專利名稱：一種提高酶法制備纖維低聚糖得率的方法
技術領域：
本發(fā)明屬生物化學中的微生物酶解制糖技術領域，具體涉及一種纖維質原料經(jīng)生 物酶降解后，制備功能性食品或飼料添加劑一纖維低聚糖的技術。
背景技術：
低聚糖或稱寡糖，是由2 10個單糖通過糖苷鍵連接而成的低聚合度糖類。低聚 糖分普通低聚糖和功能性低聚糖兩類。功能性低聚糖是指具有特殊的生物學功能，尤其能 夠顯著促進人或動物腸道內雙歧桿菌增殖，有益于人或動物健康的一類低聚糖，即所謂的 雙歧因子。除了能夠促進腸道內雙歧桿菌等有益菌增殖外，功能性低聚糖另一個重要的生 物學功能是刺激人或動物體內的免疫系統(tǒng)，從而提高免疫力。功能性低聚糖主要作為添加 劑用于食品或飼料領域，近年來，隨著人們對自身健康和動物食品安全的關注，功能性低聚 糖類食品或飼料添加劑的開發(fā)和應用越來越受到重視。功能性低聚糖的種類很多，目前進 入商業(yè)化的品種主要包括低聚異麥芽糖、低聚果糖、低聚殼聚糖、大豆低聚糖、帕拉金糖、低 聚木糖等。纖維低聚糖是由2 10個葡萄糖通過β -1，4-糖苷鍵結合而成的低聚合度糖類， 是功能性低聚糖的一種，纖維低聚糖主要是由纖維素經(jīng)過化學或生物酶的方法制備。纖維素酶是水解纖維素成葡萄糖的一組酶的總稱，它是一個多組分的復合酶系， 主要有三種組分即內切型葡聚糖酶、外切型葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶組成。纖維素可在 這三種酶組分的協(xié)同作用下徹底水解成葡萄糖。在纖維素酶水解過程中，內切葡聚糖酶以 隨機形式切斷纖維素鏈中的β-1，4-糖苷鍵，生成短鏈纖維素和纖維低聚糖；隨后外切葡 聚糖酶主要作用于短鏈纖維素和纖維低聚糖的非還原末端，生成聚合度為2的纖維低聚糖 纖維二糖；最后，纖維低聚糖、尤其是纖維二糖，在葡萄糖苷酶的作用下徹底降解成葡 萄糖。從纖維素水解協(xié)同機理不難看出，如果纖維素酶系中葡萄糖苷酶的量越低， 則纖維素水解過程中中間產(chǎn)物纖維低聚糖進一步水解成葡萄糖的量則越少，纖維素水解成 纖維低聚糖的得率就越高，產(chǎn)品中無生理活性的單糖葡萄糖的比例就越少。在中國專利申 請200910035998. 8《一種微生物酶法生產(chǎn)纖維低聚糖新工藝》中，提供了一種將纖維質原料 中的纖維素選擇性降解成功能性纖維低聚糖的方法，其特征是采用“底物原位吸附_固液 分離”的方法拆分纖維素酶系中的β "葡萄糖苷酶，嚴格控制底物與纖維素酶吸附的條件， 并通過固液分離法除去大量葡萄糖苷酶，用該拆分后的低葡萄糖苷酶活力纖維素 酶水解纖維質原料，可制得葡萄糖含量較低的纖維低聚糖。與未拆分處理的纖維素酶降解 法相比，纖維低聚糖得率提高，纖維低聚糖比例可達總糖的57. 63%。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是針對CN 200910035998. 8提供的方法中，低β -葡萄糖苷酶活力 纖維素酶在選擇性降解纖維質原料制備纖維低聚糖時，纖維低聚糖得率仍然較低的不足，提出一種更為高效的纖維低聚糖制備工藝方法。纖維素酶是一種受反饋抑制的水解酶類，纖維素酶在水解纖維素過程中各酶組分 受到纖維素水解產(chǎn)物及其中間產(chǎn)物的反饋抑制。低葡萄糖苷酶活力纖維素酶在水解纖 維素制備纖維低聚糖過程中，由于水解體系中葡萄糖苷酶活力低而導致纖維素水解產(chǎn) 物中纖維低聚糖和纖維二糖的累積，有利于纖維低聚糖的制備。但累積的纖維低聚糖將對 內切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的活力產(chǎn)生反饋抑制作用，從而降低了水解效率和纖維低聚 糖的得率。如果在水解過程中采用某種方法將反應產(chǎn)生的纖維低聚糖及時移走，解除纖維 低聚糖對內切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的反饋抑制，就可以提高這兩種酶的催化效率，從 而提高纖維低聚糖的得率。本發(fā)明的技術解決方案為一種提高酶法制備纖維低聚糖得率的方法，以底物 原位吸附-固液分離法拆分纖維素酶系中的葡萄糖苷酶，通過固液分離法除去大量 β “葡萄糖苷酶后用于水解纖維質原料，其特征是水解進行一段時間以后，將水解物固液分 離，分離所得的液相部分為纖維低聚糖液，向分離后的固相沉淀物中添加分離出的同等體 積、PH值為4 6的水后繼續(xù)水解，如此循環(huán)重復，直至酶水解結束。可以采用兩段水解的工藝，第一次水解6 18小時，第二次水解18 6小時，最 好采用10h+14h的水解分段法；也可以采用三段水解的工藝，第一、二次分別水解6小時，第三次水解12小時。適當增加水解的分段次數(shù)，理論上還可以提高纖維低聚糖的得率，但生產(chǎn)成本將 會增加。所述的方法中，纖維質原料可為木聚糖生產(chǎn)廢渣、低聚木糖生產(chǎn)廢渣、木糖渣、糠 醛渣，或經(jīng)過適當預處理的纖維質原料，即以提高纖維質原料中纖維素對纖維素酶的可及 度所采用的物理、化學、生物或以上幾種方法聯(lián)合應用的方法。吸附和水解過程小規(guī)模在搖 瓶或往復式振蕩器上進行，大規(guī)模在生物反應器、機械攪拌條件下進行；固液分離則可采用 離心固液分離法或板框過濾固液分離法。所用的纖維素酶，可由里氏木霉(Trichoderma reesei)、黑曲霉 (Aspergillusniger)、綠色木霉(Trichoderma viride)、康氏木霉(Trichoderma koningii)纖維素酶中的一種或多種提供。本發(fā)明的有益效果采用低β -葡萄糖苷酶活力纖維素酶選擇性水解纖維質原料制備纖維低聚糖，將 水解過程分為若干個階段，可以及時移除水解生成的產(chǎn)物纖維低聚糖，有效解除酶解產(chǎn)物 對纖維素酶的反饋抑制作用，從而有利于纖維低聚糖得率的提高。與低葡萄糖苷酶活 力纖維素酶選擇性水解纖維質原料制備纖維低聚糖的不分段水解相比，采用兩段水解法， 纖維低聚糖得率提高10%左右；采用三段水解法，纖維低聚糖得率提高20%左右。
具體實施例方式以下一 三中所提及的方法，屬本領域技術人員公知和已公開的技術。一、用里氏木霉制備纖維素酶1.里氏木霉(T. reesei)菌絲體培養(yǎng)基成分(g/L):葡萄糖10. 0 ；蛋白胨1. 0 ；硫酸 銨1. 4 ；尿素0. 3 ；磷酸二氫鉀2. 0 ；無水氯化鈣0. 3 ；七水硫酸鎂0. 3 ；七水硫酸亞鐵0. 005 ；七水硫酸錳0. 0016 ；七水硫酸鋅0. 0014 ；氯化鈷0. 002。培養(yǎng)基用0. 05mol/L的檸檬酸鈉 緩沖液調節(jié)PH值4. 8。2.里氏木霉纖維素酶合成培養(yǎng)基成分(g/L):葡萄糖1. 0 ；紙漿10. 0 ；蛋白胨1. 0 ； 硫酸銨1. 4 ；尿素0. 3 ；磷酸二氫鉀2. 0 ；無水氯化鈣0. 3 ；七水硫酸鎂0. 3 ；七水硫酸亞鐵 0. 005 ；七水硫酸錳0. 0016 ；七水硫酸鋅0. 0014 ；氯化鈷0. 002。培養(yǎng)基用0. 05mol/L的檸 檬酸鈉緩沖液調節(jié)PH值4. 8。3.里氏木霉菌絲體的培養(yǎng)50ml菌絲體培養(yǎng)基置于250ml三角瓶中，于121°C下 滅菌30min，冷卻至室溫，接入適量保藏于試管斜面的里氏木霉孢子，搖瓶置于恒溫搖床中 于30 士 1°C、170轉/分條件下培養(yǎng)36h后備用。4.里氏木霉纖維素酶的制備培養(yǎng)基于121°C下滅菌30min，冷卻至室溫，接入上 述培養(yǎng)36h的里氏木霉菌絲體，置于恒溫搖床中于170轉/分條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度第一天 控制在30 士 1 °C，以后控制在28 士 1 °C。5.培養(yǎng)4天，用離心機在3000轉/分條件下離心IOmin將培養(yǎng)液中的固體物質 (菌體和未被利用的紙漿纖維)分離除去，即得纖維素酶液。濾紙酶活力的測定采用國際理論和應用化學協(xié)會(IUPAC)推薦的標準方法測 定。實驗條件底物Whatman濾紙50mg，加入適當稀釋倍數(shù)的酶液和緩沖液，使反應體系pH 值為4. 8，于50°C、振蕩頻率80次/分的往復式恒溫振蕩器中反應60min，測定反應生成的 葡萄糖量。一個濾紙酶活力的單位(FPIU)定義為標準反應條件下每分鐘生成Iymol葡萄 糖的酶量。內切葡聚糖酶活力的測定內切葡聚糖酶活力通常用羧甲基纖維素酶活力表示。 實驗條件底物(w/v)的羧甲基纖維素懸浮液，加入適當稀釋倍數(shù)的酶液和緩沖液，使 反應體系pH值為4. 8，于50°C、振蕩頻率80次/分的往復式恒溫振蕩器中反應30min，測定 反應生成的葡萄糖量。一個羧甲基纖維素酶活力的單位(IU)定義為標準反應條件下每分 鐘生成Ιμπιο 葡萄糖的酶量。β -葡萄糖苷酶活力的測定采用對硝基苯基-D-葡萄糖苷(pNPG)為底物測 定。0. Iml適當稀釋的酶液與0. 9ml 5mmol/L的pNPG溶液(由0. 05mol/L、pH值為4. 8的 檸檬酸_磷酸氫二鈉緩沖液配制)混合后，于50°C、振蕩頻率80次/分的往復式恒溫振蕩 器中反應IOmin后立即加入2ml lmol/L的Na2CO3溶液終止反應，再加入IOml蒸餾水，搖 勻。于400nm下測定吸光度。以0. Iml蒸餾水代替酶液作空白對照。每個樣品做2 3個 平行樣，取平均值。一個葡萄糖苷酶活力單位(IU)定義為標準反應條件下每分鐘生成 1 μ mol對硝基苯酚所需的酶量。結果表明，里氏木霉以紙漿為碳源合成纖維素酶，培養(yǎng)4天，濾紙酶活力為 L72FPIU/ml，羧甲基纖維素酶活力為2. 15IU/ml, β -葡萄糖苷酶活力為0. 68IU/ml。二、纖維質原料的獲取玉米芯提取木聚糖后的殘渣，主要成分為纖維素，其含量為79. 21 % (干基)，水分 含量為59. 92%，是一種很好的纖維素資源。同時，玉米芯堿抽提木聚糖的過程實際上也是 一個纖維質原料堿預處理的過程。因此，玉米芯經(jīng)堿抽提后，無需再預處理就可以作為纖維 低聚糖生產(chǎn)的原料，直接進行纖維素酶的水解。其原料的獲取過程如下1.稱取50g NaOH充分溶解于702ml蒸餾水中，加入粉碎粒度為0. 5 Icm的風干
5玉米芯112g (絕干100g)，于90°C下反應3h。2.上述反應物真空抽濾除去木聚糖抽提液，用500ml蒸餾水抽濾洗滌，棄去洗滌液。3.上述濾渣中加入300ml蒸餾水，用40% (w/v)的硫酸中和至pH值6 7，真空 抽濾，并用900ml蒸餾水分3次洗滌、抽濾，得到木聚糖生產(chǎn)廢渣。該木聚糖生產(chǎn)廢渣就是本技術所需要的纖維低聚糖生產(chǎn)原料；也可以用其他低聚 木糖生產(chǎn)廢渣、木糖渣、糠醛渣，或經(jīng)過適當預處理的其他纖維質原料；預處理的目的是提 高纖維質原料中纖維素對纖維素酶的可及度，可以采用物理、化學、生物或以上幾種方法聯(lián) 合應用的預處理方法。三、底物原位吸附_固液分離一步酶解法即CN 200910035998. 8《一種微生物酶法生產(chǎn)纖維低聚糖新工藝》中所公開的方 法，以經(jīng)過預處理的纖維質為原料、真菌纖維素酶為初始酶制劑，處理過程如下a.底物原位吸附——將纖維質原料與真菌纖維素酶混合，加入水，PH緩沖液或酸、 堿，混合至固液重量比為1 7 50，pH值為6 8，每克纖維素的纖維素酶用量為5 25FPIU/g，于5 25°C條件下?lián)u或機械攪拌10 60min ；b.固液分離拆分，棄去上清液；c.定向水解——在上述固液分離得到的渣中補加水，pH緩沖液或酸、堿，控制固液 重量比為1 7 50，pH值為4 6，在45 55°C的條件下?lián)u或機械攪拌12 36h;獲得 水解糖液。比較例低β -葡萄糖苷酶活力纖維素酶不分段水解木聚糖生產(chǎn)廢渣制備纖維低 聚糖采用上述三中所提供的方法進行酶解，測定定向水解后纖維低聚糖和葡萄糖含 量。纖維低聚糖得率及產(chǎn)品中纖維低聚糖占總糖百分數(shù)的對比數(shù)據(jù)見表1和表2。實施例1 低β -葡萄糖苷酶活力纖維素酶二段法水解木聚糖生產(chǎn)廢渣制備纖維 低聚糖兩段法水解分段時間分別為6+18、10+14、12+12、14+10、18+6h。具體實施步驟如 下分別取上述“三、底物原位吸附_固液分離一步酶解法”中，經(jīng)“底物原位吸附_固 液分離”拆分除去大量β "葡萄糖苷酶后的固體渣、補充水分和調節(jié)PH值得到的水解體系 5個，置于50°C、150轉/分的搖床中分別水解6、10、12、14、18h ；固液分離分別得到上清液 纖維低聚糖液146、145、149、149、149ml，在固液分離的沉淀物中分別加入用40%稀硫酸調 節(jié)PH值為4 6的水146、145、149、149、149ml，攪拌均勻后置于50°C、150轉/分的搖床中 繼續(xù)分別水解18、14、12、10、6h。測定上述一段固液分離上清液中和二段水解物中的葡萄糖 和纖維低聚糖含量。兩段法水解纖維低聚糖總得率及產(chǎn)品中纖維低聚糖占總糖百分數(shù)如表 1。糖液中萄萄糖濃度采用高效液相色譜法(HPLC)測定。色譜條件如下色譜儀 AgilentllOO 高效液相色譜儀；色譜柱Bio_Rad Aminex HPX-87H ；流動相0. 005mol/L 硫 酸，流速0. 6ml/min ；柱溫:55°C ；檢測器示差折光檢測器；進樣量=IOyL0外標法測定。糖液中纖維低聚糖濃度測定方法用4% (w/v)的硫酸于121°C條件下水解糖液
660min，使溶液中的纖維低聚糖水解成葡萄糖，用HPLC法測定經(jīng)稀硫酸水解后的葡萄糖濃 度；用糖液經(jīng)稀硫酸水解后的葡萄糖濃度減去糖液中起始葡萄糖濃度之差除以1. 1(纖維 低聚糖與單糖葡萄糖之間的轉換系數(shù))即可得到纖維低聚糖的含量。纖維低聚糖總得率指兩次水解所得的纖維低聚糖量與底物中纖維素量的比值。纖維低聚糖占總糖百分數(shù)指產(chǎn)物中纖維低聚糖量除以纖維低聚糖和葡萄糖量之 和。表1 二段水解與不分段水解技術制備纖維低聚糖的比較 結果表明，低β -葡萄糖苷酶活力纖維素酶兩段法水解木聚糖生產(chǎn)廢渣制備纖維 低聚糖，與不分段水解相比，酶對纖維低聚糖的選擇性基本不變，而纖維低聚糖得率有較大 幅度的提高。產(chǎn)物中纖維低聚糖占總糖的百分數(shù)在65%左右，而纖維低聚糖得率比不分段 水解時的纖維低聚糖得率提高9 12%，其中以10+14h兩段水解的效果為最佳。實施例2 低β _葡萄糖苷酶活力纖維素酶三段法水解木聚糖生產(chǎn)廢渣制備纖維 低聚糖三段法水解的分段水解時間分別為6+6+12、6+8+10、6+12+6，具體實施步驟如 下分別取上述“三、底物原位吸附_固液分離一步酶解法”中，經(jīng)底物原位吸附_固 液分離拆分除去大量β "葡萄糖苷酶后的固體渣、補充水分和調節(jié)PH值得到的水解體系3 個，置于50°C、150轉/分的搖床中分別水解6、6、6h ；固液分離分別得到上清液纖維低聚糖 液150、150、150ml，在固液分離沉淀物中分別加入用40%稀硫酸調節(jié)pH值為4 6的水 150、150、150ml，攪拌均勻后置于50°C、150轉/分的搖床中繼續(xù)分別水解6、8、12h ；固液分 離分別得到上清液纖維低聚糖液150、150、158ml，在固液分離沉淀物中分別加入用40%稀 硫酸調節(jié)PH值為4 6的水150、150、158ml，攪拌均勻后置于50°C、150轉/分的搖床中繼 續(xù)分別水解12、10、6h。測定上述一段、二段固液分離上清液中和三段水解物中的葡萄糖和 纖維低聚糖含量。三段法水解纖維低聚糖總得率及產(chǎn)品中葡萄糖占總糖的比例如表2。表2三段水解與不分段水解技術制備纖維低聚糖的比較
結果表明，低β -葡萄糖苷酶活力纖維素酶三段法水解木聚糖生產(chǎn)廢渣制備纖維 低聚糖，與不分段水解相比，酶對纖維低聚糖的選擇性基本不變，而纖維低聚糖得率有較大 幅度的提高。產(chǎn)物中纖維低聚糖占總糖的百分數(shù)在65%左右，而纖維低聚糖得率比不分段 水解時的纖維低聚糖得率提高20 23%，其中以6+6+12h三段法水解為最佳。適當增加水解的分段次數(shù)，理論上還可以提高纖維低聚糖的得率，但生產(chǎn)成本將 會增加。
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權利要求
一種提高酶法制備纖維低聚糖得率的方法，以底物原位吸附 固液分離法拆分纖維素酶系中的β 葡萄糖苷酶，通過固液分離除去大量β 葡萄糖苷酶后用于水解纖維質原料制備纖維低聚糖，其特征是水解進行一段時間以后，將水解物固液分離，分離所得的液相部分為纖維低聚糖液，向分離后的固相沉淀物中添加分離出的同等體積、pH值為4～6的水后繼續(xù)水解，如此循環(huán)重復，直至酶水解結束。
2.如權利要求1所述的提高酶法制備纖維低聚糖得率的方法，其特征是采用兩段水解 的工藝，第一次水解6 18小時，第二次水解18 6小時。
3.如權利要求1所述的提高酶法制備纖維低聚糖得率的方法，其特征是采用三段水解 的工藝，第一、二次分別水解6小時，第三次水解12小時。
全文摘要
一種提高酶法制備纖維低聚糖得率的方法，以底物原位吸附-固液分離法拆分纖維素酶系中的β-葡萄糖苷酶，通過固液分離除去大量β-葡萄糖苷酶后用于水解纖維質原料制備纖維低聚糖，其特征是采用分段水解的方法，在某一優(yōu)選的分段時間點將水解物固液分離，分離所得的液相部分為纖維低聚糖液，向分離后的固相沉淀物中添加分離出的同等體積、pH值為4～6的水后繼續(xù)水解，如此循環(huán)重復，直至酶水解結束。
文檔編號C12P19/14GK101914596SQ20101010975
公開日2010年12月15日 申請日期2010年2月10日 優(yōu)先權日2010年2月10日
發(fā)明者余世袁, 勇強, 徐勇, 王瑱瑱 申請人:南京林業(yè)大學