專(zhuān)利名稱(chēng)：綿羊bmpr-1b基因a746g多態(tài)性檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因分析檢測(cè)產(chǎn)品，更具體的說(shuō)是適用于綿羊BMPR-IB基因A746G多態(tài)性檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
基因芯片是近幾年在高科技領(lǐng)域內(nèi)出現(xiàn)的最具時(shí)代特征的重大科技進(jìn)展之一。它是將能反映樣本中大量基因信息的基因探針(寡核苷酸探針、cDNA克隆、PCR產(chǎn)物等)，有序固定在固相支持物(如醛基、氨基、巰基、羧基等活性基團(tuán)修飾的載玻片或硅片、尼龍膜、硝酸纖維素膜)上形成陣列，通過(guò)與實(shí)際樣本(或擴(kuò)增產(chǎn)物)進(jìn)行雜交反應(yīng)，只需一次實(shí)驗(yàn)， 就可高通量獲得所有待檢基因的信息。這種平行檢測(cè)、高信息通量的特點(diǎn)使其在基因表達(dá)、 基因多態(tài)性檢測(cè)等方面的應(yīng)用受到廣泛重視。綿羊多胎性狀是綿羊業(yè)多產(chǎn)，高產(chǎn)的基礎(chǔ)。綿羊的多胎性狀已經(jīng)引起國(guó)際動(dòng)物遺傳育種界的普遍重視。對(duì)于綿羊多胎基因突變位點(diǎn)的檢測(cè)國(guó)內(nèi)外也做了大量的工作，多采用檢測(cè)單個(gè)堿基的差異(或突變)來(lái)標(biāo)示其多態(tài)性，該工作重復(fù)勞動(dòng)多，消耗高，自動(dòng)化程度低，該手段目前已經(jīng)不適應(yīng)大規(guī)模、低消耗和自動(dòng)化的要求，應(yīng)用基因芯片方法檢測(cè)可以克服這些不足，而且隨著芯片技術(shù)的發(fā)展，其檢測(cè)速度、特異性和敏感性也不斷提高，尤其是第三代遺傳標(biāo)記單核苷酸多態(tài)(SNP)的出現(xiàn)，使得可以更方便快捷地應(yīng)用基因芯片進(jìn)行大規(guī)模多態(tài)性檢測(cè)。研究表明，BMPR-IB基因A746G為控制綿羊多胎性狀的基因位點(diǎn)。綿羊是季節(jié)性發(fā)情的動(dòng)物，排卵率和產(chǎn)羔率低，反映綿羊繁殖力的主要指標(biāo)產(chǎn)羔數(shù)的遺傳力平均僅為0.10左右。但是有些品種的綿羊卻有很高的排卵率，通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)， BMPR-IB基因?yàn)橹袊?guó)美利奴羊、小尾寒羊、湖羊等綿羊品種的高繁殖率和高產(chǎn)羔數(shù)主效基因，由于BMPR-IB基因B等位基因在綿羊群體中存在，使得這些羊群的繁殖率比較高。即 BMPR-IB基因的不同基因型能夠決定綿羊的產(chǎn)羔數(shù)。BMPR-IB基因在中國(guó)美利奴羊群中存在3種基因型，分別為AA、AB、BB三種基因型，三種基因型的存在是由于BMPR-IB基因在746 位點(diǎn)處A-G的堿基置換所致。其中其效應(yīng)表現(xiàn)為BB突變型即=BMPR-IB基因746位雙鏈的 A堿基均置換為G堿基，所述BB突變型綿羊平均排卵數(shù)增加3枚，每只母羊平均每胎能多產(chǎn) 1. 5只羔羊，一胎可以產(chǎn)3-5只羔羊；AB雜合型即=BMPR-IB基因746位點(diǎn)處一條鏈的A堿基置換為G堿基，所述AB雜合型羊與地方品種羊相比，平均排卵數(shù)增加1. 5枚，每只母羊平均每胎能多產(chǎn)1. 0只羔羊，一胎可以產(chǎn)2-3只羔羊；AA野生型即=BMPR-IB基因746位點(diǎn)處的堿基均沒(méi)有發(fā)生突變，所述AA野生型羊產(chǎn)羔數(shù)與地方品種羊接近，一胎可以產(chǎn)1-2只羔羊。因此，通過(guò)對(duì)母羊BMPR-IB基因的檢測(cè)，開(kāi)展BMPR-IB基因標(biāo)記輔助選擇，組建BB基因型綿羊群體，是快速提高綿羊繁殖力的一個(gè)有效方法，能夠使群體平均產(chǎn)羔數(shù)達(dá)到230%以上，極大的增加羔羊數(shù)量，增加養(yǎng)羊的經(jīng)濟(jì)效益。前期研究表明小尾寒羊大部分為BMPR-IB基因突變純合子，湖羊全部為BMPR-IB 基因突變純合子，而湖羊的雜交后代以雜合子AB為主。而在中國(guó)美利奴羊群體中存在BMPR-IB基因的三種基因型。目前，針對(duì)BMPR-IB基因的檢測(cè)，大多數(shù)研究人員采用PCR-RFLP技術(shù)，而PCR-RFLP 技術(shù)存在檢測(cè)速度慢，不能適應(yīng)在綿羊群體中開(kāi)展大規(guī)模、并行的檢測(cè)目的基因的要求。而利用基因芯片技術(shù)高通量地檢測(cè)綿羊BMPR-1B-746的基因型，將可以為畜牧業(yè)育種提供一種準(zhǔn)確、快速、價(jià)廉的基因檢測(cè)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確率高，可有效提高工作效率、經(jīng)濟(jì)實(shí)用的適用于檢測(cè)綿羊BMPR-IB基因A746G多態(tài)性的試劑盒以及提供一種可規(guī)模檢測(cè)、簡(jiǎn)便實(shí)用、大大提高工作效率的檢測(cè)方法。本發(fā)明公開(kāi)了一種綿羊BMPR-IB基因A746G多態(tài)性檢測(cè)試劑盒，其特征在于該試劑盒主要包括下列擴(kuò)增液、至少1張基因芯片、雜交緩沖液I和II、預(yù)雜交液、Taq酶、雜交顯色試劑；
所述的擴(kuò)增液中的每種擴(kuò)增液中分別包含以下系列下游引物SP1-SP12之一和公用上游引物QP:
SPl :<210>1、SP2: <210>2、SP3: <210>3、SP4: <210>4、SP5: <210>5、SP6: <210>6、SP7: <210>7、SP8: <210>8、SP9: <210>9、SP10: <210>10、SP11: <210>11、SP12: <210>12、QP: <210>13 ；
上述系列下游引物SP1-SP12均由5’端20nt的編碼序列和3’端21nt的特異序列組
成；
所述的基因芯片是將5’端帶氨基修飾和16聚脫氧胸苷酸的捕獲探針P1-P12分A、B 二個(gè)反應(yīng)區(qū)順序固定于醛基修飾的載玻片上制成，所述P1-P12的序列如下
PI: <210>14、P2: <210>15、P3: <210>16、P4: <210>17、P5: <210>18、P6: <210>19、 P7: <210>20、P8: <210>21、P9: <210>22、P10: <210>23、P11: <210>24、P12: <210>25 ； 以上捕獲探針的序列與相對(duì)應(yīng)的下游引物SP1-SP12的5’端20nt的編碼序列一致； 所述基因芯片的A、B兩個(gè)反應(yīng)區(qū)分別設(shè)有標(biāo)志列探針，所述標(biāo)志列探針序列為 <210>26 ；
所述的雜交緩沖液I和II中分別含有5’端帶有生物素或熒光基團(tuán)標(biāo)記的識(shí)別探針a和b，所述的生物素或熒光基團(tuán)用X表示，識(shí)別探針a和b的序列如下識(shí)別探針a <210>27、識(shí)別探針 b <210>280一種綿羊BMPR-IB基因A746G多態(tài)性的檢測(cè)方法，其特征在于主要包括以下步驟
(1)制備多個(gè)綿羊的染色體DNA備用；
(2)試劑盒組裝，其中主要包括分別裝有12種擴(kuò)增液的擴(kuò)增管，至少1張基因芯片， 雜交緩沖液I和II，預(yù)雜交液、Taq酶，雜交顯色試劑；
所述的12種擴(kuò)增液的每種擴(kuò)增液中分別包含以下系列下游引物SP1-SP12之一和公用上游引物QP:
SPl :<210>1、SP2: <210>2、SP3: <210>3、SP4: <210>4、SP5: <210>5、SP6: <210>6、SP7: <210>7、SP8: <210>8、SP9: <210>9、SP10: <210>10、SP11: <210>11、SP12:<210>12、QP: <210>13 ；
上述系列下游引物SP1-SP12均由5’端20nt的編碼序列和3’端21nt的特異序列組
成；
所述的基因芯片是將5’端帶氨基修飾和16聚脫氧胸苷酸的捕獲探針P1-P12分A、B 二個(gè)反應(yīng)區(qū)順序固定于醛基修飾的載玻片上制成，所述P1-P12的序列如下
PI: <210>14、P2: <210>15、P3: <210>16、P4: <210>17、P5: <210>18、P6: <210>19、 P7: <210>20、P8: <210>21、P9: <210>22、P10: <210>23、P11: <210>24、P12: <210>25 ； 以上捕獲探針的序列與相對(duì)應(yīng)的下游引物SP1-SP12的5’端20nt的編碼序列一致； 所述基因芯片的A、B兩個(gè)反應(yīng)區(qū)分別設(shè)有標(biāo)志列探針，所述標(biāo)志列探針序列為 <210>26 ；
所述的雜交緩沖液I和II中分別含有5’端帶有生物素或熒光基團(tuán)標(biāo)記的識(shí)別探針a和b，所述的生物素或熒光基團(tuán)用X表示，識(shí)別探針a和b的序列如下識(shí)別探針a <210>27、識(shí)別探針 b <210>280(3)用PCR方法擴(kuò)增在試劑盒中的每個(gè)擴(kuò)增管中加入一個(gè)綿羊的染色體DNA作為擴(kuò)增模板，用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR方法擴(kuò)增多個(gè)綿羊的BMPR-IB基因包含A746G的基因片段，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
(4)變性處理將所得到的各個(gè)擴(kuò)增管的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物變性處理，之后分別取一定體積的變性后擴(kuò)增產(chǎn)物，分別加入雜交緩沖液I和II中，混勻備用；
(5)預(yù)雜交及雜交先將基因芯片與預(yù)雜交液進(jìn)行預(yù)雜交、然后將上述備用的雜交緩沖液I和II分別與基因芯片的A和B反應(yīng)區(qū)域的捕獲探針P1-P12陣列雜交；
(6)雜交信號(hào)檢測(cè)進(jìn)行顯色處理后檢測(cè)基因芯片A和B反應(yīng)區(qū)域陣列的雜交信號(hào)。所述試劑盒的組裝包括預(yù)雜交液，在檢測(cè)過(guò)程中的雜交步驟之前進(jìn)行預(yù)雜交。所述的用PCR方法擴(kuò)增步驟中的退火溫度最好設(shè)置為53°C。所述的雜交步驟中的雜交溫度最好設(shè)置為46°C。制備用于PCR擴(kuò)增的綿羊染色體DNA的方法有很多，可以從全血中制備、也可以從組織樣本中制備。具體方法可參閱文獻(xiàn)(丁振諾，蘇明權(quán)主編.《臨床PCR基因診斷技術(shù)》， 世界圖書(shū)出版公司.1998年第一版)。用PCR方法擴(kuò)增染色體基因特定片段的方法已經(jīng)是本領(lǐng)域公知技術(shù)。其中本發(fā)明涉及的擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序可根據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)(KB穆里斯，F(xiàn).費(fèi)里，R.吉布斯等主編《PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)》，科學(xué)出版社.1998年)方法由使用者獨(dú)立完成。所述識(shí)別探針a和b的5’端帶有生物素或熒光基團(tuán)的標(biāo)記，所述標(biāo)記包括但不限于地高辛分子(DIG)、生物素分子(Bio)、熒光素及其衍生物分子(FITC等)、其他熒光分子(如Cy3、Cy5等)、堿性磷酸酶(AP)、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)等。這些標(biāo)記及其標(biāo)記方法以及各標(biāo)記物的檢測(cè)方法都已是本領(lǐng)域眾所周知的常規(guī)技術(shù)，也可以參照王申五主編的 《基因診斷技術(shù)-非放射性操作手冊(cè)》;J.薩姆布魯克，E. F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯主編，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，科學(xué)出版社，1995年；馬立人，蔣中華主編，《生物芯片》，北京化學(xué)工業(yè)出版社，2000，1-130。擴(kuò)增產(chǎn)物的變性可采用常規(guī)變性方法，如加熱至94 98°C，并保溫2 lOmin，然后迅速置于冰上。
所述基因芯片設(shè)計(jì)原理
控制綿羊多胎性狀的BMPR-IB基因在746處有一個(gè)單核苷酸多態(tài)性(A-G突變)，所以要遵循突變基因的引物和探針設(shè)計(jì)原理。另外考慮到每張芯片要檢測(cè)多只羊(暫定為12羊份/張)，以減少芯片制作及檢測(cè)成本。在本發(fā)明的基因芯片設(shè)計(jì)時(shí)采用了夾心雜交原理針對(duì)BMPR-IB基因A746G突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)識(shí)別探針(識(shí)別探針a和b)，當(dāng)識(shí)別探針帶Biotin標(biāo)記時(shí)，其中識(shí)別探針a識(shí)別 AA基因型，識(shí)別探針b識(shí)別BB基因型。將羊的BMPR-IB基因特異性探針(編號(hào)P1_P12，其中，P1-P12序列不同，用來(lái)區(qū)別12只綿羊個(gè)體)作為檢測(cè)探針P，檢測(cè)探針P點(diǎn)在基因芯片 A區(qū)域反應(yīng)區(qū)和B區(qū)域反應(yīng)區(qū)上制成陣列，檢測(cè)時(shí)將識(shí)別探針a、識(shí)別探針b分別與樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物(不帶標(biāo)記)一起加入到雜交緩沖溶液中與基因芯片雜交。此時(shí)基因芯片上將發(fā)生如圖1所示的夾心雜交即擴(kuò)增產(chǎn)物M位于捕獲探針P 和識(shí)別探針A/B的中間。①捕獲探針P1-P12 (每一樣品對(duì)應(yīng)不同的捕獲探針，用于區(qū)別不同樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物)按照?qǐng)D2的點(diǎn)陣模式固定在芯片L上；②用含編碼序列的下游引物 (SP1-SP12)與公用上游引物(QP)對(duì)模板DNA進(jìn)行PCR特異擴(kuò)增后，產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物M ；③ 將12個(gè)樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物混合后變性(平行做A、B兩管)，然后分別加入含有用Biotin (X) 標(biāo)記的識(shí)別探針a和b的雜交緩沖液中混勻，標(biāo)記為A、B兩管混合液，將兩管混合液分別加入同一張芯片上A、B兩個(gè)反應(yīng)區(qū)中進(jìn)行雜交反應(yīng)；④12個(gè)樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物M的3’端的編碼序列C與固定在芯片L上的特異性捕獲探針P1-P12互補(bǔ)(每一樣品對(duì)應(yīng)不同的捕獲探針，用于區(qū)別不同樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物)，在適合的溫度下，擴(kuò)增產(chǎn)物與捕獲探針進(jìn)行雜交。從而形成芯片-捕獲探針P-擴(kuò)增產(chǎn)物M的模式；⑤同時(shí)，12個(gè)樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物M的檢測(cè)位點(diǎn)序列(包含BMPR-1B-746位點(diǎn)的25bp序列)與識(shí)別探針a或b (帶Biotin標(biāo)記，用于區(qū)分 BMPR-1B-746位點(diǎn)的基因型)互補(bǔ)。在適合的雜交溫度下，若擴(kuò)增片段中含有與雜交緩沖液 A或B中帶Biotin標(biāo)記的識(shí)別探針a或b互補(bǔ)的序列，則與該Biotin標(biāo)記的識(shí)別探針a或 b雜交，使擴(kuò)增產(chǎn)物帶上Biotin標(biāo)記；⑥將Biotin標(biāo)記進(jìn)行顯色處理，如果擴(kuò)增產(chǎn)物M的檢測(cè)位點(diǎn)序列與識(shí)別探針a或b互補(bǔ)，即可檢測(cè)到信號(hào)。否則檢測(cè)不到信號(hào)。根據(jù)芯片上同一樣品對(duì)應(yīng)的A和B兩個(gè)陣列上檢測(cè)位點(diǎn)的信號(hào)強(qiáng)度來(lái)判斷每一樣品的基因型。若檢測(cè)樣品的BMPR-IB基因型為AA型，則擴(kuò)增產(chǎn)物M的一端將與野生型的識(shí)別探針a雜交而帶上Biotin標(biāo)記，將Biotin標(biāo)記進(jìn)行顯色處理，即可檢測(cè)到信號(hào)。同理，如果羊的BMPR-IB基因型為AB型，經(jīng)PCR擴(kuò)增，其擴(kuò)增產(chǎn)物M為AA型和BB型的混合物，該擴(kuò)增產(chǎn)物M的會(huì)同時(shí)和AA型以及BB型的識(shí)別探針a和識(shí)別探針b雜交，因而在探針的這兩個(gè)位置均會(huì)有雜交信號(hào)出現(xiàn)。如果羊的BMPR-IB基因型為BB型，則其擴(kuò)增產(chǎn)物的一端會(huì)與BB 型識(shí)別探針b雜交，因而經(jīng)顯色處理，即可檢測(cè)到信號(hào)。所述基因芯片的雜交與顯色方法
雜交緩沖液與基因芯片雜交時(shí)，可以先將基因芯片與預(yù)雜交液進(jìn)行預(yù)雜交。本發(fā)明擴(kuò)增產(chǎn)物與基因芯片之間的固相雜交可以按照本領(lǐng)域的常規(guī)方法進(jìn)行。本發(fā)明所述檢測(cè)基因芯片雜交信號(hào)的方法是基于與抗生物素抗體或親合素或鏈親合素復(fù)合在一起的堿性磷酸酶或辣根過(guò)氧化物酶催化的四氮唑藍(lán)(NBT)和 5-溴-4-氯-3-吲哚酚-磷酸-4-甲苯胺鹽(BCIP)或四甲基聯(lián)苯胺(TMB)的顯色反應(yīng)。本發(fā)明實(shí)施例中的檢測(cè)識(shí)別探針采用Biotin標(biāo)記，Biotin標(biāo)記的檢測(cè)目前大多采用顯色檢測(cè)。顯色方法主要有堿性磷酸酶(AP)催化的NBT/BCIP顯色反應(yīng)和辣根過(guò)氧化物酶(HRP)催化的鄰-聯(lián)茴香胺或四甲基聯(lián)苯胺的顯色反應(yīng)。由于AP體系的靈敏度高于 HRP體系大約10倍，本發(fā)明實(shí)施例中采用AP顯色體系
首先，檢測(cè)識(shí)別探針上的Biotin先與鏈親和素堿性磷酸酶復(fù)合物(Sti^ptavidin-AP) 反應(yīng)，生成新的復(fù)合物=Biotin-Mr印tavidin-AP，后者發(fā)生如下的顯色反應(yīng) Biotin-Streptavidin-AP + BCI-P — BCI-OH + Pi CpH 7. 5) BCI-OH + NBT — 藍(lán)紫色沉淀
其中，BCIP 為 5 溴-4 氯-3 吲哚磷酸(5-bromo-4chloro-3indolylphosphate) ；NBT 為硝基四氮唑藍(lán)(nitro blue tetrazolium)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)
(1)芯片檢測(cè)過(guò)程中，PCR產(chǎn)物的特異性、雜交探針的特異性、標(biāo)記物的靈敏度、雜交最適溫度、質(zhì)控點(diǎn)以及雜交檢測(cè)過(guò)程中嚴(yán)謹(jǐn)?shù)南礈觳僮鞫汲蔀榛蛐酒晒z測(cè)的關(guān)鍵因素。因此在設(shè)計(jì)芯片時(shí)，每一個(gè)樣本都設(shè)置了標(biāo)志列，對(duì)芯片的點(diǎn)樣質(zhì)量、檢測(cè)試劑的有效性及檢測(cè)中每一步的操作正確性進(jìn)行控制。采用夾心雜交原理，經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，篩選出 12對(duì)合適的引物，能夠在53°C的退火溫度下，同時(shí)一次性完成一批樣本的PCR擴(kuò)增。根據(jù) 12對(duì)合適的引物設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)的探針，確定最佳雜交溫度為46°C，所設(shè)計(jì)的12對(duì)引物、12條捕獲探針和2條識(shí)別探針能夠保證檢測(cè)的準(zhǔn)確性。以上檢測(cè)試劑盒中所包含的PCR擴(kuò)增、芯片雜交、顯色、檢測(cè)過(guò)程能夠準(zhǔn)確檢測(cè)綿羊多胎性狀主效基因BMPR-IB基因的不同基因型，從而能夠?qū)崿F(xiàn)準(zhǔn)確、快速、并行的綿羊多胎性狀主效基因標(biāo)記輔助育種。(2)以上部分BMPR-IB基因PCR產(chǎn)物經(jīng)生工生物(上海)有限公司測(cè)序驗(yàn)證。測(cè)序圖譜見(jiàn)圖5，基因芯片檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序結(jié)果完全符合。(3)基因芯片探針之間的特異性
圖3表明，12個(gè)實(shí)驗(yàn)樣本，存在3種基因型(AA、AB、BB)，通過(guò)基因芯片檢測(cè)，以及與測(cè)序結(jié)果比較，不同基因型樣本之間沒(méi)有發(fā)生交叉雜交的現(xiàn)象，芯片檢測(cè)的背景均一，說(shuō)明設(shè)計(jì)的每一個(gè)探針的特異性高。(4)芯片檢測(cè)的重復(fù)性
從480只中國(guó)美利奴(新疆軍墾型)羊中隨機(jī)選出30只羊，每一只羊的基因組DNA樣本至少用兩對(duì)引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再用基因芯片檢測(cè)，結(jié)果表明所有樣本經(jīng)多次檢測(cè)，分析結(jié)果都相同，重復(fù)率高，說(shuō)明探針設(shè)計(jì)合理，芯片檢測(cè)結(jié)果可靠。(5)為了進(jìn)一步證明基因芯片分析結(jié)果的可靠性，實(shí)驗(yàn)中同時(shí)應(yīng)用基因芯片檢測(cè)試劑盒和傳統(tǒng)的PCR-RFLP (限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性)對(duì)480只中國(guó)美利奴(新疆軍墾型)羊進(jìn)行BMPR-IB基因檢測(cè)，對(duì)比分析，兩種方法檢測(cè)BMPR-IB基因的基因型結(jié)果均一致，芯片檢測(cè)準(zhǔn)確率達(dá)到100%，其中AA基因型個(gè)體數(shù)為238只，AB基因型個(gè)體數(shù)為202只，BB個(gè)體數(shù)為40只，說(shuō)明設(shè)計(jì)的基因芯片檢測(cè)綿羊多胎主效基因BMPR-IB基因是可行的。本發(fā)明提供的試劑盒，可用于檢測(cè)綿羊BMPR-IB基因A746G多態(tài)性，從而實(shí)現(xiàn)綿羊多胎性狀的高效、價(jià)廉檢測(cè)，為畜牧生產(chǎn)中高繁殖力種羊的篩選提供必要信息；本發(fā)明提供的檢測(cè)方法可實(shí)現(xiàn)規(guī)?；⒉⑿袡z測(cè)，簡(jiǎn)便實(shí)用，大大提高了工作效率。


圖1為本發(fā)明試劑盒的檢測(cè)原理示意圖，如圖1所示，本試劑盒采用的工作原理: 含編碼序列的上游引物與公用下游引物對(duì)模板DNA進(jìn)行特異擴(kuò)增后產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物M，其 3’端的編碼序列C與固定在芯片L上的特異性捕獲探針P互補(bǔ)(每一樣品對(duì)應(yīng)不同的捕獲探針，用于區(qū)別不同樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物)，其擴(kuò)增片段的檢測(cè)位點(diǎn)序列與識(shí)別探針a或b (帶 Biotin標(biāo)記，用于區(qū)分BMPR-1B-746基因型)互補(bǔ)。將各樣品擴(kuò)增產(chǎn)物混合后變性(平行做兩管)，然后分別加入含Biotin標(biāo)記識(shí)別探針a和b的雜交緩沖液中混勻，在同一張芯片上A、B兩個(gè)不同的反應(yīng)區(qū)(兩個(gè)反應(yīng)區(qū)的陣列及各信號(hào)點(diǎn)分別對(duì)應(yīng)的探針一致)中進(jìn)行雜交反應(yīng)。每個(gè)樣品對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物，其3’端會(huì)與芯片上的捕獲探針雜交，若該擴(kuò)增片段中含有與雜交緩沖液A或B中帶Biotin標(biāo)記的識(shí)別探針a或b互補(bǔ)的序列，則與該Biotin標(biāo)記的識(shí)別探針a或b雜交，使擴(kuò)增產(chǎn)物帶上 Biotin標(biāo)記。將Biotin標(biāo)記進(jìn)行顯色處理，即可檢測(cè)到信號(hào)。否則檢測(cè)不到信號(hào)。根據(jù)芯片上同一樣品對(duì)應(yīng)的A和B兩個(gè)陣列上檢測(cè)位點(diǎn)的信號(hào)強(qiáng)度來(lái)判斷每一樣品的基因型。圖2為特異性捕獲探針的基因芯片點(diǎn)陣模式示意圖，圖中所示左半部分區(qū)域?yàn)锳 反應(yīng)區(qū)，右半部分區(qū)域?yàn)锽反應(yīng)區(qū)，“標(biāo)”為標(biāo)志列。圖3為用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)12只綿羊BMPR-IB基因A746G多態(tài)性所得結(jié)果示意圖。圖4為綿羊BMPR-IB基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中M為pUC19 DNA/ MspI (HpaII) Marker，1_12為BMPR-IB基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，C為空白對(duì)照，從圖上可見(jiàn)，有 139bp的擴(kuò)增帶，空白對(duì)照無(wú)條帶，證明設(shè)計(jì)的引物及PCR條件能夠正確擴(kuò)增BMPR-IB基因。圖5為對(duì)實(shí)施例1中1號(hào)與5號(hào)綿羊樣本BMPR-IB基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序圖譜，如圖5所示，左邊測(cè)序圖為1號(hào)樣本經(jīng)PCR擴(kuò)增及測(cè)序，證明在BMPR-IB基因746處堿基為A，對(duì)應(yīng)BMPR-IB基因型為AA基因型；右邊測(cè)序圖為5號(hào)樣本經(jīng)PCR擴(kuò)增及測(cè)序，證明在BMPR-IB基因746處堿基為G JfSBMPR-IB基因型為BB基因型；經(jīng)對(duì)比，基因芯片檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序結(jié)果完全符合。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
參考圖1 一圖5，下面結(jié)合附圖對(duì)實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案，本實(shí)施例實(shí)施步驟如下
一、制備多個(gè)綿羊的染色體DNA備用
(1)采集本方法適用于EDTA抗凝的全血樣本。采集被檢測(cè)綿羊靜脈血0. 5ml，用一次性無(wú)菌注射針頭抽取，收集于含ΙΟΟμΙ的m EDTA溶液的無(wú)菌1. 5ml離心管中，蓋上管蓋， 上下顛倒數(shù)次使混勻。(2)存放血樣在2-8°C保存，保存期不應(yīng)超過(guò)3周；在-20°C保存期半年，-80°C可長(zhǎng)期保存，但嚴(yán)禁反復(fù)凍融。(3)運(yùn)輸用冰壺加冰或泡沫箱加干冰密封運(yùn)輸。(4)利用上海百傲科技有限公司生產(chǎn)的“血細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒”，該產(chǎn)品編號(hào)BST01013，按說(shuō)明書(shū)提取綿羊基因組DNA備用。
二、試劑盒組裝，其中包括分別裝有12種擴(kuò)增液的擴(kuò)增管，1張基因芯片，預(yù)雜交液，雜交緩沖液I和II，Taq酶，雜交顯色試劑；
所述的12種擴(kuò)增液的每種擴(kuò)增液中分別包含以下系列下游引物SP1-SP12之一和公用上游引物QP:
SPl :<210>1、SP2: <210>2、SP3: <210>3、SP4: <210>4、SP5: <210>5、SP6: <210>6、SP7: <210>7、SP8: <210>8、SP9: <210>9、SP10: <210>10、SP11: <210>11、SP12: <210>12、QP: <210>13 ；
上述系列下游引物SP1-SP12均由5，端20nt的編碼序列和3，端21nt的特異序列組
成；
所述的基因芯片是將5’端帶氨基修飾和16聚脫氧胸苷酸的捕獲探針P1-P12分A、B 二個(gè)反應(yīng)區(qū)順序固定于醛基修飾的載玻片上制成的，所述P1-P12的編碼序列如下
PI: <210>14、P2: <210>15、P3: <210>16、P4: <210>17、P5: <210>18、P6: <210>19、 P7: <210>20、P8: <210>21、P9: <210>22、P10: <210>23、P11: <210>24、P12: <210>25 ； 以上捕獲探針的編碼序列與相對(duì)應(yīng)的下游引物SP1-SP12的5，端20nt的編碼序列一
致；
所述基因芯片的A、B兩個(gè)反應(yīng)區(qū)分別設(shè)有標(biāo)志列探針，所述標(biāo)志列探針序列為 <210>26 ；
所述的雜交緩沖液I和II中分別含有5’端帶有生物素或熒光基團(tuán)標(biāo)記的識(shí)別探針a 和b，所述的生物素或熒光基團(tuán)用X表示，識(shí)別探針a和b的編碼序列如下識(shí)別探針a <210>27、識(shí)別探針 b <210>280三、用PCR方法擴(kuò)增BMPR-IB基因含A746G位點(diǎn)的基因片斷
1、合成公用上游引物(QP)和下游引物(SP1-SP12)即<210>1-<210>13
SPl5'tRCtRCtaRCatRCCRaCRtaatctgtgattaggtacagtt3SP25'tgcagcatRctaRccgacgt aatctgtRattaRRtacaRtt3SP35'tgcagcaacRttgccgagctaatctgtgattaggtacagtt3SP45'tgcagctaRcatcgcgacgtaatctgtgattaggtacagtt3SP55'tgcagctgacatgccgaggtaatctgtgattaggtacagtt3SP65'tgcagctaRcaRtccgacctaatctgtgattaggtacagtt3SP75'tgcagctRRcataccgacgaaatctgtgattaggtacagtt3SP85'tgcagccaRcatgtcgacgtaatctgtgattaggtacagtt3SP95'tcgagctaRactgccgacgtaatctgtgattaggtacagtt3SPlO 5'tgcagcctRattgccgacgtaatctgtgattaggtacagtt3SPll 5'tgcagctaRCCRtacgacgtaatctgtgattaggtacagtt3SP12: 5，tgcagctacRRtaccgacgtaatctgtgattaggtacagtt3QP:5，gtt ccg aga gac aga aat ata tc 3'
上述系列下游引物(SP1-SP12)均由5，端20nt的編碼序列和3，端21nt的特異序列組成。其中下游引物劃線(xiàn)部分的序列與相應(yīng)的捕獲探針序列一致，序列中堿基不同主要用于區(qū)別不同的12個(gè)樣本。下游引物方框中的序列與BMPR-IB基因編碼序列互補(bǔ)。
合成的引物序列用去離子水溶解并稀釋至ΙΟμπιοΙ/l的使用液濃度。
2、PCR擴(kuò)增目的基因片斷
試劑組成Taq酶產(chǎn)品編號(hào)ET101-02-01，天根生化科技(北京)有限公司 IOXTaq Buffer 含預(yù)混Mg2+，產(chǎn)品編號(hào)ET101-02-01，天根生化科技(北京)有限公
司
dNTP (各2. 5 mM, N=A, T，C，G)產(chǎn)品編號(hào)D0056,生工生物(上海)有限公司 Y-I 擴(kuò)增液:1μ 1 上游引物 QP, 1 μ 1 下游引物 SP1，2. 5μ 1 IOXTaq Buffer，2. 5 μ 1 dNTP, 14 μ 1去離子水
Υ-2 擴(kuò)增液:1 μ 1 上游引物 QP，ly 1 下游引物 SP2，2. 5μ 1 IOXTaq Buffer,2. 5μ 1 dNTP, 14 μ 1去離子水，共21 μ 1混合液
Υ-3 擴(kuò)增液:1 μ 1 上游引物 QP，lP 1 下游引物 SP3，2. 5μ 1 IOXTaq Buffer，2. 5 μ 1 dNTP, 14 μ 1去離子水，共21 μ 1混合液
Υ-4 擴(kuò)增液:1 μ 1 上游引物 QP，ly 1 下游引物 SP4，2. 5 μ 1 IOXTaq Buffer，2. 5 μ 1 dNTP, 14 μ 1去離子水，共21 μ 1混合液
Υ-5 擴(kuò)增液:1 μ 1 上游引物 QP，lP 1 下游引物 SP5，2. 5μ 1 IOXTaq Buffer，2. 5 μ 1 dNTP, 14 μ 1去離子水，共21 μ 1混合液
Υ-6 擴(kuò)增液:1 μ 1 上游引物 QP，lP 1 下游引物 SP6，2. 5μ 1 IOXTaq Buffer，2. 5 μ 1 dNTP, 14 μ 1去離子水，共21 μ 1混合液
Υ-7 擴(kuò)增液:1 μ 1 上游引物 QP, 1 μ 1 下游引物 SP7，2. 5μ 1 IOXTaq Buffer，2. 5 μ 1 dNTP, 14 μ 1去離子水，共21 μ 1混合液
Υ-8 擴(kuò)增液1 μ 1 上游引物 QP，1 μ 1 下游引物 SP8，2. 5 μ 1 IOXTaq Buffer, 2. 5 μ 1 dNTP, 14 μ 1去離子水，共21 μ 1混合液
Υ-9 擴(kuò)增液1 μ 1 上游引物 QP，1 μ 1 下游引物 SP9，2. 5 μ 1 IOXTaq Buffer, 2. 5 μ 1 dNTP, 14 μ 1去離子水，共21 μ 1混合液
Y-IO 擴(kuò)增液:1μ 1 上游引物 QP，ly 1 下游引物 SP10，2. 5 μ 1 IOXTaq Buffer，2. 5 μ 1 dNTP, 14 μ 1去離子水，共21 μ 1混合液
Y-Il 擴(kuò)增液:1μ 1 上游引物 QP，ly 1 下游引物 SPll，2. 5μ 1 IOXTaq Buffer，2. 5 μ 1 dNTP, 14 μ 1去離子水，共21 μ 1混合液
Υ-12 擴(kuò)增液:1 μ 1 上游引物QP，ly 1 下游引物 SP12，2. 5 μ 1 IOXTaq Buffer，2. 5 μ 1 dNTP, 14 μ 1去離子水，共21 μ 1混合液
瓊脂糖產(chǎn)品編號(hào)ΑΒ0014，生工生物(上海)有限公司
DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量pUC19 DNA/MspI (HpaII) Marker，產(chǎn)品編號(hào)SM0221，生工生物(上海) 有限公司操作步驟
(1)從試劑盒中取出Y-I至Y12擴(kuò)增液和Taq酶，3000 Xg離心數(shù)30 sec,使液體流回管底；分別在每管中加入Taq酶( υ/μ1)1μ1。(2)分別在Y-I擴(kuò)增液到Υ-12擴(kuò)增液管中各加入提取的相應(yīng)基因組DNA 3μ1，總體積25μ1，混勻。(3)用PCR擴(kuò)增儀(Tc-25/H PCR擴(kuò)增儀，杭州大和熱磁電子有限公司)按下列條件擴(kuò)增94°C 5min ；94°C 25sec，53°C 25sec，72°C 25sec，40 個(gè)循環(huán)；72°C 5min。
(4)配制1. 5%的瓊脂糖凝膠，取各管PCR擴(kuò)增產(chǎn)物各5μ1，以100V恒定電壓，30min 電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增的BMPR-IB基因片斷，對(duì)PCR產(chǎn)物測(cè)序。圖4為PCR產(chǎn)物電泳圖，其中M 為 pUC19 DNA/MspI (HpaII) Marker, 1-12 為 BMPR-IB 基因 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，C 為空白對(duì)照， 從圖4可見(jiàn)，有139bp的擴(kuò)增帶，空白對(duì)照無(wú)條帶。證明設(shè)計(jì)的引物及PCR條件能夠正確擴(kuò)增目的基因。四、PCR產(chǎn)物與基因芯片的雜交
利用本發(fā)明試劑盒中的雜交緩沖液I和II以及采用上海百傲科技有限公司的芯片雜交試劑盒中所包含的預(yù)雜交液、洗液1、反應(yīng)艙進(jìn)行雜交試驗(yàn)。所述芯片雜交試劑盒(產(chǎn)品編號(hào)BST05010，上海百傲科技有限公司)
所述的雜交緩沖液I和II中分別含有5’端帶有生物素或熒光基團(tuán)標(biāo)記的識(shí)別探針a 和b，所述的生物素或熒光基團(tuán)用X表示，識(shí)別探針a和b的序列如下
識(shí)別探針 a 為 <210>27 5' X- ctc ate aac acc gtc tga tat att t 3' 識(shí)另Ij探針 b 為 <210>28 5' X- ctc ate aac acc gtc cga tat att t 3' 識(shí)別探針的序列與BMPR-IB基因含A746G位點(diǎn)處25bp編碼序列互補(bǔ)，方框中的堿基對(duì)應(yīng)A746G位點(diǎn)，其中，t堿基對(duì)應(yīng)A等位基因，c堿基對(duì)應(yīng)B等位基因。1、取12管PCR擴(kuò)增產(chǎn)物各4μ1，加至0.2ml的薄壁管中(自備)，分別制備2管PCR 擴(kuò)增混合物，98°C熱變性5min，取出后迅速放入冰盒，-20°C放置備用。2、取出基因芯片，做好樣品編號(hào)，在A、B雜交艙中各加滿(mǎn)預(yù)雜交液溶液(約 Ι ομ )，于46°C靜置5min，將雜交艙中的溶液吸除干凈；
3、從雜交緩沖液I(含有識(shí)別探針a，濃度為IOOpM)中吸出70μ1溶液，加到已變性的一管PCR擴(kuò)增混合物中，混勻，將混合液小心加入芯片上的A雜交艙中，加液時(shí)應(yīng)注意無(wú)氣泡產(chǎn)生；
4、從雜交緩沖液II(含有識(shí)別探針b，濃度為IOOpM)中吸出70μ1溶液，加到已變性的另一管PCR擴(kuò)增混合物中，混勻，將混合液小心加入芯片上的B雜交艙中，加液時(shí)應(yīng)注意無(wú)氣泡產(chǎn)生；
5、將基因芯片迅速放入46°C恒溫箱中，保溫30min。從洗液1中吸出700μ1洗液1置 1. 5ml離心管中，于46°C恒溫箱中預(yù)熱；
6、從恒溫箱中取出基因芯片，吸除A、B雜交艙中溶液；
7、在A、B雜交艙中各加入ΙΙΟμΙ已預(yù)熱的洗液1，46°C保溫5min，然后將雜交艙中溶液吸除干凈。再重復(fù)此步驟兩次。五、基因芯片雜交信號(hào)的顯色
本實(shí)施例試劑盒中的雜交顯色試劑采用上海百傲科技有限公司的芯片顯色試劑盒進(jìn)行顯色試驗(yàn)。所述芯片顯色試劑盒(產(chǎn)品編號(hào)BST06010，上海百傲科技有限公司)包含 抗體液，洗液2，洗液3，顯色液。1、在A、B雜交艙中分別加入ΙΙΟμΙ洗液2溶液，室溫放置^iiin ；
2、將雜交艙中溶液吸除干凈，向A、B雜交艙中分別加入ΙΙΟμΙ抗體液溶液，室溫放置 20min ；
3、將雜交艙中溶液吸除干凈，向A、B雜交艙中分別加入ΙΙΟμΙ洗液2溶液，室溫靜置 anin。再重復(fù)此步一次；4、將雜交艙中溶液吸除干凈，向A、B雜交艙中分別加入ΙΙΟμΙ洗液3溶液，室溫放置 Imin ；
5、將雜交艙中溶液吸除干凈，向Α、Β雜交艙中分別加入ΙΙΟμΙ顯色液溶液，46°C避光放置 40mino六、基因芯片雜交信號(hào)的檢測(cè)
1、吸除A、B雜交艙中溶液，小心揭除雜交艙，將顯色載玻片顯色區(qū)小心用蒸餾水沖洗一下，置46°C烘干；
2、將顯色載玻片面朝下扣在BaiO BE-2. 0生物芯片識(shí)讀儀(Cat# BSE 01011 )的片槽上檢測(cè)，具體操作見(jiàn)儀器使用說(shuō)明。圖3為得到的檢測(cè)圖像，經(jīng)Array Doctor 2. 0軟件分析可自動(dòng)輸出檢測(cè)結(jié)果
1號(hào)樣本，2號(hào)樣本，7號(hào)樣本，8號(hào)樣本為BMPR-1B基因746AA純合子； 3號(hào)樣本，4號(hào)樣本，9號(hào)樣本，10號(hào)樣本為=BMPR-IB基因746AB雜合子； 5號(hào)樣本，6號(hào)樣本，11號(hào)樣本，12號(hào)樣本為=BMPR-IB基因746BB純合子。對(duì)檢測(cè)結(jié)果的分析如下
(1)芯片檢測(cè)過(guò)程中，PCR產(chǎn)物的特異性、雜交探針的特異性、標(biāo)記物的靈敏度、雜交最適溫度、質(zhì)控點(diǎn)以及雜交檢測(cè)過(guò)程中嚴(yán)謹(jǐn)?shù)南礈觳僮鞫汲蔀榛蛐酒晒z測(cè)的關(guān)鍵因素。因此在設(shè)計(jì)芯片時(shí)，每一個(gè)樣本都設(shè)置了標(biāo)志列，對(duì)芯片的點(diǎn)樣質(zhì)量、檢測(cè)試劑的有效性及檢測(cè)中每一步的操作正確性進(jìn)行控制。采用夾心雜交原理，經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，篩選出 12對(duì)合適的引物，能夠在53°C的退火溫度下，同時(shí)一次性完成一批樣本的PCR擴(kuò)增。根據(jù) 12對(duì)合適的引物設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)的探針，確定最佳雜交溫度為46°C，所設(shè)計(jì)的12對(duì)引物、12條捕獲探針和2條識(shí)別探針能夠保證檢測(cè)的準(zhǔn)確性。以上檢測(cè)試劑盒中所包含的PCR擴(kuò)增、芯片雜交、顯色、檢測(cè)過(guò)程能夠準(zhǔn)確檢測(cè)綿羊多胎性狀主效基因BMPR-IB基因的不同基因型，從而能夠?qū)崿F(xiàn)準(zhǔn)確、快速、并行的綿羊多胎性狀主效基因標(biāo)記輔助育種。(2)以上部分BMPR-IB基因PCR產(chǎn)物經(jīng)生工生物(上海)有限公司測(cè)序驗(yàn)證。測(cè)序圖譜見(jiàn)圖5，基因芯片檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序結(jié)果完全符合。(3)基因芯片探針之間的特異性
圖3表明，12個(gè)實(shí)驗(yàn)樣本，存在3種基因型(AA、AB、BB)，通過(guò)基因芯片檢測(cè)，以及與測(cè)序結(jié)果比較，不同基因型樣本之間沒(méi)有發(fā)生交叉雜交的現(xiàn)象，芯片檢測(cè)的背景均一，說(shuō)明設(shè)計(jì)的每一個(gè)探針的特異性高。(4)芯片檢測(cè)的重復(fù)性
從480只中國(guó)美利奴(新疆軍墾型)羊中隨機(jī)選出30只羊，每一只羊的基因組DNA樣本至少用兩對(duì)引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再用基因芯片檢測(cè)，結(jié)果表明所有樣本經(jīng)多次檢測(cè)，分析結(jié)果都相同，重復(fù)率高，說(shuō)明探針設(shè)計(jì)合理，芯片檢測(cè)結(jié)果可靠。(5)為了進(jìn)一步證明基因芯片分析結(jié)果的可靠性，實(shí)驗(yàn)中同時(shí)應(yīng)用基因芯片檢測(cè)試劑盒和傳統(tǒng)的PCR-RFLP (限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性)對(duì)480只中國(guó)美利奴(新疆軍墾型)羊進(jìn)行BMPR-IB基因檢測(cè)，對(duì)比分析，兩種方法檢測(cè)BMPR-IB基因的基因型結(jié)果均一致，芯片檢測(cè)準(zhǔn)確率達(dá)到100%，其中AA基因型個(gè)體數(shù)為238只，AB基因型個(gè)體數(shù)為202只，BB個(gè)體數(shù)為40只，說(shuō)明設(shè)計(jì)的基因芯片檢測(cè)綿羊多胎主效基因BMPR-IB基因是可行的。
上述實(shí)施例是提供給熟悉本領(lǐng)域內(nèi)的人員來(lái)實(shí)現(xiàn)或使用本發(fā)明的，熟悉本領(lǐng)域的人員可在不脫離本發(fā)明的發(fā)明思想的情況下，對(duì)上述實(shí)施例做出種種修改或變化，因而本發(fā)明的保護(hù)范圍并不被上述實(shí)施例所限，而應(yīng)該是符合權(quán)利要求書(shū)提到的創(chuàng)新性特征的最大范圍。實(shí)施例2
本實(shí)施例具體檢測(cè)方法參照實(shí)施例1，其不同地方在于本實(shí)施例試劑盒組成如下表所示
權(quán)利要求
1.一種綿羊BMPR-IB基因A746G多態(tài)性檢測(cè)試劑盒，其特征在于該試劑盒主要包含下列擴(kuò)增液、至少1張基因芯片、雜交緩沖液I和II、預(yù)雜交液、Taq酶、雜交顯色試劑；所述的擴(kuò)增液中的每種擴(kuò)增液中分別包含以下系列下游引物SP1-SP12之一和公用上游引物QP:SPl :<210>1、SP2: <210>2、SP3: <210>3、SP4: <210>4、SP5: <210>5、SP6: <210>6、SP7: <210>7、SP8: <210>8、SP9: <210>9、SP10: <210>10、SP11: <210>11、SP12: <210>12、QP: <210>13 ；上述系列下游引物SP1-SP12均由5’端20nt的編碼序列和3’端21nt的特異序列組成；所述的基因芯片是將5’端帶氨基修飾和16聚脫氧胸苷酸的捕獲探針P1-P12分A、B 二個(gè)反應(yīng)區(qū)順序固定于醛基修飾的載玻片上制成，所述P1-P12的序列如下PI: <210>14、P2: <210>15、P3: <210>16、P4: <210>17、P5: <210>18、P6: <210>19、 P7: <210>20、P8: <210>21、P9: <210>22、P10: <210>23、P11: <210>24、P12: <210>25 ； 以上捕獲探針的序列與相對(duì)應(yīng)的下游引物SP1-SP12的5’端20nt的編碼序列一致； 所述基因芯片的A、B兩個(gè)反應(yīng)區(qū)分別設(shè)有標(biāo)志列探針，所述標(biāo)志列探針序列為 <210>26 ；所述的雜交緩沖液I和II中分別含有5’端帶有生物素或熒光基團(tuán)標(biāo)記的識(shí)別探針a 和b，所述的生物素或熒光基團(tuán)用X表示，識(shí)別探針a和b的序列如下 識(shí)別探針a :<210>27、識(shí)別探針b <210>280
2.一種綿羊BMPR-IB基因A746G多態(tài)性的檢測(cè)方法，其特征在于主要包括以下步驟(1)制備多個(gè)綿羊的染色體DNA備用；(2)試劑盒組裝，其中主要包括分別裝有12種擴(kuò)增液的擴(kuò)增管，至少1張基因芯片， 雜交緩沖液I和II，預(yù)雜交液、Taq酶，雜交顯色試劑；所述的12種擴(kuò)增液的每種擴(kuò)增液中分別包含以下系列下游引物SP1-SP12之一和公用上游引物QP:SPl :<210>1、SP2: <210>2、SP3: <210>3、SP4: <210>4、SP5: <210>5、SP6: <210>6、SP7: <210>7、SP8: <210>8、SP9: <210>9、SP10: <210>10、SP11: <210>11、SP12: <210>12、QP: <210>13 ；上述系列下游引物SP1-SP12均由5’端20nt的編碼序列和3’端21nt的特異序列組成；所述的基因芯片是將5’端帶氨基修飾和16聚脫氧胸苷酸的捕獲探針P1-P12分A、B 二個(gè)反應(yīng)區(qū)順序固定于醛基修飾的載玻片上制成，所述P1-P12的序列如下PI: <210>14、P2: <210>15、P3: <210>16、P4: <210>17、P5: <210>18、P6: <210>19、 P7: <210>20、P8: <210>21、P9: <210>22、P10: <210>23、P11: <210>24、P12: <210>25 ； 以上捕獲探針的序列與相對(duì)應(yīng)的下游引物SP1-SP12的5’端20nt的編碼序列一致； 所述基因芯片的A、B兩個(gè)反應(yīng)區(qū)分別設(shè)有標(biāo)志列探針，所述標(biāo)志列探針序列為 <210>26 ；所述的雜交緩沖液I和II中分別含有5’端帶有生物素或熒光基團(tuán)標(biāo)記的識(shí)別探針a和b，所述的生物素或熒光基團(tuán)用X表示，識(shí)別探針a和b的序列如下識(shí)別探針a <210>27、識(shí)別探針 b <210>28 ；(3)用PCR方法擴(kuò)增在試劑盒中每個(gè)擴(kuò)增管中加入一個(gè)綿羊的染色體DNA作為擴(kuò)增模板，用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法擴(kuò)增多個(gè)綿羊的BMPR-IB基因包含A746G的基因片段， 得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；(4)變性處理將所得到的各個(gè)擴(kuò)增管的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物變性處理，之后分別取一定體積的變性后擴(kuò)增產(chǎn)物，分別加入雜交緩沖液I和II中，混勻備用；(5)預(yù)雜交及雜交先將基因芯片與預(yù)雜交液進(jìn)行預(yù)雜交、然后將上述備用的雜交緩沖液I和II分別與基因芯片的A和B反應(yīng)區(qū)域的捕獲探針P1-P12陣列雜交；(6)雜交信號(hào)檢測(cè)進(jìn)行顯色處理后檢測(cè)基因芯片A和B反應(yīng)區(qū)域陣列的雜交信號(hào)。
3.如權(quán)利要求2所述的綿羊BMPR-IB基因A746G多態(tài)性的檢測(cè)方法，其特征在于所述的用PCR方法擴(kuò)增步驟中的退火溫度設(shè)置為53°C。
4.如權(quán)利要求2或3所述的綿羊BMPR-IB基因A746G多態(tài)性的檢測(cè)方法，其特征在于所述的雜交步驟中的雜交溫度設(shè)置為46°C。
5.如權(quán)利要求2或3所述的綿羊BMPR-IB基因A746G多態(tài)性的檢測(cè)方法，其特征在于所述的雜交步驟中的雜交溫度設(shè)置為46°C。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因分析檢測(cè)產(chǎn)品，更具體的說(shuō)是適用于綿羊BMPR-1B基因A746G多態(tài)性檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。公開(kāi)的綿羊BMPR-1B基因A746G多態(tài)性檢測(cè)試劑盒，主要包含擴(kuò)增液、至少1張基因芯片、雜交緩沖液Ⅰ和Ⅱ、預(yù)雜交液、Taq酶、雜交顯色試劑；另外公開(kāi)了利用該試劑盒進(jìn)行檢測(cè)的方法步驟制備多個(gè)綿羊的染色體DNA備用；試劑盒組裝；用PCR方法擴(kuò)增；變性處理；預(yù)雜交及雜交；雜交信號(hào)檢測(cè)。該試劑盒是一種靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確率高，可有效提高工作效率、經(jīng)濟(jì)實(shí)用的適用于檢測(cè)綿羊BMPR-1B基因A746G多態(tài)性，所提供的檢測(cè)方法可實(shí)施規(guī)模檢測(cè)、簡(jiǎn)便實(shí)用、大大提高了工作效率。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102162013SQ201110126709
公開(kāi)日2011年8月24日 申請(qǐng)日期2011年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月17日
發(fā)明者劉守仁, 朱濱, 楊華, 楊永林, 沈敏, 王新華, 鐘發(fā)剛 申請(qǐng)人:上海百傲科技有限公司, 新疆農(nóng)墾科學(xué)院