專利名稱：一種合成海藻糖的融合蛋白及其在培育矮化草坪草中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種合成海藻糖的融合蛋白及其在培育矮化草坪草中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
低矮整齊的草坪在美化人們的生活環(huán)境方面起著重要作用，為了保持草坪草低 矮，目前人們普遍采用定期修剪的方式，造成了人力和資源的浪費(fèi)，因此有必要培育矮生草 坪草新品種。近期，分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展為分子育種手段培育矮生草坪草新品種提供了 技術(shù)平臺(tái)。海藻糖是一種由兩個(gè)葡萄糖分子以α，α-1，1糖苷鍵相連而成的非還原二糖， 在生物界中廣泛存在，它能清除有害的氧自由基，保護(hù)蛋白和磷脂膜抗氧化脅迫，維持細(xì) 胞膜在高滲透壓下的穩(wěn)定狀態(tài)，阻止細(xì)胞內(nèi)膜變性，抑制膜融合、降低相變溫度、保持膜 的流動(dòng)性等等。因此人們通過轉(zhuǎn)基因方法在植物中積累海藻糖以培育耐逆植物新品種。 同時(shí)為了消除海藻糖的前體6-磷酸-海藻糖在植物體內(nèi)的積累而影響植物的生理代謝 禾口生長(zhǎng)(Trehalose Mediated Growth Inhibition of Arabidopsis SeedlingsIs Due to Trehalose-6-Phosphate Accumulation. Plant Physiology,2004，135 :879-890)。 人們將合成海藻糖的TPS和TPP基因融合后轉(zhuǎn)入植株以得到生長(zhǎng)不受影響的耐逆植 株。如將大腸桿菌的TPS和TPP融合基因轉(zhuǎn)化水稻，成功獲得了正常生長(zhǎng)的耐逆的轉(zhuǎn)基 因 /K 禾 (Expression of a bifunctional fusion of the Escherichiacoli genes for trehalose-6-phosphate synthase and trehalose-6-phosphate phosphatase in transgenic rice ρlants increases trehalose accumulation and abioticstress tolerance without stunting growth. Plant physiology,2003，131 (2) :516-524)將融 合的酵母TPS和TPP基因轉(zhuǎn)入煙草，或是將TPS基因?qū)肴~綠體，或是逆境誘導(dǎo)表達(dá)TPS 都能得到了正常生長(zhǎng)的耐逆轉(zhuǎn)基因煙草等等。(Improved droughttolerance without undesired side effects in transgenic plants producingtrehalose Plant Mol. Biol.2007,64 :371-386)但是，在草坪草的轉(zhuǎn)基因研究中發(fā)現(xiàn)，將TPS和TPP融合基因轉(zhuǎn)化草坪草，能得到 矮生的轉(zhuǎn)基因植株，為用分子生物學(xué)手段培育矮生草坪草新品種提供了可能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種培育矮生草坪草的方法及其所用的融合蛋白。本發(fā)明提供了一個(gè)融合蛋白。該融合蛋白包括葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽和磷酸海藻糖合成酶，所述葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽位于所述 融合蛋白的氨基端，所述磷酸海藻糖合成酶位于所述葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的羧基端。所述融合蛋白還可包括磷酸海藻糖磷酸酶，所述磷酸海藻糖磷酸酶位于所述磷酸 海藻糖合成酶的羧基端。
所述葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽可來(lái)自雙子葉植物或單子葉植物；如來(lái)自擬南芥，其序列為序 列表中的序列5，編碼基因?yàn)樾蛄斜淼男蛄?。所述磷酸海藻糖合成酶和磷酸海藻糖磷酸酶來(lái)自恥垢分支桿菌。a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b)將序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添 加且具有相同功能的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。所述融合蛋白中，在序列2自氨基末端第582至586位氨基酸殘基為連接肽 (GSGSG)，編碼序列為序列表的序列3自5’端第1772至1786位核苷酸(GGATCAGGTTCTGGA)。上述a)、b)中的融合蛋白可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá) 得到。上述a)、b)中的融合蛋白的編碼基因可通過將序列表中序列1自5'端第四至2536 位堿基所示的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿 基對(duì)的錯(cuò)義突變得到。所述融合蛋白的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述編碼基因具體可為如下1)至3)的DNA分子之一1)其編碼序列是序列表中序列1自5'末端第四-2536位脫氧核糖核苷酸所示的 DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；3)與2)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA分子。上述嚴(yán)格條件可為在5 X SSC，5 X Denhardt，S溶液，0. 05mg/mL魚精DNA，50 %去離 子甲酰胺溶液中，在65°C下雜交，然后在室溫用2XSSC，0. 1% SDS，在42°C用0. 25 X SSC, 0. 1% SDS各洗膜15分鐘兩次。含有所述基因的表達(dá)盒、重組表達(dá)載體、細(xì)胞系或重組菌均屬本發(fā)明的保護(hù)范圍?？捎矛F(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建含有所述融合蛋白編碼基因的重組表達(dá)載體。所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植 物表達(dá)載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號(hào)和任何其它參與 mRNA加工或基因表達(dá)的DNA片段。所述聚腺苷酸信號(hào)可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的 3’端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)?；?如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆 貯存蛋白基因)3’端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。使用所述融合蛋白編碼基因構(gòu)建重組植物表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可 加上任何一種增強(qiáng)型啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子，如花椰菜花葉病毒(CAMV) 35S啟動(dòng)子、玉米 的泛素啟動(dòng)子⑴biquitin)，它們可單獨(dú)使用或與其它植物啟動(dòng)子結(jié)合使用；此外，使用本 發(fā)明的融合的蛋白編碼基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn) 錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編 碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來(lái) 源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來(lái)自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu) 基因。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行 加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等)或是 抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選 擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。所述表達(dá)載體具體可為如圖1所示的表達(dá)載體。本發(fā)明還提供了一種培育矮生草坪草的方法，是將這些DNA片段導(dǎo)入植物細(xì)胞， 得到矮生草坪草?？赏ㄟ^任何常規(guī)方法將所述DNA片段導(dǎo)入植物細(xì)胞，如通過如圖1所示的表達(dá)載 體將所述DNA片段導(dǎo)入植物細(xì)胞，得到矮生草坪草。本發(fā)明提供了一個(gè)融合蛋白，該融合蛋白包括了葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽和磷酸海藻糖合成 酶，葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽位于融合蛋白的氨基端，磷酸海藻糖合成酶位于葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的羧基端。 融合蛋白也包括磷酸海藻糖磷酸酶，磷酸海藻糖磷酸酶位于磷酸海藻糖合成酶的羧基端。 磷酸海藻糖合成酶和磷酸海藻糖磷酸酶來(lái)自恥垢分枝桿菌。將本發(fā)明的融合蛋白的編碼基 因?qū)氩萜翰葜?，可以得到矮生草坪草。本發(fā)明的融合蛋白及其編碼基因?qū)ε嘤牟?坪草有顯著作用。應(yīng)用本發(fā)明方法培育矮生草坪草可以節(jié)省人力、節(jié)約資源，有較大的應(yīng)用 前景。以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。


圖 1 為質(zhì)粒 pCAMBIA2300: :mTPSP 的結(jié)構(gòu)2為轉(zhuǎn)pCAMBIA2300: :mTPSP草坪草的PCR結(jié)果電泳鑒定圖3為轉(zhuǎn)pCAMBIA2300: :mTPSP草坪草的表型
具體實(shí)施例方式細(xì)菌基因組DNA的提取采用SDS裂解法，植物基因組DNA的提取采用CTAB法，具 Sambrook and Russell “ Molecular Cloning :A Laboratory Manual" (2001)；
Cloning :A Practical Approach, " Volumes I and II" (D. N. Glover, ed. ,1985)。細(xì)胞總RNA的提取采用TRIZOL RNA提取液(鼎國(guó)生物技術(shù)公司)，并按供應(yīng)商提 供的方案進(jìn)行總RNA的提取。將得到的總RNA用DNase酶(Prmega，America)消化，以去除 殘存的DNA，以分光光度計(jì)(Eppendorf公司，德國(guó))檢測(cè)樣品中總RNA的濃度。取5 μ g總 RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(寶生物工程(大連)有限公司)按試劑盒的方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以得 到的cDNA片段為模板進(jìn)行如下所示的PCR擴(kuò)增反應(yīng)。除非有特殊說明，25 μ 1 PCR反應(yīng)體系為0. 1 μ g模板DNA、1. 5mM MgCl2, 20mMTri s-HCl (pH8. 4)、50mM KCl、0. 2mM dNTP 混合物、0. 2μΜ 正向引物和 0. 2μΜ 反向引 物，以及IU的pfu高保真DNA聚合酶(上海申能博彩生物技術(shù)公司)。按照下列方案在 PCR-熱循環(huán)儀(Eppendorf公司，德國(guó))中進(jìn)行PCR循環(huán)反應(yīng)94°C預(yù)變性4分鐘，94°C變 性30秒，按各特定溫度復(fù)性，復(fù)性時(shí)間30秒，72°C延伸，延伸時(shí)間各反應(yīng)特定，30個(gè)循環(huán)，最 后72 °C、10分鐘。本發(fā)明中所用的引物均為上海生工公司合成。本發(fā)明中所用的引物如下
Pl :5’ -TCTCCGGAGAGTGGCCACGAA-3’P2 :5’ -GAAGCTCCCGGAGTCGGACTCG-3’ ；P3 :5’ -TCAGTCACACAAAGAGTAAAGAAGA-3’ ；P4 :5，-GGAATCGGTAAGGTCAGGAAGGT-3‘；P7 :5’ -CGTGGCCACTCTCCGGAGAGGAATCGGTAAGGTCAG-3，；P8 :5’ -CCTTCCTGACCTTACCGATTCCTCTCCGGAGAGTGGCCACGAAAC-3，；Pll :5’ -CGCCGTGCGCCGCGGCGCATAGTCACGCCGGCTCATATTAGG-3，；P12 :5’ -TAAGGGCAGCCCATACAAATG-3’ ；P13 :5， -GCCGGTGAATTCGCTGAGCA-3，；P14 :5’ -ACTCATTCCAGAACCTGATCCGAAGCTCCCGGAGTCGGACTC-3，；P15 :5’ -TTCGGATCAGGTTCTGGAATGAGTCTTTCGGGGGATCTGCAG-3，；下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例1、一、磷酸海藻糖合成酶基因的克隆恥垢分枝桿菌基因組約7Mb，環(huán)狀，全基因組序列測(cè)定已完成(Genbank AccessionNC_008596)。其中磷酸海藻糖合成酶基因長(zhǎng)1512bp，編碼503個(gè)氨基酸 (GenbankAccession ABK71484)。參照生物學(xué)模式菌株恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis)的序列人工合成 1506bp的片段的磷酸海藻糖合成酶基因(三博遠(yuǎn)志)，測(cè)序表明該片段為不含起始密碼子 和終止密碼子的磷酸海藻糖合成酶基因序列，與基因庫(kù)中序列吻合，將該磷酸海藻糖合成 酶基因片段命名為TPS(其序列是自序列1的5'末端第沈6-1771位核苷酸)。2、磷酸海藻糖磷酸酶基因的克隆恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis)的磷酸海藻糖磷酸酶基因?yàn)?長(zhǎng) 750bp，編碼 249 個(gè)氨基酸(Nucleotide Accession CP000480, Protein Accession ABK73322)的 DNA 片段。參照生物學(xué)模式菌株恥垢分枝桿菌(MyccAacterium smegmatis)的序列人工合 成750bp的片段的磷酸海藻糖磷酸酶基因(三博遠(yuǎn)志)，測(cè)序表明，該片段為磷酸海藻糖 磷酸酶基因片段，與基因庫(kù)中序列吻合，將該擴(kuò)增到的磷酸海藻糖磷酸酶基因片段命名為 TPP (其序列是自序列3的5'末端第1787-2536位核苷酸)。二、擬南芥RuBisCO基因葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽DNA片段和煙草RuBisCO基因轉(zhuǎn)錄終止區(qū) DNA片段的獲得1、擬南芥RuBisCO基因葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽DNA片段的獲得根據(jù)擬南芥RuBisCO基因(Genbank Accession NM_202369)序列分析，合成引物 P3和P4，以擬南芥總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，通過55°C復(fù)性30秒，72°C延伸30秒 PCR反應(yīng)擴(kuò)增得到的DNA片段，測(cè)序結(jié)果表明該片段為擬南芥RuBisCO基因N端編碼 轉(zhuǎn)運(yùn)肽的DNA序列，將該片段命名為AtTP(其序列是自序列1的5'末端第1-265位核苷 酸)。2、煙草RuBisCO基因轉(zhuǎn)錄終止區(qū)DNA片段的獲得合成引物Pll和P12，以煙草基因組DNA為模板，通過55°C復(fù)性30秒，72°C、30秒PCR反應(yīng)擴(kuò)增得到407bp的DNA片段.測(cè)序結(jié)果表明，該片段含有煙草RuBisCO基因的3， 終止區(qū)和22bp的TPP3’端序列，將該片段命名為NtTrbcS (其序列是自序列3的5'末端第 2515至四21位核苷酸)。三、融合基因的獲得合成PCR反應(yīng)融合引物P7和P8。以P3、P7為引物，AtTP為模板，通過55°C復(fù)性 30秒，72°C、30秒PCR擴(kuò)增得到DNA片段；同時(shí)以P8、P2為引物，TPS為模板，通過 55°C復(fù)性30秒，72°C、2分鐘PCR擴(kuò)增得到1528bp DNA片段。將兩片段回收，分別取0. 1 μ g 混合，作為模板，在不加入引物的條件下，65°C復(fù)性30秒，72°C延伸2分鐘，反應(yīng)5個(gè)循環(huán)， 然后加入引物P3和P13，56°C復(fù)性30秒，72°C延伸2分鐘，反應(yīng)30個(gè)循環(huán)，得到1510bp的 DNA片段，將該片段命名為dTPSPl，連接到質(zhì)粒pBluescript II KS(-)的SmaI位點(diǎn)，并測(cè) 序。序列分析表明dTPSPl包含了 TPS基因片段，并融合了擬南芥RuBisCO基因N端編碼轉(zhuǎn) 運(yùn)肽的DNA片段，將該質(zhì)粒命名為pBS: TPSPl。0.01 yg TPS為模板，Pl和P14為引物，65°C復(fù)性，72°C延伸2分鐘，反應(yīng)25個(gè)循 環(huán)，得到1527bp的DNA片段。同時(shí)分別取0. 1 μ g TPP和Nt1TrbcS,混合作為模板，在不加 引物的條件下，65°C復(fù)性30秒，72°C延伸2分鐘，反應(yīng)5個(gè)循環(huán)，然后加入引物P15和P12， 56°C復(fù)性，72°C延伸2分鐘，反應(yīng)30個(gè)循環(huán)，得到1153bp的DNA片段。將上述得到的1527bp 和1153bp PCR片段分別回收純化，取0. 1μ g混合，在不加引物的條件下，65°C復(fù)性，72°C延 伸2分鐘，反應(yīng)5個(gè)循環(huán)，然后加入引物P16和P12，60°C復(fù)性30秒，72°C延伸2分鐘，反應(yīng) 30個(gè)循環(huán)，得到1740bp的DNA片段，該片段被命名位dTPSP2，被連接到質(zhì)粒pBluescript IIKS(-)的Hinc II位點(diǎn)處，并測(cè)序。序列分析表明dTPSP2包含了 TPS基因片段靠3’端的 一部分，同時(shí)融合了全長(zhǎng)的TPP基因片段以及煙草RuBisCO基因終止區(qū)的DNA片段，該質(zhì)粒 被命名為pBS::TPSP2。Mlu I-Kpn I雙酶切pBS: TPSP2，回收1. 71Λ的片段，插入到經(jīng)過同樣酶切的 pBS: TPSPl質(zhì)粒上，重組質(zhì)粒被命名為pBS: :dTPSP。dTPSP包含了完整的TPS基因片段(序列3第沈6_1771位核苷酸)，TPP基因 片段(序列3第1787-2536位核苷酸)，TPS和TPP基因間的連接肽DNA序列(序列3第 1772-1786位核苷酸)同時(shí)在5，端融合了擬南芥RuBisCO基因N端編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽的DNA片 段(序列3第1-265位核苷酸)，以及3，端融合了 RuBisCO基因終止區(qū)的DNA片段(序列 3第2547-2921位核苷酸)。四、融合基因dTPSP植物表達(dá)載體的構(gòu)建BstXI 和 XhoI 酶切質(zhì)粒 pCAMBIA2300 (Genbank Accession Number AF234315)， 回收787bp的35S啟動(dòng)子片段，將787bp的35S啟動(dòng)子片段插入pUC18 (GenbankAccession Number L09136)的SphI和Mil酶切位點(diǎn)間，得到重組質(zhì)粒pUC18: :35S。隨后SpeI和KpnI 酶切質(zhì)粒pBS: dTPSP，得到約3000bp的含有dTPSP的片段，將該片段插入到)(bal和KpnI 酶切的pUC18: :35S上，得到重組質(zhì)粒pUC18: :35S-dTPSP。HindIII 和 KpnI 酶切 pUC18 35S_dTPSP，回收約 3. 8kb 的 35S-TPSP 片段，插入到 經(jīng)過同樣酶切的PCAMBIA2300上，得到重組質(zhì)粒pCAMBIA2300 dTPSP (圖4)。包含完整的 TPS和TPP融合基因并在其5 ‘端融合了擬南芥RuBisCO基因N端編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽的dTPSPDNA 片段受到35S啟動(dòng)子控制，終止子為煙草RuBisCO基因終止區(qū)。
該質(zhì)粒pCAMBIA2300: :dTPSP 轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌 LBA4404 中，得到菌株 LBA4404/TPSP, 用于植物組織的侵染。同時(shí)以pCAMBIA2300質(zhì)粒做為陰性對(duì)照，轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌LBA4404中，得到菌株 LBA4404/2300o五、草坪草轉(zhuǎn)化1、愈傷組織誘導(dǎo)選取成熟飽滿的草坪草早熟禾的種子，室溫下在蒸餾水中浸泡4小時(shí)后剝?nèi)シN 皮，再放入蒸餾水中繼續(xù)浸泡過夜。浸泡好的去皮種子先用70%酒精過兩遍，再用30%次 氯酸鈉消毒30分鐘，無(wú)菌水沖洗三遍。在無(wú)菌條件下，將種子接入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基。接 種密度100粒/皿，平皿直徑75mm。每升愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的組成如下在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入生長(zhǎng)素類 物質(zhì)2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-0，5丨811^，美國(guó))&^，6-芐氨基嘌呤(Sigma，美國(guó))0. lmg，pH 5. 8。2、愈傷組織的農(nóng)桿菌侵染將愈傷組織置于經(jīng)過重懸靜置菌液濃度為0D600 = 0. 1的LBA4404根農(nóng)桿菌菌液 中侵染10分鐘，倒去菌液，在無(wú)菌濾紙上將愈傷晾干(約5分鐘)，置于覆有一層無(wú)菌濾紙 的共培養(yǎng)培養(yǎng)基，25°C暗培養(yǎng)3天。所用共培養(yǎng)培養(yǎng)基為步驟-的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基。3、抗性愈傷組織的篩選共培養(yǎng)后用篩選培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織進(jìn)行篩選，每三星期轉(zhuǎn)皿一次，約兩個(gè)月后上 分化培養(yǎng)基。每升抗性愈傷組織篩選培養(yǎng)基的組成如下在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入2， 4-二氯苯氧乙酸(2,4-D, Sigma，美國(guó))ang，6-芐氨基嘌呤(Sigma，美國(guó))0. lmg, G418(青 島生工)20mg-100mg，羧芐青霉素(北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司)250mg，pH5. 8。4、抗性愈傷組織的分化將經(jīng)過篩選的直徑達(dá)到0. 5cm以上的抗性愈傷組織放到分化篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行 分化，并于25°C下光照培養(yǎng)(1 光/ 暗)。10天后有綠色小芽出現(xiàn)，約兩周后即可生長(zhǎng) 為幼苗。每升分化培養(yǎng)基的組成如下在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入6-芐氨基嘌呤 (Sigma，美國(guó))0. 2mg,激動(dòng)素(Sigma，美國(guó))0. 2mg, G418 (青島生工)50mg, ρΗ5· 8。5、轉(zhuǎn)化植株的生根將已分化的幼苗接種于生根培養(yǎng)基，生根。生根培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基。六、PCR鑒定取生根培養(yǎng)基上的10棵轉(zhuǎn)pCAMBIA2300 dTPSP苗葉片用CTAB法提取植物DNA， 用引物P3和P13進(jìn)行PCR反應(yīng)驗(yàn)證，結(jié)果得到與預(yù)期1510bp相當(dāng)?shù)臈l帶(如圖2所示，圖中 最左列為marker，左第2列為質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照，最右列為陰性對(duì)照，其余為轉(zhuǎn)pBI121 dTPSP 基因植物DNA)可見轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性率接近100%。七、表型觀察 將同時(shí)轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)pCAMBIA2300 dTPSP和轉(zhuǎn)pCAMBIA2300苗載入沙盆室內(nèi)培育一個(gè)半月后可見轉(zhuǎn)pCAMBIA2300::dTPSP的草坪草明顯矮生。如圖3所示，左為轉(zhuǎn) PCAMBIA2300: :dTPSP 植株，右為轉(zhuǎn) pCAMBIA2300 植株。將轉(zhuǎn)基因苗及對(duì)照苗50厘米間隔同時(shí)種于田間，正常施肥澆水不予修剪，第二年 五月分別測(cè)量植株的高度，數(shù)據(jù)如下
權(quán)利要求
1.一種融合蛋白，包括含葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的磷酸海藻糖合成酶和磷酸海藻糖磷酸酶，所 述葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽位于所述磷酸海藻糖合成酶的氨基端，所述磷酸海藻糖合成酶位于所述葉 綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的羧基端。所述磷酸海藻糖磷酸酶位于所述磷酸海藻糖合成酶的羧基端。
2.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽來(lái)自雙子葉植物或 單子葉植物；所述磷酸海藻糖合成酶和磷酸海藻糖磷酸酶來(lái)自恥垢分支桿菌。
3.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽來(lái)自擬南芥，其序列 為序列表的序列4。
4.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白為下述a)、b)的蛋白質(zhì)a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b)將序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且 具有相同功能的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
5.權(quán)利要求1-4中任一所述融合蛋白，其特征在于其編碼基因?yàn)槿缦?)至3)的DNA分子之一1)其編碼序列是序列表中序列1自5'末端第四-2536位脫氧核糖核苷酸所示的DNA 分子；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；3)與1)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA分子。
6.含有權(quán)利要求5所述基因的表達(dá)盒、重組表達(dá)載體、細(xì)胞系或重組菌；所述表達(dá)載體 為如圖1所示的表達(dá)載體。
7.一種培育矮生草坪草的方法，是將權(quán)利要求1至4中所述融合蛋白的編碼基因?qū)?植物細(xì)胞，得到矮生草坪草。所述草坪草可以是早熟禾。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述編碼基因通過如圖1所示的表達(dá)載體 導(dǎo)入植物細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種應(yīng)用一種融合蛋白培育矮生草坪草的方法。本發(fā)明提供的融合蛋白，包括含葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的磷酸海藻糖合成酶，葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽位于融合蛋白的氨基端，磷酸海藻糖合成酶位于葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的羧基端。融合蛋白還可包括磷酸海藻糖磷酸酶，磷酸海藻糖磷酸酶位于磷酸海藻糖合成酶的羧基端。將本發(fā)明的融合蛋白的編碼基因?qū)胫参镏校梢缘玫桨萜翰?。本發(fā)明的融合蛋白及其編碼基因可用于培育美觀少修剪的草坪草新品種。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102146139SQ201010112498
公開日2011年8月10日 申請(qǐng)日期2010年2月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月5日
發(fā)明者吳茜, 徐健勇, 李欽清, 溫紅雨, 趙建杰, 陳婉麗, 陳蕾 申請(qǐng)人:北京北方杰士生物科技有限責(zé)任公司