ii125%PEG6000-50mmol/LCaCl2-10mmol/LTrisHC1(pH7.5)，冰浴20min,后加入lml60%PEG4000_50mmol/LCaCl2-10mmol/LTrisHC1(pH7.5)(加入體積為原生質(zhì)的10倍)，室溫放置5min。最后加入2mllmol/L山梨醇-10mmol/LCaCl2-10mmol/LTrisHC1(pH7.5)，混勻。再生和選擇將適量(100ill200ill)上述轉(zhuǎn)化液涂布于轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基為含有濃度IPg/ml的抗硫胺素的山梨醇基本培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)3-4d，挑選在轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基上生長較快菌落較大的轉(zhuǎn)化子。同時對于沒有加入目的質(zhì)粒的原生質(zhì)體按同樣的方法進(jìn)行，按相同的量涂布在相同的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基上作為原生質(zhì)體再生情況檢測以及陰性對照。以上轉(zhuǎn)化基本培養(yǎng)基山梨醇lmol/L，(NH4)2S045g/L，KH2P0415g/L，MgS040.6g/L,CaCl20.6g/L,FeS047H200.005g/L,MnS04H200.0016g/L,ZnS047H200.0014g/L,CoCl20.002g/L，1ug/ml的抗硫胺素(pH5.5)。將選擇平板上長出的轉(zhuǎn)化子進(jìn)一步挑取到轉(zhuǎn)化基本培養(yǎng)基平板上進(jìn)行復(fù)篩，將復(fù)篩培養(yǎng)基上挑選到的轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基斜面，30°C培養(yǎng)3-5d左右，洗孢子，進(jìn)行分單孢，依次傳代5次使轉(zhuǎn)化子性狀得到穩(wěn)定。之后收集孢子并加入80%甘油等體積混合保藏。經(jīng)初篩、復(fù)篩及單孢分離，最終從初篩的62株轉(zhuǎn)化子中得到7株穩(wěn)定遺傳的斜臥青霉pTBG-1轉(zhuǎn)化子Gi24-2、Gi31-2、Gi53-2、Gi54-2、Gi55-l、Gi72-3、Gi78-2。實施例2.PCR驗證斜臥青霉pTBG-1轉(zhuǎn)化子以抽提的轉(zhuǎn)化子染色體DNA為模板，B1S/B3A為引物對(祥見實施例1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(20ill):10XEFTaqbuffer2.0u1；dNTPmix(lOmmol/L)0.4u1；BIS和B3A(10nmol/ml)各1yl；EF_Taq(2.5U/u1)0.lu1；模板1ii1；用無菌水補(bǔ)足體積至20ii1。PCR循環(huán)程序如下94°C5min；94°C30sec,56.3°C30sec,72°C70sec，30個循環(huán)；72°ClOmin。經(jīng)上述對斜臥青霉轉(zhuǎn)化子(Gi24-2、Gi31-2、Gi53_2、Gi54_2、Gi55_l、Gi72_3、Gi78-2)的PCR驗證發(fā)現(xiàn)其均能擴(kuò)增到片段大小約2.3kb的bgllcDNA基因片段，與瑞氏木霉bgll的cDNA片段大小相符，而出發(fā)菌株沒有出現(xiàn)相應(yīng)的條帶，結(jié)果如圖2，說明瑞氏木霉bgll基因已整合到Gi系列斜臥青霉轉(zhuǎn)化子染色體基因組上。實施例3.Southernblot驗證斜臥青霉pTBG-1轉(zhuǎn)化子Southernblot分析轉(zhuǎn)化子bgll拷貝數(shù)。以B4S/B3A為引物對(其中，B3A參見實施例1，B4S為GAGCAACCCAGATGACCG)，瑞氏木霉染色體DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的基因片段經(jīng)過凝膠回收試劑盒純化標(biāo)記后作為探針(詳見DIGHighPrimerDNALabelingandDetectionStarterKitI,Roche的說明書)。PCR反應(yīng)程序為94°C5min；94°C30s,59°C30s，72°C53s，30個循環(huán)；72°ClOmin。擴(kuò)增片段1688bp。將出發(fā)菌株和Gi系列斜臥青霉轉(zhuǎn)化子分別接種到50ml基本培養(yǎng)基中，200rpm30°C培養(yǎng)2d，抽濾菌絲，大量提取染色體，將抽提的染色體用限制性內(nèi)切酶Xhol酶切過夜，30V電泳。按照DIGHighPrimerDNALabelingandDetectionStarterKitI(Roche)說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)化子的Southernblot分析。Southern分析結(jié)果見圖3。結(jié)果進(jìn)一步證明瑞氏木霉bgll基因已整合到Gi系列斜臥青霉轉(zhuǎn)化子染色體基因組上，由Southern分析結(jié)果還可以看出bgll基因以不同拷貝數(shù)整合到Gi系列斜臥青霉轉(zhuǎn)化子染色體基因組上。實施例4.工程菌斜臥青霉(Penicilliumdecumbens)Gi31_2CCTCCM2010111β-葡萄糖苷酶活力測定將Gi系列斜臥青霉轉(zhuǎn)化子和出發(fā)菌株的孢子懸液分別接種到70ml(300ml的三角瓶)葡萄糖基本培養(yǎng)基中，30°CIOOrpm(往復(fù)式搖床)培養(yǎng)36h后，對菌絲進(jìn)行抽濾，每株取Ig菌絲分別轉(zhuǎn)接到150ml(500ml的三角瓶)發(fā)酵培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，每隔24h取發(fā)酵液，離心測定酶活。將發(fā)酵液以6000r/min離心15min，取上清即為粗酶液。取100μ1適當(dāng)稀釋的粗酶液，加入50μ110mmol/L對硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)醋酸Buffer溶液(pH4.8)，混勻，50°C水浴30min后加入150μ110%Na2CO3終止反應(yīng)。405nm測OD值。同時以未加酶液的管為空白對照。酶活的定義在50°C、pH4.8條件下，每毫升酶液每分鐘產(chǎn)生對硝基酚(pNP)的微摩爾數(shù)。β-葡萄糖苷酶活力測定結(jié)果顯示其中Gi31_2的葡萄糖苷酶活力最高，可以達(dá)到3.47IU/ml，是出發(fā)菌株(1.20IU/ml)的2.90倍(見圖5)，將其命名為斜臥青霉(PeniCilliumdeCumbens)Gi31-2，并于2010月5日7日將其保藏于“中國典型培養(yǎng)物保藏中心”，保藏號為CCTCCM2010111。上述斜臥青霉工程菌的特征為菌落形態(tài)小而均勻，質(zhì)地緊密，呈毛氈狀；菌落與培養(yǎng)基間的連接緊密，不易挑?。辉邴熎づ囵B(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，菌絲體為初期白色，呈不擴(kuò)散式蔓延，培養(yǎng)4天左右，菌絲體表面出現(xiàn)淡粉色孢子，繼續(xù)培養(yǎng)，孢子顏色逐漸加深為粉色，深紅色(圖8)。其中，上述葡萄糖基本培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖20，(NH4)2S045,KH2PO415,MgSO4O.6,CaCl2O.6，F(xiàn)eSO4·7H200.005，MnSO4·H2O0.0016，ZnSO4·7H200.0014，CoCl2O.002，ρΗ5·5。發(fā)酵培養(yǎng)基(w/v)=Mandels鹽溶液，2%木糖渣，的微晶纖維素，5%的麩皮汁。上述酶活力測定所需試劑如下醋酸-醋酸鈉緩沖液甲液(0.2mol/L的NaAC溶液)稱取27.22gNaAC·3H20在200ml燒杯中，然后蒸餾水溶解定容至1L;乙液(0.2mol/l的HAC溶液)移液管量取11.8ml冰乙酸(99.0%)，定容至IOOOml；待用時，甲乙溶液按比例混合(甲液乙液=590410，pH4.8)。pNP:300ng/μ1的pNP(產(chǎn)物)標(biāo)準(zhǔn)溶液儲存液。使用時稀釋到60ng/μ1。對硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)將pNPG溶于0.2mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液中，配成10mmol/L反應(yīng)液。10%Na2CO3準(zhǔn)確稱量IOgNa2CO3,加入100ml的雙蒸水，充分溶解后混勻。DNS(3，5二硝基水楊酸)的配制①NaOH104g溶于1300ml蒸餾水中；②3，5_二硝基水楊酸30g加入①中混勻，加熱溶解；③酒石酸鉀鈉910g溶于2500ml蒸餾水中；④25g重蒸酚，加25g無水亞硫酸鈉，加入③中；將以上各步驟的溶液混合，加入1200ml蒸餾水(總體積5000ml)，放在棕色瓶中，暗處放置一周后即可使用。上述所需pNP標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作如下按表1所示取不同體積的對-硝基苯酚(60ng/yl)，用0.2M醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(pH4.8)稀釋成一系列濃度，加入10%的Na2C03中止反應(yīng)。用SPECTRAMAX190微板光譜儀在405nm測反應(yīng)液的光吸收值。以pNP濃度為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。表lpNP標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備根據(jù)上述所述過程及表1所示結(jié)果，以pNP濃度為橫坐標(biāo)，以0D4Q5光吸收值為縱坐標(biāo)作圖即為PNP標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖4。實施例5.工程菌斜臥青霉(Penicilliumdecumbens)Gi31_2CCTCCM2010111纖維素酶活力測定將斜臥青霉(Penicilliumdecumbens)Gi31_2CCTCCM2010111和出發(fā)菌株的孢子懸液分別接種到70ml(300ml的三角瓶)葡萄糖基本培養(yǎng)基中，30°ClOOrpm(往復(fù)式搖床)培養(yǎng)36h后，對菌絲進(jìn)行抽濾，每株取lg菌絲分別轉(zhuǎn)接到150ml(500ml的三角瓶)發(fā)酵培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，每隔24h取發(fā)酵液，將發(fā)酵液以6000r/min離心15min取上清做為粗酶液。其中，上述葡萄糖基本培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖20，(NH4)2S045,KH2P0415,MgS040.6,CaCl20.6，F(xiàn)eS047H200.005，MnS04H200.0016，ZnS047H200.0014，CoCl20.002，pH5.5。發(fā)酵培養(yǎng)基(w/v):MandelS鹽溶液，2%木糖渣，的微晶纖維素，5%的麩皮汁。將lX6cm(50+lmg)濾紙折疊放入試管底部，加入lmlpH4.8的醋酸緩沖液和0.5ml適當(dāng)稀釋的粗酶液，混勻。50°C水浴60min后加入1.5mlDNS，漩渦震蕩混勻后煮沸5min，靜置冷卻后加蒸餾水定容到25ml，搖勻，540nm測0D值?？瞻讓φ罩形醇尤霝V紙條。酶活定義在50°C、pH4.8條件下，將每分鐘產(chǎn)生1Pmol葡萄糖所需的酶量定為一個酶活力單位。濾紙酶活測定結(jié)果顯示斜臥青霉(Penicilliumdecumbens)Gi31_2CCTCCM2010111的最高濾紙酶活為3.32IU/ml，是出發(fā)菌株(2.71IU/ml)1.23倍(見圖7)。其中上述葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備如下取lOOmg葡萄糖(105°C烘干至恒重)，加到100ml容量瓶中，加dH20溶解，定容至100ml,即lmg/ml的葡萄糖溶液，搖勻，過夜。取10支25ml刻度試管，洗凈，烘干，按表2操作。0D值的測定采用美國產(chǎn)型號為SPECTRAMAX190的“微板光譜儀”。表2葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備冷卻立即放入冷水中，加dH20至25ml_OD540_0.0000.04720.10900.16610.22890.28590.33760.4254根據(jù)上述所述方法和表2所示結(jié)果，以葡萄糖濃度(mg/ml)為橫坐標(biāo)，OD540為縱坐標(biāo)作圖即為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖5。實施例6.工程菌斜臥青霉(Penicilliumdecumbens)Gi31_2CCTCCM2010111在生產(chǎn)葡萄糖苷酶酶液中的應(yīng)用。將斜臥青霉(Penicilliumdecumbens)Gi31_2CCTCCM2010111接種到裝有50ml葡萄糖基本培養(yǎng)基的300ml三角瓶中，28°C，在80rpm往復(fù)式搖床上培養(yǎng)24h，得發(fā)酵種子液；將得到的種子液先抽濾收集濕菌絲，再按lg150ml的比例將濕菌絲接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)100h，然后以6000rpm，4°C離心lOmin，收集的上清液即為0-葡萄糖苷酶酶的酶液。其中，上述葡萄糖基本培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖20，(NH4)2S045,KH2P0415,MgS040.6,CaCl20.6，F(xiàn)eS047H200.005，MnS04H200.0016，ZnS047H200.0014，CoCl20.002，pH5.5。發(fā)酵培養(yǎng)基(w/v):MandelS鹽溶液，2%木糖渣，的微晶纖維素，5%的麩皮汁。實施例7.工程菌斜臥青霉(Penicilliumdecumbens)Gi31_2CCTCCM2010111在生產(chǎn)葡萄糖苷酶酶液中的應(yīng)用。將斜臥青霉(Penicilliumdecumbens)Gi31_2CCTCCM2010111接種到裝有70ml葡萄糖基本培養(yǎng)基的300ml三角瓶中，30°C，在90rpm往復(fù)式搖床上培養(yǎng)36h，得發(fā)酵種子液；將得到的種子液先抽濾收集濕菌絲，再按lg150ml的比例將濕菌絲接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)108h，然后以7000rpm，4°C離心15min，收集的上清液即為0-葡萄糖苷酶酶的酶液。其中，上述葡萄糖基本培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖20，(NH4)2S045,KH2P0415,MgS040.6,CaCl20.6，F(xiàn)eS047H200.005，MnS04H200.0016，ZnS047H200.0014，CoCl20.002，pH5.5。發(fā)酵培養(yǎng)基(w/v):MandelS鹽溶液，2%木糖渣，的微晶纖維素，5%的麩皮汁。實施例8.工程菌斜臥青霉(Penicilliumdecumbens)Gi31_2CCTCCM2010111在生產(chǎn)葡萄糖苷酶酶液中的應(yīng)用。將斜臥青霉(Penicilliumdecumbens)Gi31_2CCTCCM2010111接種到裝有90ml葡萄糖基本培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，30°C，在lOOrprn往復(fù)式搖床上培養(yǎng)48h，得發(fā)酵種子液；將得到的種子液先抽濾收集濕菌絲，再按lg150ml的比例將濕菌絲接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)116h，然后以SOOOrpm，4°C離心15min，收集的上清液即為0-葡萄糖苷酶酶的酶液。10其中，上述葡萄糖基本培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖20，(NH4)2S045,KH2P0415,MgS040.6,CaCl20.6，F(xiàn)eS047H200.005，MnS04H200.0016，ZnS047H200.0014，CoCl20.002，pH5.5。發(fā)酵培養(yǎng)基(w/v):MandelS鹽溶液，2%木糖渣，的微晶纖維素，5%的麩皮汁。實施例9.工程菌斜臥青霉(Penicilliumdecumbens)Gi31_2CCTCCM2010111所生產(chǎn)的纖維素酶酶液在降解天然纖維素底物麥秸粉中的應(yīng)用。斜臥青霉工程菌所生產(chǎn)的纖維素酶酶液在降解天然纖維素底物麥秸粉中的應(yīng)用包括酶液制備和麥秸粉降解。酶液制備將斜臥青霉(Penicilliumdecumbens)Gi31_2CCTCCM2010111接種到裝有70ml葡萄糖基本培養(yǎng)基的300ml三角瓶中，30°C往復(fù)式搖床上90rpm培養(yǎng)36h后，得發(fā)酵種子液；將得到的種子液先進(jìn)行抽濾收集濕菌絲，再將lg抽濾得到的種子菌絲接種到150ml發(fā)酵培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)108h，然后以6000rpm，4°C離心15min，收集上清即為所需的含有纖維素酶的酶液。麥秸粉降解以每克麥秸粉加入5ml上述纖維素酶酶液的比例將酶液與底物混合，于pH5.0，溫度50°C，轉(zhuǎn)速200-300rpm條件下降解48_56h。其中，上述葡萄糖基本培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖20，(NH4)2S045,KH2P0415,MgS040.6，CaCl20.6，F(xiàn)eS047H200.005，MnS04H200.0016，ZnS047H200.0014，CoCl20.002，pH5.5。發(fā)酵培養(yǎng)基(w/v):MandelS鹽溶液，2%木糖渣，的微晶纖維素，5%的麩皮汁。權(quán)利要求一株過表達(dá)β-葡萄糖苷酶的斜臥青霉工程菌株，其特征在于所述菌株含有瑞氏木霉的β-葡萄糖苷酶I(bgl1)cDNA基因，其命名為斜臥青霉(Penicilliumdecumbens)Gi31-2，已于2010月5日7日保藏于“中國典型培養(yǎng)物保藏中心”，保藏號為CCTCCM2010111。2.權(quán)利要求1所述的斜臥青霉工程菌在生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酶液中的應(yīng)用。3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述斜臥青霉工程菌生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酶液的形式是以液體發(fā)酵方法實施；其中所述發(fā)酵方法是將斜臥青霉(Penicilliumdecumbens)Gi31-2CCTCCM2010111接種到裝有50_90ml葡萄糖基本培養(yǎng)基的300-500ml三角瓶中，28_30°C，在80_100rpm往復(fù)式搖床上培養(yǎng)24_48h，得發(fā)酵種子液；將得到的種子液先抽濾收集濕菌絲，再按Ig150ml的比例將濕菌絲接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)100-116h，然后以6000-8000rpm，4°C離心10-15min，收集的上清液即為β-葡萄糖苷酶酶的酶液。全文摘要本發(fā)明公開了一株過表達(dá)β-葡萄糖苷酶的斜臥青霉工程菌，其含有過表達(dá)的β-葡萄糖苷酶基因，該菌命名為斜臥青霉(Penicilliumdecumbens)Gi31-2，并于2010月5日7日保藏于“中國典型培養(yǎng)物保藏中心”，保藏號為CCTCCM2010111。本發(fā)明還公開了所述菌株在生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶和降解纖維素中的應(yīng)用。本發(fā)明所述工程菌株的β-葡萄糖苷酶活力最高達(dá)到3.47IU/ml，是原始宿主菌株的2.90倍；最高濾紙酶活為3.32IU/ml，是原始宿主菌株的1.23倍，預(yù)示該菌株在β-葡萄糖苷酶生產(chǎn)中有廣泛應(yīng)用。文檔編號C12R1/80GK101845399SQ20101017052公開日2010年9月29日申請日期2010年5月13日優(yōu)先權(quán)日2010年5月13日發(fā)明者張艷美,李忠海,杜春梅,汪天虹,鐘耀華申請人:山東大學(xué)