專利名稱：牛分枝桿菌Taqman熒光定量PCR檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種牛分枝桿菌檢測方法，具體地說，涉及一種牛分枝桿菌Taqman熒光定量PCR檢測方法。
背景技術(shù)：
自從1882年Kock發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌以來，分枝桿菌新菌種的發(fā)現(xiàn)、命名、分類及其演變都有很大的發(fā)展變化。在微生物分類學上，分枝桿菌歸屬于原核生物界、原壁菌門、 放線菌綱、放線菌目、分枝桿菌科、分枝桿菌屬。分枝桿菌屬成員均為好氧，平直或彎曲細長，革蘭氏陽性桿菌。在一定情況下可產(chǎn)生菌絲，但這些菌絲在攪動后成為桿狀或球形。1898年，Smith首次將牛分枝桿菌(M. bovis)和其它的分枝桿菌明確區(qū)分開來。牛分枝桿菌主要感染不同種屬的溫血動物，包括有蹄動物、有袋動物、食肉類動物、靈長類、鰭腳類動物和嚙齒類動物在內(nèi)的50多種哺乳動物，還包括類鸚鵡鳥、石鴿、北美洲烏鴉等20 多種禽類，其中牛是最敏感的動物。在核苷酸水平上，牛分枝桿菌與結(jié)核分枝桿菌基因組相比，其同源性大于 99. 95%，表現(xiàn)出共線性，沒有廣泛的置換、復制或倒置現(xiàn)象。在牛分枝桿菌基因組全序列測定之前，一般是利用基于雜交原理(高度準確的序列鑒定)方法來比較結(jié)核分枝桿菌復合群之間的基因差別，發(fā)現(xiàn)牛分枝桿菌基因組中存在大小為1 12. 7kb不等的片段缺失。在牛分枝桿菌中，僅有一個被稱作TbDl的基因位點，在現(xiàn)有的大多數(shù)結(jié)核分枝桿菌中沒有該基因的存在。因此，基因缺失在牛分枝桿菌基因組形成中可能起到了至關(guān)重要的作用。實時熒光定量PCR(real-timefluorogenetic quantitative PCR)是在定性技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核酸定量技術(shù)。它是一種在PCR體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累，實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。該技術(shù)不僅實現(xiàn)了對DNA模板的定量，而且具有靈敏度高、特異性和可靠性更強、自動化程度高、無污染性、具實時性和準確性等特點，目前已廣泛應(yīng)用于分子生物學研究和醫(yī)學研究等領(lǐng)域。 這種探針的長度為20-24bp，在其5’末端標記一個熒光報告基團，3’末端標記一個熒光淬滅基團，其序列與兩引物包含序列內(nèi)的一段DNA模板完全互補。該法利用Taq酶的5’ _3’ 外切酶活性，當探針保持完整時，淬滅基團吸收發(fā)射基團的發(fā)射熒光。在PCR的退火期，探針與模板發(fā)生特異性雜交，延伸期引物在Taq酶作用下沿DNA模板延伸，當達到探針后， TaqMan的外切酶活性將探針切斷，熒光信號得以釋放。模板每復制一次，就有一次熒光信號的釋放，通過該技術(shù)可以對模板進行準確定量。熒光定量PCR采用密封系統(tǒng)，將PCR擴增、熒光探針雜交及檢測一體化，在單一反應(yīng)管中進行，自動化程度高，可避免在PCR期間及PCR之后產(chǎn)物受到污染，確保結(jié)果的準確性。熒光定量PCR在擴增過程中實時監(jiān)控，實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度， 并記錄在電腦軟件之中，計算每個樣品Ct值。由于Ct值與起始模板濃度的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定，根據(jù)標準曲線獲得定量結(jié)果。Mishra等用巣式PCR對牛分枝桿菌和結(jié)核分枝桿菌進行區(qū)分和檢測，但是巣式PCR比熒光PCR步驟繁瑣，而且及其不敏感。研究發(fā)現(xiàn)，500bp基因片段為牛結(jié)核桿菌基因組所特有的基因，利用這個片段可以用于牛結(jié)核分枝桿菌的診斷和鑒別，但應(yīng)用500bp基因片斷進行的PCR檢測并不能檢出所有的牛分枝桿菌，存在漏檢現(xiàn)象。Taylor等人對牛分枝桿菌基因數(shù)目可變區(qū)RD4側(cè)翼序列設(shè)計引物，用STOR Green熒光定量PCR方法進行檢測，并和傳統(tǒng)PCR方法比較，結(jié)果顯示特異性提高，表明該序列可以對牛分枝桿菌進行特異性檢測。但是很多研究都沒有進行絕對定量，本發(fā)明根據(jù)對牛分枝桿菌的高度特異性，建立了可以簡便快速、準確檢測牛分支桿菌的熒光定量PCR檢測方法，有利于區(qū)分牛分枝桿菌和其他分枝桿菌，尤其是牛分枝桿菌和結(jié)核分枝桿菌的區(qū)分，對人結(jié)核病和牛結(jié)核病的防控和治療、牛結(jié)核病的臨床檢測及各種疫苗的研究具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供牛分枝桿菌的實時熒光定量PCR檢測方法，利用Taqman熒光定量PCR檢測方法的快速、敏感和特異性，準確檢測并鑒定牛分支桿菌引起的牛結(jié)核病。為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供一種牛分枝桿菌Taqman熒光定量PCR檢測用引物及探針，其中，上游引物為5 ’ -TGAAGTAGTAATGTGCGAGCTGAG-3 ’；下游引物為 5，-CGTTGTAGGCCACTCCAAGAG-3，；探針為5，-JOE-CGCTTCTGCACGACTACGGCTTGTATGA-Eclips e-3，。 本發(fā)明還提供含有上述弓I物及探針的檢測試劑盒。本發(fā)明進一步提供利用上述引物及探針檢測牛分枝桿菌的方法，包括以下步驟1)目的基因的擴增以牛分枝桿菌基因組DNA為模板，進行PCR反應(yīng)，其中，PCR上游引物為 5，-ATCGTGAATCGTCGAGTGATG-3，，下游引物為 5，-ACCCAGAAGGCGAACAGA-3 ；回收 PCR 擴增產(chǎn)物；2)目的基因的克隆將步驟1)的目的基因連接在PGEM-T easy載體上并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細胞， 篩選陽性轉(zhuǎn)化子，進行PCR檢測并測序，提取陽性重組質(zhì)粒，計算重組質(zhì)粒的拷貝數(shù)；3) Taqman熒光定量PCR檢測以陽性重組質(zhì)粒DNA為模板，利用引物及探針，其中，上游引物為 5，-TGAAGTAGTAATGTGCGAGCTGAG-3，；下游引物為 5，-CGTTGTAGGCCACTCCAAGAG-3，；探針為 5，-JOE-CGCTTCTGCACGACTACGGCTTGTATGA-Eclipse-3‘,進行 Taqman 熒光定量 PCR 檢測。前述的方法，其中Taqman熒光定量PCR檢測的退火溫度為50. 5°C。借由上述技術(shù)方案，本發(fā)明至少具有下列優(yōu)點及有益效果(1)本發(fā)明應(yīng)用blast對測序后的序列進行了同源性分析，其擴增序列與原序列完全一致，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，其擴增的片段大小與預期大小一致，說明所擴增的片段為目的片段，可以用于對牛分支桿菌和結(jié)核分支桿菌的檢測，用含有目的片段的質(zhì)粒做標準質(zhì)粒，并且通過計算得出其拷貝數(shù)，進行準確定量，提高了建立牛分支桿菌檢測方法的準確性。(2)本發(fā)明根據(jù)對牛分枝桿菌的高度特異性，建立了可以簡便快速、準確檢測牛分支桿菌的熒光定量PCR檢測方法，有利于區(qū)分牛分枝桿菌和其他分枝桿菌，尤其是牛分枝桿菌和結(jié)核分枝桿菌的區(qū)分，對人結(jié)核病和牛結(jié)核病的防控和治療、牛結(jié)核病的臨床檢測及各種疫苗的研究具有重要意義。


圖1為本發(fā)明牛分枝桿菌基因組DNA PCR擴增電泳結(jié)果，其中1為陰性對照，2為目的條帶；圖2為本發(fā)明不同退火溫度與熒光信號強度關(guān)系曲線；圖3為本發(fā)明不同Mg2+濃度與熒光信號強度關(guān)系曲線；圖4為本發(fā)明不同濃度的引物和探針與熒光信號強度關(guān)系曲線；圖5為本發(fā)明不同濃度的rTaq酶與熒光信號強度關(guān)系曲線；圖6為本發(fā)明使用PCR Mix時不同退火溫度與熒光信號強度關(guān)系曲線；圖7為本發(fā)明使用PCR Mix時不同濃度的引物和探針與熒光信號強度關(guān)系曲線；圖8為本發(fā)明使用單混PCR試劑時229bp標準質(zhì)粒的擴增曲線；圖9為本發(fā)明使用單混PCR試劑時229bp標準質(zhì)粒的標準曲線；圖10為本發(fā)明使用PCR Mix時229bp標準質(zhì)粒的擴增曲線；圖11為本發(fā)明使用PCR Mix時229bp標準質(zhì)粒的標準曲線；圖12為使用本發(fā)明探針檢測牛分枝桿菌特異性實驗結(jié)果曲線。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例1材料與方法1. 1實驗材料1. 1. 1原料及試劑牛分枝桿菌由中國檢驗檢疫科學研究院提供。結(jié)核分支桿菌(M. tuberculosis) H37Rv標準株，結(jié)核分支桿菌分離株、BCG、禽分支桿菌(M. avium)，偶發(fā)分支桿菌 (M. fortuit um)，胃分支桿菌(M. gastri)，龜分支桿菌、副結(jié)核分支桿菌、堪薩斯分支桿菌、 金黃色葡萄球菌、胞內(nèi)分支桿菌的DNA核酸樣品、滅活牛分支桿菌標準株菌液由武漢華中農(nóng)業(yè)大學提供。大腸桿菌(E. coli)菌種DH5aPGEM-T easy 載體Pfu DNA 聚合酶T4 DNA 連接酶IQ supermixPlasmid mini kit IGel extraction kitDL 2000 makerdNTP (IOmM)
北京全式金生物技術(shù)有限公司美國Promega公司美國Promega公司美國Promega公司美國BIO-RAD公司美國Omega公司美國Omega公司寶生物工程(大連)有限公司美萊博醫(yī)學科技有限公司
5
Taq酶美萊博醫(yī)學科技有限公司
1. 1. 2儀器
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1. 2方法
1.2. 1引物的設(shè)計與合成
根據(jù)GenBank中牛分支桿菌基因組獨特的229bp序列(GenBankAccession No :AJ003103)，應(yīng)用I^rimer premer5. 0軟件設(shè)計引物和探針，使引物退火溫度在55_65°C、GC含
量40-60%，產(chǎn)物大小在100-250bp之間，引物的3’端避免使用堿基A、避免出現(xiàn)3個以上連續(xù)相同的堿基，探針位置盡可能地靠近上游引物，探針長度20-30bp，Tm值65-70°C，GC含量40-70%，探針5’端避免使用堿基G，堿基C的含量要高于G，設(shè)計好的引物和探針滿足這些設(shè)計原則后，使用BLAST進行核實，確認各引物及探針的特異性。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。①229bp序列傳統(tǒng)PCR引物上游引物5，-ATCGTGAATCGTCGAGTGATG-3，下游引物5，-ACCCAGAAGGCGAACAGA-3，擴增產(chǎn)物片段大小752bp②229bp序列熒光定量PCR引物和探針上游引物5，-TGAAGTAGTAATGTGCGAGCTGAG-3，下游引物5，-CGTTGTAGGCCACTCCAAGAG-3，探針5，-JOE-CGCTTCTGCACGACTACGGCTTGTATGA-Eclipse-3‘擴增產(chǎn)物片段大小145bp1. 2. 2標準質(zhì)粒的構(gòu)建1.2. 2. 1目的基因的擴增以牛分枝桿菌基因組DNA為模板，用傳統(tǒng)PCR引物，擴增目的片段。反應(yīng)體系為50 μ L，在0.2ml PCR反應(yīng)管中加入以下試劑:試劑加樣量(μ L)牛分枝桿菌基因組DNA1Pfu DNA聚合酶緩沖液5dNTP(2. 5mmol/L)4上游引物(10mmol/L)1下游引物(10mmol/L)1Pfu DNA 聚合酶1滅菌去離子水37混勻后放入PCR擴增儀進行擴增，反應(yīng)程序如下1. 95°C預變性 5min
2.95 °C 變性 Imin 、 3.56°C退火Imin [35個循環(huán) 4.72 °C 延伸 Imin ^5. 72°C延伸 IOmin反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物經(jīng)1 %的瓊脂糖凝膠電泳鑒定片段大小，與DNAMarker比較，如果與引物所限定的目的片段大小一致，則可進行后續(xù)實驗。1. 2. 2. 2PCR 產(chǎn)物的回收用OMEGA公司的Gel extraction kit對傳統(tǒng)PCR產(chǎn)物進行切膠回收，步驟如下(1)將PCR產(chǎn)物進行0. 8%的瓊脂糖凝膠電泳；(2)在紫外透照臺上將目的片段快速切下，放入已經(jīng)稱重的兩個1.5mL Eppendorf 管中，然后稱重，得出膠塊的重量；(3)根據(jù)膠重按每毫克加一微升的量加入結(jié)合緩沖液，放55-60°C金屬浴中加熱直至膠完全溶解，期間每隔2-;3min振蕩混合，使之充分融化；(4)吸取200 μ L Buffer GPS平衡緩沖液至裝有Hibind DNA結(jié)合柱的2mL收集管，室溫放置3-5min，室溫下12000xg離心aiiin，棄掉收集管中濾液，將柱子重新裝回收集管；(5)將溶膠轉(zhuǎn)入結(jié)合柱中，室溫下IOOOOxg離心Imin ；(6)棄掉濾液，向結(jié)合柱加入300 μ L結(jié)合緩沖液，IOOOOxg離心Imin ；(7)棄掉濾液，向結(jié)合柱中加入700 μ L SPff洗滌緩沖液(含無水乙醇)，IOOOOxg 離心Imin ；(8)棄掉濾液，重復(7) —次；(9)棄掉濾液，13000xg離心2min，將液體甩干。(10)將結(jié)合柱轉(zhuǎn)移至一新的1. 5ml Eppendorf管中，加入30 μ L ddH20或洗脫緩沖液于結(jié)合柱中，室溫靜置2min，13000xg離心lmin，棄掉結(jié)合柱，管中為回收的DNA片段。(11)取2μ L回收的DNA，用微量分光光度計測定其濃度和純度，剩余DNA置于-20°C保存?zhèn)溆谩?br> 7
1.2.2.3目的基因的克隆(1)連接將切膠回收目的片段連接在PGEM-T easy載體上，依次加入以下試劑，反應(yīng)體系
(10 μ L)如下試劑加樣量(μυ目的片段32 X快速連接緩沖液5PGEM-T Easy 載體1T4 DNA 連接酶1置于4°C恒溫水浴箱連接過夜。(2)連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化①將感受態(tài)細胞從-80°C冰箱中取出之后置于冰上融化；②取3yL連接產(chǎn)物加入融化后的感受態(tài)細胞中，輕輕混勻；③冰浴30min;④42°C水浴熱激90s，再在冰上冷激anin ；⑤加入80 μ L無抗性的經(jīng)37 °C預熱的LB液體培養(yǎng)基，37 °C 150rpm震蕩培養(yǎng) 90min ；⑥3000rmp離心2min，棄掉部分上清，留下約100 μ L液體，然后重懸，加入7 μ L IPTG和40 μ L X-gal，用涂布棒涂布于有氨芐青霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基平板上，置于 37°C恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)約12-16小時，然后進行藍白斑鑒定。1.2. 2. 4重組質(zhì)粒的篩選與鑒定①挑取白斑于5mL含有氨芐青霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基，37°C 200rmp振蕩培養(yǎng) 12-16個小時；②以培養(yǎng)好的菌液為模板進行PCR鑒定；③將PCR測定為陽性的菌液進行保菌，取700 μ L菌液加300 μ L滅菌甘油于1. 5mL Eppendorf管中，混勻，標記后放入_80°C冰箱中保存待用；④將PCR鑒定陽性的菌液進行測序，測序由北京諾賽基因組研究中心有限公司完成。1. 2. 2. 5重組質(zhì)粒的提取將測序陽性的菌液用OMEGA公司的Plasmid mini kit I進行陽性質(zhì)粒的提取，步驟如下(1)取測序陽性的保存菌液200 μ L于3mL有氨芐青霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中， 370C 200rmp振蕩培養(yǎng)12-16個小時；(2)取 2mL 菌液于 1. 5mL Eppendorf 管中，室溫下 IOOOOxg 離心 Imin ；(3)棄掉上層培養(yǎng)液，向細菌沉淀中加入250 μ L Solution I (含RNase Α)，渦旋混勻；。(4)加入250 μ L Solution II，上下顛倒4-6次，輕輕混勻，室溫下溫育2min ；(5)加350yL Solution III，輕輕混勻至出現(xiàn)白色絮狀物，然后室溫下13000xg 離心IOmin ；
(6)小心轉(zhuǎn)移上清液到一個2mL的裝有DNA結(jié)合柱的收集管中(DNA結(jié)合柱的平衡方法同切膠回收)，室溫下IOOOOxg離心Imin ；(7)棄濾液，加500 μ L緩沖液HB, IOOOOxg離心Imin,除去蛋白；(8)棄濾液，加700 μ L DNA洗滌緩沖液(含無水乙醇)，IOOOOxg離心Imin ；(9)棄濾液，重復(8) 一次；(10)棄濾液，13000xg離心2min，將液體甩干；(11)將結(jié)合柱轉(zhuǎn)移至一新的1.5ml Eppendorf管中，加入30 μ L ddH20或洗脫緩沖液于結(jié)合柱中，室溫靜置2min，13000xg離心lmin，棄掉結(jié)合柱，管中為提取的質(zhì)粒DNA， 置于-20°C保存；(12)取2μ L質(zhì)粒DNA，用微量分光光度計測定其濃度和純度。1. 2. 2. 6質(zhì)?？截悢?shù)的計算和倍比稀釋通過測出的陽性質(zhì)粒濃度，計算重組質(zhì)粒的拷貝數(shù)。公式如下拷貝數(shù)=質(zhì)粒濃度(g/μ L) X加樣體積X阿弗加德羅常數(shù)/(質(zhì)?？傞L度X — 個堿基對的平均分子量)，阿弗加德羅常數(shù)(每mol的微粒數(shù))是6. 02 X IO23拷貝/mol，一個堿基對的平均分子量是660道爾頓，最后根據(jù)拷貝數(shù)將質(zhì)粒進行10倍的倍比稀釋。1. 3FQ-PCR方法的建立取1 μ L提取的陽性質(zhì)粒DNA作為模板，用序列熒光定量PCR引物和探針， 按照如下體系配置，設(shè)陰性對照時以無菌水代替質(zhì)粒DNA模板進行。使用單混PCR試劑時的反應(yīng)體系05 μ L)
成分體積(UL)
10 X PCR 緩沖液(Mg2+ free)2. 5
MgCl2 (25mM)2
dNTP(IOmM)0. 5
rTaq 酶0. 5
上游引物(10 μ M)1
下游引物( ο μ Μ)1
探針(10 μ Μ)1
模板DNA1
(MH2O15. 5
使用PCR Mix時的反應(yīng)體系(25 μ L)
成分體積(UL)
2 X PCR Taq Mix12. 5
上游引物(10 μ M)1
下游引物( ο μ Μ)1
探針(10 μ Μ)1
模板DNA1
(MH2O8. 5
反應(yīng)液配好后，瞬時離心，將樣品管放入Bio-Rad公司的miniopticonOpticonMonitor 3軟件進行程序設(shè)置及結(jié)果分析，PCR反應(yīng)程序如下
第一步95°C預變性5min
權(quán)利要求
1.一種牛分枝桿菌Taqman熒光定量PCR檢測用引物及探針，其中，上游引物為5’ -TGAAGTAGTAATGTGCGAGCTGAG-3，；下游引物為5，-CGTTGTAGGCCACTCCAAGAG-3，；以及探針為5，-J0E-CGCTTCTGCACGACTACGGCTTGTATGA-Eclipse-3，。
2.一種含權(quán)利要求1所述引物及探針的檢測試劑盒。
3.一種利用權(quán)利要求1所述的引物及探針檢測牛分枝桿菌的方法，其特征在于，包括以下步驟1)目的基因的擴增以牛分枝桿菌基因組DNA為模板，進行PCR反應(yīng)，其中，PCR上游引物為 5‘-ATCGTGAATCGTCGAGTGATG-3‘,下游引物為 5，-ACCCAGAAGGCGAACAGA-3，，回收 PCR 擴增產(chǎn)物；2)目的基因的克隆將步驟1)的目的基因連接在PGEM-T easy載體上并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細胞，篩選陽性轉(zhuǎn)化子，進行PCR檢測并測序，提取陽性重組質(zhì)粒，計算重組質(zhì)粒的拷貝數(shù)；3)Taqman熒光定量PCR檢測以陽性重組質(zhì)粒DNA為模板，利用權(quán)利要求1所述引物及探針，進行Taqman熒光定量 PCR檢測。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，其中Taqman熒光定量PCR檢測的退火溫度為 50. 5°C。
全文摘要
本發(fā)明提供一種牛分枝桿菌Taqman熒光定量PCR檢測方法，根據(jù)229bp對牛分枝桿菌的高度特異性，設(shè)計引物及探針，其中，上游引物為5’-TGAAGTAGTAATGTGCGAGCTGAG-3’；下游引物為5’-CGTTGTAGGCCACTCCAAGAG-3’；探針為5’-JOE-CGCTTCTGCACGACTACGGCTTGTATGA-Eclipse-3’。本發(fā)明建立了可以簡便快速、準確檢測牛分支桿菌的熒光定量PCR檢測方法，有利于區(qū)分牛分枝桿菌和其他分枝桿菌，尤其是牛分枝桿菌和結(jié)核分枝桿菌的區(qū)分，對人結(jié)核病和牛結(jié)核病的防控和治療、牛結(jié)核病的臨床檢測及各種疫苗的研究具有重要意義。
文檔編號C12Q1/06GK102162007SQ201010113248
公開日2011年8月24日 申請日期2010年2月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月23日
發(fā)明者劉建, 吳紹強, 林祥梅, 梅琳, 王彩霞, 王慧煜, 賈廣樂, 韓雪清 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院