專利名稱：治療和/或預防病毒感染的產品及方法
技術領域：
本發(fā)明屬于病毒感染的預防和/或治療領域，特別是對由病毒感染引起的疾病，例如肝炎的預防和/或治療。
背景技術：
LIGHT(homologous to lymphotoxin, exhibits inducible expression, andcompetes with HSV glycoprotein D for herpes virus entry mediator, a receptorexpressed by T lymphocytes (與淋巴毒素同源,表現出誘導型表達,并與HSV糖蛋白D競爭皰疹病毒進入介體——T淋巴細胞表達的一種受體))是最近鑒定的TNF配體超家族II型跨膜糖蛋白。LIGHT(TNFSF 14)是腫瘤壞死因子(TNF)家族成員，其與分別主要表達在基質細胞和T細胞上的淋巴毒素0受體(LT 0 R, Lymphotoxin & receptor)和皰疫病毒進入 介體(HVEM, herpes virus entry mediator)相互作用。LT 0 R信號傳導是形成有組織的淋巴結構所必需的，這可能至少部分歸因于LT P R能夠誘導趨化因子和粘著分子表達，而后兩者可以吸引淋巴器官中的幼稚T細胞和樹突細胞(DC)。體內LIGHT對基質細胞上的LT 3 R的刺激導致CCL21表達，在缺乏LT a 0 (LT P R的另一配體)的情況下CCL21吸引脾臟T細胞區(qū)域中的幼稚T細胞。這些結果證實了 LIGHT能夠與LT ^ R相互作用以調節(jié)CCL21趨化因子的表達。此外，LIGHT也表現出有力的、CD28非依賴性的T細胞致敏和擴增共刺激活性，導致增強的抗腫瘤T細胞免疫和/或增強的自身免疫。通過LT P R的信號傳導是有組織的淋巴組織形成所必需的。淋巴毒素P受體(LTPR)在淋巴結構的形成中起重要作用。LT 01 被TNF家族的兩個成員，S卩，淋巴毒素a ^和LIGHT，激活。LTP R在二級淋巴器官中T、B區(qū)的不同組織和淋巴結(LN)的形成上起關鍵作用。通過LTP R的信號傳導調節(jié)二級淋巴器官中趨化因子和粘著分子的表達。趨化因子和粘著分子控制脾臟中DC和淋巴細胞的遷移和定位?？扇苄訪T或TNF在非淋巴組織中的過表達足以促進功能性淋巴新生。LIGHT在T細胞激活和淋巴組織形成中具有獨特作用。LIGHT是LT P R及皰疹病毒進入介體(HVEM)的配體。LIGHT主要表達在淋巴組織上。LIGHT與LT P R的相互作用可以在LT a +小鼠脾臟中重建淋巴結構。此外，LIGHT的上調可以導致T細胞激活和遷移入非淋巴組織中并形成淋巴樣結構。相反地，LIGHT+小鼠表現出受損的T細胞激活和延遲的心臟排斥。因此，LIGHT是有力的共刺激分子，其也可以促進淋巴組織形成以增強局部免疫應答。已顯示，在腫瘤內施用表達LIGHT的腺病毒，通過吸引和活化更多的免疫細胞進入腫瘤而破壞腫瘤的免疫屏障，從而作用于局部腫瘤的排斥或腫瘤轉移8。持續(xù)性感染是全球范圍內的主要健康問題之一。某些病原體(特別是乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人體免疫缺陷病毒(HIV)、人乳頭瘤病毒(HPV)、和Epstein-Barr病毒(EBV))雖然具有較強的抗原，仍可在免疫活性宿主中持續(xù)存在。在宿主中清除病毒面臨的三個主要問題是病毒抗原以較高水平存在以及免疫耐受性和疫苗的效力較低。例如，HBV感染中存在高水平的病毒抗原，而宿主的免疫應答不能清除如此之多的病毒，增加的T細胞應答反而造成了肝臟損傷。因此，需要全面的治療手段來清除這些病原體。下面以乙型肝炎中的病毒感染為例，進一步闡釋在清除宿主中的病毒方面本領域中存在的問題。HBV和丙型肝炎病毒HCV感染是最廣泛的全球性健康問題之一，全世界約有20億人被HBV或HCV感染且其中，慢性HBV或HCV感染影響約4. 5億人。對于HBV而言，在幼年時期曾被慢性感染的成人中，約有25%后來死于由所述慢性感染引起的肝癌或肝硬化(肝的癒痕形成)(WHO. Hepatitis B-Key facts. 2009 http://www. who. int/mediacentre/factSheetS/fS204/en/)。清除HBV既需要細胞毒性T淋巴細胞(CTL)來清除細胞內的病毒，也需要針對乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的中和抗體來以互補的方式有效地清除細胞外病毒。通過利用所述中和抗體，CTL或天然殺傷(NK)細胞所釋放的游離病毒顆粒將被中和。目前在清除HBV中面臨的主要問題是生物體內CTL的功能缺陷、極高水平的抗原(例如HBsAg)和“被耗竭”的CTL上抑制性分子的上調。目前存在的疫苗(HBsAg+明礬)在預防方面是相對有效的，但是對于治療卻根本無效?，F存的疫苗在產生CTL方面效果相當差1A而患有慢性HBV感染的患者具有有缺陷的CTL3，因而慢性HBV患者對目前存在的疫苗沒有應答。雖然在當前的慢性HBV治療中，抗病毒治療能夠抑制HBV的復制，但其卻沒有充分地恢復有功能的CTL，不能完全恢復有功能的抗HBV免疫性。一些研究顯示適當活化的T細 胞的細胞毒性可以清除之前存在的HBV感染3_5。然而，由于CTL的產生不佳，治療的臨床試驗結果有限1_2。因此，需要新的策略以產生更強的疫苗，來清除HBV。

發(fā)明內容
本發(fā)明涉及病毒感染的預防和/或治療，特別是對由病毒感染引起的疾病，例如肝炎的預防和/或治療。本發(fā)明通過利用LIGHT多肽，或編碼所述LIGHT多肽的多核苷酸在肝內預防和/或治療由病毒感染引起的疾病或病況。本發(fā)明還涉及LIGHT多肽、病毒抗原和/或病毒抗原的中和抗體的組合，及其預防和/或治療病毒感染的用途和方法。如上文中所述，要清除宿主內的病毒需面臨下列問題病毒抗原以較高水平存在、免疫耐受性和疫苗的效力較低。本發(fā)明的技術方案克服了這些問題，產生了治療病毒感染，特別是肝臟內病毒感染的新產品和方法。在本發(fā)明的一個實施方式中，使用了效力較強的藥物組合物(例如包含LIGHT多肽和病毒抗原的免疫組合物)來破壞免疫耐受性并產生有功能的CTL以清除細胞內病毒。在本發(fā)明的另一個實施方式中，還進一步使用了病毒抗原的中和抗體來降低細胞外的病毒水平，從而解決了病毒抗原以較高水平存在的問題。此外，使用病毒抗原的中和抗體也可以有效地中和CTL所釋放的游離病毒顆粒。因此，為了更有效地清除病毒，例如HBV，本發(fā)明的發(fā)明人利用病毒抗原的中和抗體、免疫調節(jié)劑LIGHT、病毒抗原、或它們的組合，開發(fā)了更強的藥物組合物(例如疫苗)、試劑盒以及清除病毒的新的方法，其效果是在受試者中產生下列四種信號中的一種或多種保護性抗原的增加、對T細胞的協同刺激、對于樹突細胞的吸引和活化、以及產生危險/先天免疫信號。在本發(fā)明的一個具體實施方式
中，發(fā)明人發(fā)現，在清除HBV時，利用腺病毒載體表達LIGHT蛋白和乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)可以提供上文中所述的四種關鍵的信號的一種或多種。在本發(fā)明的另一個具體的實施方式中，利用包含編碼LIGHT蛋白(SEQ ID NO 1)及乙型肝炎病毒表面抗原的多核苷酸的非復制性腺病毒載體產生了強效的HBV疫苗,其特別的優(yōu)勢是I)低毒性；2)容易產生高滴度；3)高效刺激針對CTL的I類通路；和/或4)特異性靶標肝組織。在一個方面，本發(fā)明涉及分離的核酸分子，其包含(a)編碼LI GHT多肽的多核苷酸或與之互補的多核苷酸；和(b)編碼病毒抗原的多核苷酸或與之互補的多核苷酸。在一個具體實施方式
中，所述編碼LIGHT多肽的多核苷酸包含(i)序列如SEQ ID NO 2所示的多核苷酸或其片段；或

(ii)在嚴格條件下與(i)中的多核苷酸所構成的分子雜交的多核苷酸；或(iii)因為遺傳密碼簡并性而與(i)或(ii)的多核苷酸在密碼子序列中不同的多核苷酸。在具體的實施方式中，所述LIGHT多肽包含SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列、其片段或變體，且足以刺激細胞毒性T淋巴細胞；例如，所述變體可以是在SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列或其片段中經過一個或多個保守氨基酸置換而得到的氨基酸序列。在又一個具體實施方式
中，所述病毒抗原選自引起腫瘤或慢性病原體感染的病毒的免疫原性抗原，所述病毒為例如HBV、HCV、HIV、HPV或EBV ;優(yōu)選地，所述病毒抗原為HBV的免疫原性抗原；特別優(yōu)選地，所述病毒抗原為HBsAg或其免疫原性片段。在一個具體的實施方式中，所述ffisAg的氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示。在另一個方面，本發(fā)明涉及核酸組合，其包含至少兩種不同的核酸分子，其中所述至少兩種不同的核酸分子中包含(a)編碼LIGHT多肽的多核苷酸或與之互補的多核苷酸；和(b)編碼病毒抗原的多核苷酸或與之互補的多核苷酸。其中，所述(a)和(b)中的多核苷酸可以位于相同和/或不同的核酸分子中。在一個具體的實施方式中，所述核酸組合中的編碼LIGHT多肽的多核苷酸包含⑴序列如SEQ ID NO 2所示的多核苷酸或其片段；或(ii)在嚴格條件下與(i)中的多核苷酸所構成的分子雜交的多核苷酸；或(iii)因為遺傳密碼簡并性而與(i)或(ii)的多核苷酸在密碼子序列中不同的多核苷酸。特別地，所述LIGHT多肽可以包含SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列、其片段或變體，且足以刺激細胞毒性T淋巴細胞；例如，所述變體可以是在SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列或其片段中經過一個或多個保守氨基酸置換而得到的氨基酸序列。在又一個具體實施方式
中，所述核酸組合中的所述病毒抗原選自引起腫瘤或慢性病原體感染的病毒的免疫原性抗原，所述病毒為例如HBV、HCV、HIV、HPV或EBV ;例如，所述病毒抗原可以是KW的免疫原性抗原,優(yōu)選地,所述病毒抗原為HBsAg或其免疫原性片段。在一個具體的實施方式中，所述HBsAg的氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示。在另外的方面，本發(fā)明涉及載體，其包含上述本發(fā)明的任一分離的核酸分子。在一個具體的實施方式中，所述編碼LIGHT多肽的多核苷酸和編碼病毒抗原的多核苷酸位于同一個所述載體中，特別地，二者可通過連接子(例如內部核糖體進入位點(IRES))相連。在本發(fā)明的一個具體實施方式
中，所述載體為腺病毒載體。本領域技術人員將明了，當所述編碼LIGHT多肽的多核苷酸和編碼病毒抗原的多核苷酸通過連接子彼此相連時，所述連接子可以是任何不影響其所連接的多核苷酸所編碼的產物的正常功能的多核苷酸。并且根據本領域的普通技術知識可以很容易地設計、制備此類連接子。在具體的實施方式中，所述載體為病毒載體，例如選自腺病毒載體、腺伴隨病毒載體、逆轉錄病毒載體、鼠哈維肉瘤病毒載體、鼠乳腺腫瘤病毒載體、勞斯肉瘤病毒載體、SV40-型病毒載體、多瘤病毒載體、EB病毒載體、乳頭狀瘤病毒載體、皰疹病毒載體、牛痘病毒載體、脊髓灰質炎病毒載體和RNA病毒載體；優(yōu)選地,所述病毒載體為腺病毒載體。在又一個方面，本發(fā)明涉及載體系統(tǒng)，其包含至少兩個載體，所述至少兩個載體中包含(a)編碼LIGHT多肽的多核苷酸或與之互補的多核苷酸；和 (b)編碼病毒抗原的多核苷酸或與之互補的多核苷酸；其中，所述(a)和(b)中的多核苷酸位于相同和/或不同的載體中。在一個具體的實施方式中，所述載體系統(tǒng)中的所述編碼LIGHT多肽的多核苷酸包含⑴序列如SEQ ID NO 2所示的多核苷酸或其片段；或(ii)在嚴格條件下與(i)中的多核苷酸所構成的分子雜交的多核苷酸；或(iii)因為遺傳密碼簡并性而與(i)或(ii)的多核苷酸在密碼子序列中不同的多核苷酸。特別地，所述LIGHT多肽可以包含SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列、其片段或變體，且足以刺激細胞毒性T淋巴細胞；例如，所述變體可以是在SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列或其片段中經過一個或多個保守氨基酸置換而得到的氨基酸序列。在具體的實施方式中，所述載體系統(tǒng)中的所述病毒抗原選自引起腫瘤或慢性病原體感染的病毒的免疫原性抗原，所述病毒為例如HBV、HCV、HIV、HPV或EBV ;例如，所述病毒抗原可以是HBV的免疫原性抗原，優(yōu)選地，所述病毒抗原為HBsAg或其免疫原性片段。在一個具體的實施方式中，所述HBsAg的氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示。在一個具體的實施方式中，所述載體系統(tǒng)中的所述至少兩個載體為病毒載體，且彼此獨立地選自例如腺病毒載體、腺伴隨病毒載體、逆轉錄病毒載體、鼠哈維肉瘤病毒載體、鼠乳腺腫瘤病毒載體、勞斯肉瘤病毒載體、SV40-型病毒載體、多瘤病毒載體、EB病毒載體、乳頭狀瘤病毒載體、皰疫病毒載體、牛痘病毒載體、脊髓灰質炎病毒載體和RNA病毒載體；優(yōu)選地，所述病毒載體為腺病毒載體。在本發(fā)明的一個具體的實施方式中，所述LIGHT多肽包含SEQ IDNO :1所示的氨基酸序列、其片段或變體，且足以刺激細胞毒性T淋巴細胞，特別地，所述變體為在SEQ ID NO:I所示的氨基酸序列或其片段中經過一個或多個保守氨基酸置換而得到的氨基酸序列；所述病毒抗原為HBsAg或其免疫原性片段，特別地，所述HBsAg的氨基酸序列可以如SEQ IDNO :4所不；且所述編碼LIGHT多肽的多核苷酸和編碼病毒抗原的多核苷酸位于同一個腺病毒載體中。在另一個方面，本發(fā)明涉及組合物，其包含LIGHT多肽和病毒抗原。其中所述LIGHT多肽和病毒抗原可以以彼此相結合或不相結合的方式存在。當二者以彼此相結合的方式存在時，它們可以通過形成融合蛋白、化學綴合、和形成免疫脂質體等方法中的一種或者多種方法相連，并且所述結合可以是可逆的或不可逆的。在一個具體的實施方式中，所述組合物中的LIGHT多肽包含SEQ IDNO :1所示的氨基酸序列、其片段或變體，且足以刺激細胞毒性T淋巴細胞；特別地，所述變體為在SEQID NO :I所示的氨基酸序列或其片段中經過一個或多個保守氨基酸置換而得到的氨基酸序列。在另一個具體實施方式
中，所述組合物中的病毒抗原可選自引起腫瘤或慢性病原體感染的病毒的免疫原性抗原，所述病毒為例如HBV、HCV、HIV、HPV或EBV ;優(yōu)選地，所述病毒抗原為HBV的免疫原性抗原；特別優(yōu)選地，所述病毒抗原為HBsAg或其免疫原性片段，在一個具體的實施方式中所述HBsAg的氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示。在又一個方面，本發(fā)明涉及病毒顆粒，其包含上文中所述的載體(例如病毒載體)、載體系統(tǒng)(例如包含病毒載體的載體系統(tǒng))或組合物。在一個具體的實施方式中，所述病毒顆粒為腺病毒顆粒。另一方面，本發(fā)明涉及宿主細胞，其包含上述的載體、載體系統(tǒng)或病毒顆粒。 本發(fā)明還涉及所述的分離的核酸分子、所述核酸組合、所述載體、所述載體系統(tǒng)、所述組合物或所述病毒顆粒用于制備藥物的用途，其中所述藥物用于預防和/或治療由病毒引起的腫瘤或慢性病原體感染，例如與HBV、HCV、HIV、HPV或EBV感染相關的病癥或病況；特別地，所述藥物可以用于預防和/或治療肝內的病毒感染，特別是乙型肝炎病毒感染。例如所述藥物可以用于刺激和擴增對HBsAg有特異性反應的T細胞。在另外的方面，本發(fā)明涉及藥物組合物，其包含(i)上述的分離的核酸分子、的核酸組合、載體、載體系統(tǒng)、組合物或病毒顆粒；和(ii)任選地可藥用的載體。在又一方面，本發(fā)明還涉及一種試劑盒，其包含所述的藥物組合物和針對病毒抗原的中和抗體；其中，所述中和抗體所針對的病毒抗原與所述藥物組合物中分離的核酸分子、核酸組合、載體、載體系統(tǒng)、組合物或病毒顆粒所編碼或包含的病毒抗原可以是相同的或不同的；并且其中，所述藥物組合物和所述中和抗體彼此不相混合。在一個優(yōu)選的實施方式中，所述試劑盒中的所述中和抗體所針對的病毒抗原與所述藥物組合物中分離的核酸分子、核酸組合、載體、載體系統(tǒng)、組合物或病毒顆粒所編碼或包含的病毒抗原是相同的；特別地，所述病毒抗原可以均為JBsAg或其免疫原性片段。在一個具體的實施方式中，作為示例，發(fā)明人使用了針對ayw亞型HBsAg的單克隆抗體H25B10 (表達此單克隆抗體的雜交瘤細胞購買自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，其保藏編號為ATCC H25B10)作為所述中和抗體并顯示了其能夠實現本發(fā)明的目的。在另外的實施方式中，發(fā)明人使用了特別針對在中國普遍存在的adr和adw亞型HBsAg的單克隆抗體scFvC-hlgGlFc (其可變區(qū)序列由SEQ ID NO 5中所示的核酸序列所編碼的氨基酸序列組成)和scFvD-hlgGlFc (其可變區(qū)序列由SEQ ID NO 6中所示的核酸序列所編碼的氨基酸序列組成)，由于這些抗體對于adr和adw亞型HBsAg的高親和力，它們也可以理想地作為用于本發(fā)明的目的的中和抗體。類似地，下列抗體也可以用于本發(fā)明的目的對于其各自的目標病毒抗原具有與抗體H25B10、可變區(qū)序列包含SEQ ID NO :5中所示的核酸序列所編碼的氨基酸序列的抗體(例如抗體scFvC-hlgGlFc)或可變區(qū)序列包含SEQ ID NO 6中所示的核酸序列所編碼的氨基酸序列的抗體(例如抗體scFvD-hlgGlFc)同等水平的親和力(所述親和力可以為例如Kd彡1x10_8M，優(yōu)選Kd彡Ixl(T9M)的抗體，例如具有與抗體H25B10、scFvC-hlgGlFc 或 scFvD-hlgGlFc 相同或至少 80% (例如至少 85%、至少 90%,至少95%或至少99% )序列一致的重鏈和/或輕鏈⑶R的抗體，或者具有與抗體H25B10、scFvC-hlgGlFc或scFvD-hlgGlFc相同或至少80% (例如至少85%、至少90%、至少95%或至少99% )序列一致的重鏈和/或輕鏈可變區(qū)的抗體。在具體的實施方式中，本發(fā)明中的所述中和抗體的重鏈CDR1-3分別與抗體H25B10、scFvC-hlgGlFc或scFvD-hlgGlFc中任一個的重鏈CDR1-3相同；和/或所述中和抗體的輕鏈CDR1-3分別與抗體H25B10、scFvC-hIgGlFc或scFvD-hlgGlFc中任一個的輕鏈CDR1-3相同。在特別的實施方式中，所述中和抗體的重鏈和輕鏈CDR1-3分別與選自抗體H25B10、scFvC-hlgGlFc或s cFvD-hlgGlFc的同一個抗體的重鏈和輕鏈CDR1-3相同。其中所述scFvC-hlgGlFc的可變區(qū)序列由SEQ ID NO :5中所示的核酸序列所編碼的氨基酸序列組成，scFvD-hlgGlFc的可變區(qū)序列由SEQ ID NO :6中所示的核酸序列所編碼的氨基酸序列組成。
在另外的實施方式中，所述中和抗體的重鏈可變區(qū)序列與所述抗體H25B10、scFvC-hlgGlFc或scFvD-hlgGlFc中任一個的重鏈可變區(qū)序列相同；和/或所述中和抗體的輕鏈可變區(qū)序列與所述抗體H25B10、scFvC-hlgGlFc或scFvD-hlgGlFc中任一個的輕鏈可變區(qū)序列相同。在特別的實施方式中，所述中和抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)序列分別與選自所述抗體H25B10、scFvC-hlgGlFc或scFvD-hlgGlFc的同一個抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)序列相同。然而，本領域技術人員將會明了，所述試劑盒中包含的所述中和抗體是用于清除預先存在的病毒抗原的，因此，凡是能夠中和目標病毒抗原的抗體均可用于本發(fā)明的目的。根據具體的實驗要求和應用目的，本領域技術人員完全有能力選擇合適的中和抗體，從而達到降低免疫耐受性的目的。在一個具體的實施方式中，所述試劑盒進一步包含使用說明書，從所述使用說明書中可以了解到在施用所述藥物組合物之前，至少施用一次所述中和抗體。在一個具體的實施方式中，所述試劑盒中的中和抗體所針對的病毒抗原與所述藥物組合物中分離的核酸分子、核酸組合、載體、載體系統(tǒng)、組合物或病毒顆粒所編碼或包含的病毒抗原是相同的，均為HBsAg ;特別地，針對HBsAg的所述中和抗體可以是單克隆抗體H25B10、包含SEQ ID NO :5中所示的核酸序列所編碼的氨基酸序列的抗體或可變區(qū)序列包含SEQ ID NO 6中所示的核酸序列所編碼的氨基酸序列的抗體。更特別地，本發(fā)明中所述中和抗體的可變區(qū)序列可以由SEQ IDNO :5或SEQ ID NO:6中所示的核酸序列所編碼的氨基酸序列組成。在又一個方面，本發(fā)明還涉及所述的藥物組合物與針對病毒抗原的中和抗體共同用于制備藥物的用途，其中，所述中和抗體所針對的病毒抗原與所述藥物組合物中分離的核酸分子、核酸組合、載體、載體系統(tǒng)、組合物或病毒顆粒所編碼或包含的病毒抗原可以是相同的或不同的，在優(yōu)選的實施方式中，二者是相同的；并且其中，所述藥物用于預防和/或治療由病毒引起的腫瘤或慢性病原體感染，例如與HBV、HCV、HIV、HPV或EBV感染相關的病癥或病況；特別地，所述藥物可以用于預防和/或治療肝內的病毒感染，例如乙型肝炎病毒感染。例如所述藥物可以用于刺激和擴增對HBsAg有特異性反應的T細胞。在一個具體的實施方式中，所述中和抗體所針對的病毒抗原與所述藥物組合物中分離的核酸分子、核酸組合、載體、載體系統(tǒng)、組合物或病毒顆粒所編碼或包含的病毒抗原是相同的，均為HBsAg或其免疫原性片段并且其中所述藥物用于預防和/或治療乙型肝炎病毒感染，例如所述藥物可以用于刺激和擴增對HBsAg有特異性反應的T細胞。在具體的實施方式中，所述中和抗體可以是單克隆抗體H25B10、scFvC-hlgGlFc或s cFvD-hlgGlFc，或者是與它們有同等水平的親和力的抗體，例如本申請上文中所述的任一種中和抗體。在另外的方面，本發(fā)明還涉及LIGHT多肽、或編碼LIGHT多肽的多核苷酸用于制備藥物的用途，所述藥物用于預防和/或治療肝臟內的病毒感染。特別地，所述病毒可包含但不限于HBV或HCV。在一個具體實施方式
中，所述LIGHT多肽包含SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列、其片段或變體，并且足以刺激細胞毒性T淋巴細胞；特別地，所述變體為在SEQID NO :I所示的氨基酸序列或其片段中經過一個或多個保守氨基酸置換而得到的氨基酸序列。
在又一個方面，本發(fā)明涉及預防和/或治療病毒感染的方法，所述方法包括下列步驟(a)向動物或人的細胞或組織施用預防和/或治療有效量的上文中所述的本發(fā)明的分離的核酸分子、核酸組合、載體、載體系統(tǒng)、組合物、病毒顆?；蛩幬锝M合物。在一個實施方式中，所述方法進一步包括下列步驟(b)向動物或人的細胞或組織施用上文所述的中和抗體；并且在實施步驟(a)之前，至少實施步驟(b) —次。所述預防和/或治療病毒感染的方法可用于預防和/或治療由于病毒感染引起的疾病或病況。所述疾病或病況包括但不限于癌癥，以及由導致慢性感染的病原體(例如HBV、HCV、HIV、HPV和EBV)引起的疾病。在一個具體實施方式
中，所述疾病或病況為肝內的病毒感染引起的病癥或病況，例如乙型肝炎。例如所述方法可以用于刺激和擴增對HBsAg有特異性反應的T細胞。在又一個方面，本發(fā)明還涉及預防和/或治療肝臟內病毒感染的方法，所述方法包括將LIGHT多肽，或者編碼所述LIGHT多肽的多核苷酸引入肝組織。在一個實施方式中，所述方法用于預防和/或治療乙型肝炎病毒感染或丙型肝炎病毒感染。在本發(fā)明的一個具體實施方式
中，表達LIGHT蛋白(氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示)的腺病毒(Ad-LIGHT)可以清除腺相關病毒(AAV)誘導的HCV-核心在肝內的存留。本發(fā)明還涉及上述各種具體實施方式
的各種任意組合。


圖I.腺病毒的圖示結構，其包含編碼HBsAg和/或LIGHT的多核苷酸。其中CMV5是啟動子，Ires是連接子。圖2.通過PCR在肝臟中檢測AAV-HCV核心基因的水平。A)列出了處理的安排表。用AAV-HCV-核心感染小鼠從而誘導持續(xù)的感染。在第9天，用Ad-LIGHT或對照腺病毒(Ad-null或Ad-LacZ)處理被感染的小鼠。B)在Ad-LIGHT處理后，收集來自肝組織的RNA，然后進行PCR。與未處理的或用Ad-null處理的樣品相比，經Ad-LIGHT處理后AAV-HCV-核心基因被減少至很低的水平。其中各泳道中的樣品如下1-2 LT PR-/-，Ad-LIGHT ; 3-4LT ^ R-/-, Ad-null ；5~6 B6, Ad-LIGHT ;7_8 B6, Ad-null ;在各 PCR 反應中加入 0. 4 y g 的DNA，進行33個循環(huán)；C)肝組織的H&E染色，顯示Ad-LIGHT可以將淋巴細胞募集至肝。圖3. Ad-LIGHT-HBsAg作為產生T細胞應答的強疫苗。用109v. p.的Ad-LIGHT-HBsAg或PBS刺激野生型小鼠。在第9天收集脾臟用于ELISPOT(A)或流式細胞計數分析⑶。圖4. Ad-LIGHT-HBsAg破壞耐受性以在HBsAg轉基因小鼠中產生抗體應答。Ad-LIGHT-HBsAg不僅可以在野生型小鼠中，也可以在HBsAg轉基因小鼠中刺激抗-HBs Ag抗體的產生。其中，向各小鼠經皮下注射2. 5xl09v.p.的Ad-LIGHT-HBsAg。圖5.抗HBsAg抗體能夠在體內中和HBsAg。使用0. 5mg抗HBsAg的單克隆抗體H25B10以減少血清中的HBsAg。實驗持續(xù)15天。圖6.通過組合處理誘導強干擾素(IFN)產生細胞。用HBsAg抗體預處理野生型 (Wt)和HBsAg轉基因(Tg)小鼠,且在施用抗體3天后檢測不到HBsAg。每5天用抗體處理小鼠，共處理4次。第一次抗體處理后6天，用Ad-LIGHT-HBsAg(4-20xl08vp)處理小鼠。在第15天收集脾細胞(6A)和淋巴結細胞(DLN細胞)(6B)。通過針對IFNg的Elispot確定HBsAg特異性T細胞。圖7. scFvC-hlgGlFc 與 HBsAg (adr)和 HBsAg (adw)的結合具有高親和力。將 10 U g的HBsAg(adr或adw型)包被在ELISA平板上，以2% FBS/PBS/NaN3封閉所述平板。加入不同量的hlgGl作為標準。然后加入一系列滴定濃度的scFvC-hlgGlFc，在室溫孵育I小時。圖8 通過 scFvD-hlgGlFc 來中和 HBsAg 與 Chang 肝細胞的結合。HBsAg(adw或adr型)結合Chang肝細胞，但是scFvD-hlgGlFc會阻礙HBsAg與Chang肝細胞的結合。將 scFvD-hlgGlFc (約 I U g/ml)與 Chang 肝細胞共同孵育；加入 HBsAg (adw)-bio (上海PrimeGene生物科技公司，#671-01),發(fā)現HBsAg (adw)與Chang肝細胞結合，而scFvD-hlgGlFc可以完全阻礙所述結合。其中adw-bio指HBsAg(adw)-bio。
具體實施例方式本發(fā)明中所述的“核酸組合”指一種產品，其包含至少兩種不同的核酸分子，其中可僅包含核酸分子，也可以還包含另外的組分。本發(fā)明中所述的“組合物”包括含有一個或多個多肽的組合物，其中所述多個多肽可以是相同的或不同的；以其最廣泛的含義，單個分離的多肽分子也屬于本發(fā)明的“組合物”。所述“組合物”中可僅包含多肽，也可以還包含另外的組分在本發(fā)明中，所述多核苷酸所編碼的病毒抗原可以是任何目標病毒的免疫原性抗原。所述目標病毒包括但不限于引起腫瘤的病毒，或者引起慢性病原體感染的病毒，例如HBV, HCV、HIV、HPV和EBV。在一個實施方式中，所述病毒抗原為乙型肝炎病毒抗原，優(yōu)選乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)或其免疫原性片段。本發(fā)明中所述的“LIGHT多肽”意指包含LIGHT蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO I所示)或其片段、變體的多肽。特別地，所述LIGHT蛋白的變體的氨基酸序列為在SEQID NO :I所示的氨基酸序列或其片段中經過一個或多個保守氨基酸置換而得到的氨基酸序列。優(yōu)選地，所述LIGHT多肽是人的。更優(yōu)選地，所述LIGHT多肽足以刺激細胞毒性T淋巴細胞。在一個具體的實施方式中，所述LIGHT多肽的序列如SEQ ID N0:1所示。
在一個實施方式中，所述LIGHT多肽可以包含或者為LIGHT蛋白胞外域的片段。在一個具體實施方案中，所述LIGHT多肽由LIGHT蛋白胞外域組成。在一個實施方案中，所述LIGHT蛋白胞外域具有如下氨基酸序列QLHWRLGEMVTRLPDGPAGSWEQLIQERRSHEVNPAAHLTGANSSLTGSGGPLLWETQLGLAFLRGLSYHDGALVVTKAGYYYIYSKVQLGGVGCPLGLASTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEKVVVRVLDERLVRLRDGTRSYFGAFMV(SEQ ID NO 3)(也參見 gi 113124597 | sp | 043557 | TNF14_HUMAN[13124597])。此外，本領域技術人員將意識到可通過保守氨基酸置換對LIGHT蛋白或其片段進行修飾以提供功能等同的變體，即，所述變體保持LIGHT蛋白或其片段的功能(即足以刺激細胞毒性T淋巴細胞)。在本申請中所使用的“保守氨基酸置換”指不顯著改變多肽的三級結構和/或多肽活性的氨基酸置換。所述變體可根據本領域一般技術人員已知的改變多肽序列的方法而制備，也可根據匯編型參考文獻中所能找到的此類方法而制備，例如 Molecular Cloning A Laboratory Manual, J. Sambrook 等編，Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York,1989,或 CurrentProtocols in Molecular Biology,F. M. Ausubel 等編，John ffiley&Sons, Inc. ,New York。示例性的LIGHT多肽的功能等同性變體包括對SEQ ID NO :1進行保守氨基酸置換而得到得多肽。在一個方面，保守氨基酸置換為發(fā)生在下列組群內部氨基酸之間的置換(a)M，I，L，V ； (b)F，Y，W ； (c)K，R，H；(d)A, G； (e)S，T ； (f)Q, N ;和(g)E，D。因此本發(fā)明中的“LIGHT多肽”也包含LIGHT蛋白或其片段的功能等同的變體，即，保持天然LIGHT蛋白或其片段功能的LIGHT蛋白或其片段的變體。為了在LIGHT蛋白或其片段的氨基酸序列中產生功能等同性變體而引入的保守氨基酸置換，典型地是通過改變編碼LIGHT蛋白或其片段的核酸(SEQ ID NO :2或其片段)而得到的。這類置換可通過多種本領域一般技術人員已知的方法而得到。例如，氨基酸置換可通過PCR導向突變，根據Kunkel 的方法(Kunkel，Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. A. 82 =488-492,1985)的定點突變，或編碼LIGHT多肽的基因的化學合成而得到。LIGHT蛋白或其片段的功能等同片段的活性能通過將編碼改變后的LIGHT多肽的基因克隆進載體中，將載體引入合適的宿主細胞，表達改變后的LIGHT多肽，和測試在本申請中公開的LIGHT多肽的功能(例如刺激細胞毒性T淋巴細胞的能力等)，而得到測試。由上文可知，在本申請中所用的LIGHT蛋白或其片段的“變體”是包含一個或多個對LIGHT蛋白或其片段的一級氨基酸序列的修飾的多肽。典型地，為了得到所述變體，可對編碼LIGHT蛋白或其片段的核酸進行修飾，例如通過刪除、點突變、截斷、置換和/或添加一個或多個核苷酸，例如一個或幾個核苷酸；也可對所述LIGHT蛋白或其片段直接進行修飾，例如通過切斷，連接分子的添加，可探測部分如生物素的添加，脂肪酸的添加和類似的方式。所述修飾也包括包含全部或部分LIGHT蛋白的氨基酸序列的融合蛋白。本領域技術人員將會熟知預測蛋白序列變化對蛋白構象的影響的方法，并能因此根據已知方法而“設計”所述LIGHT蛋白或其片段的變體。這種方法的一個實例由Dahiyat和Mayo在Science278 =82-87,1997中描述，其中蛋白質可被重新設計。此方法能被應用于已知的蛋白，以僅改變多肽序列的一部分。通過應用Dahiyat和Mayo的計算方法，可提出具體的LIGHT多肽變體并容易地對所述變體進行測試以測定其是否保持了所期望的構象。優(yōu)選地，所述LIGHT的多肽變體足以刺激細胞毒性T淋巴細胞。本發(fā)明中所述的“編碼LIGHT多肽的多核苷酸”意指包含SEQ IDNO 2或其片段所示的核酸序列的多核苷酸，或者通過在其中引入一個或多個核苷酸的缺失、添加或置換，或者其它突變而得到的多核苷酸。優(yōu)選地，所述核酸突變保存編碼序列的氨基酸閱讀框，并優(yōu)選不在核酸中創(chuàng)造出很可能雜交以形成二級結構的區(qū)域，其中所述二級結構(例如發(fā)卡或環(huán)結構)可能對變體多肽的表達有害。本發(fā)明也包括含有天然物質中出現的密碼子的替代物的簡并核酸。例如，絲氨酸殘基被密碼子TCA，AGT, TCC, TCG, TCT和AGC編碼。因此，本領域一般技術人員將容易理解，任何編碼絲氨酸的核苷酸三聯體均可被用于在體內或體外指導蛋白質合成裝置，以將絲氨酸殘基整合進入正在延伸的LIGHT多肽中。類似地，編碼其它氨基酸殘基的核苷酸序列三聯體包括但不限于CCA，CCC, CCG和CCT (脯氨酸密碼子);CGA，CGC, CGG, CGT, AGA和AGG (精氨酸密碼子)；ACA，ACC, ACG和ACT (蘇氨酸密碼子)；AAC和AAT (天冬酰胺密碼
子)；&ATA，ATC和ATT (異亮氨酸密碼子)。其它氨基酸殘基可類似地被若干核苷酸序列編碼。因此，本發(fā)明包括與生物學上分離的核酸在密碼子序列中因遺傳密碼簡并性而有所不同的簡并核酸。因此，根據本發(fā)明的編碼LIGHT多肽的多核苷酸包括(i)多核苷酸，其包含SEQID NO :2所示的多核苷酸或其片段；(ii)在嚴格條件下與(i)中的多核苷酸所構成的分子雜交的多核苷酸，其編碼足以刺激細胞毒性T淋巴細胞的LIGHT多肽；(iii)⑴或(ii)的缺失、添加和/或取代物，其編碼足以刺激細胞毒性T淋巴細胞的LIGHT多肽；(iv)因為遺傳密碼簡并性而與或(iii)的核酸分子在密碼子序列中不同的核酸分子，和(v)(i)、(ii)、(iii)或(iv)的互補鏈。在本申請中所用的“互補鏈”包括“(i)、(ii)、(iii)或(iv)的全長互補鏈或100%的互補鏈”。因此，本發(fā)明的一個方面涉及那些編碼LIGHT多肽并在嚴格條件下與SEQ ID NO 2的編碼區(qū)所組成的核酸分子雜交的多核苷酸。在一些實施方案中，在本申請中所用的術語“嚴格條件”指本領域所熟悉的參數。對核酸，所述嚴格的雜交條件典型地是在低離子強度和恰好低于DNA雜交復合物熔點(Tm)(典型地，低于雜交物Tm約:TC )的溫度下。嚴格性越高，就意味著探針序列和靶之間的相關性更特異。核酸雜交中所用的嚴格條件在本領域中眾所周知，可在諸多參考文獻中找到，例如Molecular Cloning A Laboratory Manual,J. Sambrook 等編，Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, New York,1989,或 Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel等編，John ffiley&Sons, Inc. , New York。例如，所述“嚴格條件”可以是在6xSSC中于65°C下雜交。又例如，所述嚴格條件可以是在雜交緩沖液中于65°C下雜交，其中所述雜交緩沖液由3. 5xSSC，0. 02% Ficoll,0. 02 %聚乙烯吡咯烷酮，0. 02 %牛血清白蛋白，2. 5mMNaH2PO4[pH7]，0. 5% SDS,2mM EDTA 組成(SSC 是 0. 15M 氯化鈉 /0. 15M 檸檬酸鈉，pH7 ；SDS是十二烷基硫酸鈉；而EDTA是乙二胺四乙酸)。雜交之后，將轉上了 DNA的膜在2xSSC中于室溫下清洗，然后在最高68°C的溫度下于0. lxSSC/0. IxSDS中清洗。在進一步的實施例中，可用雜交甲酰胺溶液代替雜交水溶液而進行實驗。應用例如50%甲酰胺溶液和42°C，也可實現所述嚴格的雜交條件。此外，還存在其它能被應用的條件、試劑等，并帶來類似的嚴格程度。本領域技術人員將熟悉這類條件，因此不在此處詳述。然而，需要理解的是，本領域技術人員將能以允許清晰鑒別本發(fā)明所涉及的編碼LIGHT多肽的多核苷酸的方式控制和調節(jié)條件和參數。技術人員也將熟悉對于所述分子的表達庫進行篩選，然后再分離相關的核酸分子和序列的方法。在本發(fā)明的一個方面，上述“LIGHT多肽”或“編碼LIGHT多肽的多核苷酸”的氨基酸序列或核苷酸序列典型地可以與SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2具有至少50%的序列同一性,例如至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%。所述同一性可應用多種由NCBI (Bethesda,Maryland)開發(fā)的公開可得的軟件工具計算得到。示例性的工具包括Altschul SF等的啟發(fā)式算法(J Mol Biol,1990，215 =403-410)，也稱為 BLAST。Pairwise 和 Clustalff 比對(BL0SUM30 矩陣設置)以及Kyte-Doolittle水療分析,其可應用公開的(EMBL,Heidelberg,Germany)和商業(yè)來源(例如來自 Oxford Molecular Group/Genetics Computer Group,Madison,WI 的MacVector序列分析軟件)的軟件而進行。
在一個實施方式中，由上文中所述的多核苷酸編碼的所述病毒抗原或LIGHT多肽還可以進一步包含信號肽(導向肽)或者便于純化的標簽。在另外的方面，本發(fā)明中涉及的、包含上文中所述多核苷酸的載體中可包含編碼序列和調控序列，當它們以將編碼序列的表達或轉錄置于調控序列的影響或控制之下的方式而共價連接時，被表述成“可操作性地”連接。因此，如果啟動子區(qū)域能影響其后的編碼序列的轉錄從而使所得的轉錄物可被翻譯成所期望的蛋白或多肽，則啟動子區(qū)域將可操作性地連接編碼序列。所述啟動子可以為適于LIGHT多肽和/或病毒抗原表達的任何啟動子，所述啟動子包括但不限于CMV5啟動子和Ula啟動子?；虮磉_所需的調控序列取決于具體的物種或細胞類型，但將一般性地包括與轉錄和翻譯各自啟動有關的5’非轉錄和5’非翻譯序列，如TATA盒，加帽序列，CAAT序列和類似物。尤其是，這類5’非轉錄調控序列將包括包含對可操控性連接的基因進行轉錄控制的啟動子序列的啟動子區(qū)域。所述調控序列也可包括所需的增強子序列或上游激動子序列。本發(fā)明的載體可任選地包括5’前導或信號序列。對合適的載體的選擇和設計是在本領域一般技術人員的能力之內的。包含所有表達所必需的元件的載體可商業(yè)性地獲得，并為本領域技術人員所知。參見，例如 Sambrook等，Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition, ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989。一般而言，可用于本發(fā)明的上述載體包括但不限于質粒、噬菌粒、病毒、源于病毒或細菌來源的其它載體，已通過將本發(fā)明所涉及的多核苷酸序列和結合至本發(fā)明所涉及的多核苷酸序列的另外的核酸片段(例如增強子、啟動子)插入或整合到所述載體中而對所述載體進行了處理。優(yōu)選地，所述載體為病毒載體，其包括但不限于來自下列病毒的核酸序列腺病毒；腺伴隨病毒；逆轉錄病毒，例如鼠莫洛尼白血病毒；鼠哈維肉瘤病毒；鼠乳腺腫瘤病毒；勞斯肉瘤病毒；SV40_型病毒；多瘤病毒；EB病毒；乳頭狀瘤病毒；皰疫病毒；牛痘病毒；脊髓灰質炎病毒；和RNA病毒例如逆轉錄病毒。此外，還可以容易地采用在本領域中已知的其它載體。對某些應用而言，特別優(yōu)選的、作為載體的病毒是腺伴隨病毒(AAV)(—種雙鏈DNA病毒)。腺伴隨病毒能感染廣泛的細胞類型和物種，且能通過工程化而成為復制缺陷型的。它進一步地具有下述優(yōu)點，例如熱和脂溶劑穩(wěn)定性、在多種株系細胞包括肝細胞、造血細胞中的高轉導頻率，和缺乏超感染抑制因此而允許多重系列的轉導。經報道，腺伴隨病毒能以位點特異的方式整合進人細胞DNA，從而使插入性基因突變的可能性和插入基因的表達的可變性最小化。此外，野生型腺伴隨病毒感染已在組織培養(yǎng)物中、在缺乏選擇壓力的條件下存在超過100代，意味著腺伴隨病毒基因組整合是相對穩(wěn)定的事件。腺伴隨病毒也能以染色體外方式發(fā)揮作用。一般而言，其它優(yōu)選的病毒載體基于非細胞病變性真核病毒，在這些病毒中非必需基因已被目的基因所替代。非細胞病變性病毒包括逆轉錄病毒，其生命周期包括基因組病毒RNA到DNA的逆轉錄及隨后的前病毒整合到宿主細胞DNA中。腺病毒和逆轉錄病毒已被許可用于人基因治療的試驗。一般而言，逆轉錄病毒是復制缺陷型(即，能指導所需蛋白的合成，但不能制造出感染性的顆粒)。這類基因改變的逆轉錄病毒載體具有對基因在體內的高效轉導的一般性用途。產生復制缺陷型逆轉錄病毒的標準流程(包括步驟外源·性遺傳物質整合進質粒，質粒對包裝細胞系的轉染，重組性逆轉錄病毒通過包裝細胞系的產生，從組織培養(yǎng)基中收集病毒顆粒和病毒顆粒對靶細胞的感染)在Kriegler，M.，“GeneTransfer and Expression, A Laboratory Manual,，^W. H. Freeman C. 0., New York (1990)和Murry, E. J. Ed. “Methods in Molecular Biology,，，卷 7, Humana Press Inc. , Cliffton,New Jersey(1991)中被詳細描述。又一優(yōu)選的載體是Stratford-Perricaudet所述的腺病毒,其El和E3蛋白有缺陷(J. Clin. Invest. 90 :626-630,1992)。腺病毒作為 Adeno. PlA 重組體的應用被 Warnier等所公開，用于在小鼠皮內注射以得到抗PlA的免疫化(Int. J. Cancer，67 :303-310,1996)。除利用前述載體外，也可通過其它的傳送方法將本發(fā)明的組合物/藥物傳送到細胞例如神經細胞、肝、成纖維細胞、和/或血管內皮細胞中，并促進在那里的吸收。在一個優(yōu)選的實施方式中，編碼LIGHT多肽的多核苷酸的核酸序列如SEQ ID NO 2所示，編碼病毒抗原的多核苷酸編碼的是HBsAg，二者在腺病毒載體中通過IRES連接子相連且在CMV5啟動子的控制下被表達。本發(fā)明中所述的“載體系統(tǒng)”指包含至少兩個載體的產品，例如載體組合物。其中所述至少兩個載體可以是相同的或不同的。本發(fā)明中所述的“病毒顆?！敝赋墒斓?、結構完整的和有感染性的病毒粒子。在一個具體的實施方式中，所述病毒顆粒為腺病毒顆粒。本發(fā)明中所述的“宿主細胞”可以是原核性的(例如大腸桿菌)或真核性的(例如CHO細胞，COS細胞，酵母表達系統(tǒng)和在昆蟲細胞中表達的桿狀病毒)。特別地，所述宿主細胞是哺乳動物的細胞，例如人、小鼠、倉鼠、豬、山羊、靈長類動物等的細胞。它們可以源自多種組織類型，包括例如原代細胞和永生化的細胞系。所述細胞的具體實例包括HT-1080細胞、CHO細胞、樹狀細胞、U293細胞、外周血白細胞、骨髓干細胞、胚胎干細胞、和昆蟲細胞。本發(fā)明也允許構建其中LIGHT基因被“敲除”的細胞和動物，從而為研究LIGHT多肽活性的某些方面提供材料。在本發(fā)明中，“可藥用的載體”是指不會在所施用的細胞或受試者中引發(fā)過敏反應或其他不適影響，并且不會影響藥物活性的載體。合適的可藥用載體包括但不限于，例如，一種或多種水、生理鹽水、磷酸緩沖液、左旋糖、甘油、乙醇和其他類似物，以及上述物質的組合?？伤幱幂d體還可進一步包括能提高核酸、多肽、病毒顆?；蚣毎谋４嫫谙藁蛐в玫奈⒘枯o助物質，例如濕潤劑或乳化劑、防腐劑或緩沖液。本發(fā)明中的“中和抗體”是指任何能夠清除或顯著降低目標病毒抗原結合毒力的抗體或抗體片段。特別地，以針對HBV的中和抗體為例，在一個具體的實施方式中，發(fā)明人使用了針對ayw亞型HBsAg的單克隆抗體H25B10作為所述中和抗體并顯示了其能夠實現本發(fā)明的目的。在另外的具體實施方式
中，發(fā)明人使用了特別針對在中國普遍存在的adr和adw亞型HBsAg的單克隆抗體scFvC-hlgGlFc和scFvD-hlgGlFc,由于這些抗體對于adr和adw亞型HBsAg的高親和力，它們也可以理想地作為用于本發(fā)明的目的的中和抗體。類似地，以抗HBV的中和抗體為例(對于其他病毒抗原，本領域技術人員可以參照此例進行選擇)，下列抗體也可以用于本發(fā)明的目的(1)對于其各自的目標病毒抗原具有與抗體H25B10、scFvC-hlgGlFc或scFvD-hlgGlFc同等水平的親和力(所述親和力可以為例如 Kd ( IxlO^8M,優(yōu)選 Kd ( Ixl(T9M)的抗體；(2)具有與抗體 H25B10、scFvC-hlgGlFc或scFvD-hlgGlFc相同或至少80% (例如至少85%、至少90%、至少95%或至少99% ) 序列一致的重鏈和/或輕鏈⑶R的抗體；或者(3)具有與抗體H25B10、scFvC-hlgGlFc或scFvD-hlgGlFc相同或至少80% (例如至少85%、至少90%、至少95%或至少99% )序列一致的重鏈和/或輕鏈可變區(qū)的抗體。然而，本領域技術人員將會明了，本發(fā)明中的所述中和抗體是用于清除預先存在的病毒抗原的，因此，凡是能夠中和目標病毒抗原的抗體均可用于本發(fā)明的目的。根據具體的實驗要求和應用目的，本領域技術人員完全有能力選擇合適的中和抗體，從而達到降低免疫耐受性的目的。其中所述scFvC-hlgGlFc的可變區(qū)序列由SEQ ID NO 5中所示的核酸序列所編碼的氨基酸序列組成，scFvD-hlgGlFc的可變區(qū)序列由SEQ ID NO 6中所示的核酸序列所編碼的氨基酸序列組成。本發(fā)明中的“試劑盒”指任何包含本發(fā)明所述的藥物組合物(或其組分)和所述中和抗體的組合、裝置或產品。特別地，其設計使得所述藥物組合物和所述中和抗體彼此不相混合，例如，二者位于不同的獨立空間中。本發(fā)明中的“預防有效量”或“治療有效量”指足以防止或減輕因病毒感染而引起的病狀或病況的量。例如，其可為含有105、106、IO7,108、109、10'IOllUO12或更高數量級的本發(fā)明的病毒顆粒的藥物組合物，或者可以是效果與所述病毒顆粒相當的本發(fā)明的核酸組合物、組合物、細胞、藥物組合物等的相應的量。本發(fā)明所述的藥物組合物的施用方式可以是傳統(tǒng)的施用途徑，包括但不限于靜脈滴注、肌肉注射、陰道、口服、口腔、舌下、眼球、局部、腸胃夕卜、直腸、葉鞘內、內胞漿網槽內、腹股溝、膀胱內、局部(如，粉劑、藥膏或滴劑)，或鼻腔途徑等。優(yōu)選的，所述施用途徑是注射及輸液形式。本發(fā)明中所涉及的藥物組合物可以各種形式存在，包括但不限于固體、半固體和液體的劑型，例如片劑、丸劑、粉末、溶液、分散液或懸浮液、脂質體、栓劑、注射用及輸液用溶液。本領域技術人員能夠根據具體的需要選擇合適的形式。適合通過腸胃外途徑注射的本發(fā)明的藥物組合物可能含有符合藥物制備要求的無菌水或非水溶液、氣霧劑、懸浮液或乳劑，可在臨用時重懸成可注射的溶液或氣霧劑的無菌粉劑。如適合的水性和非水性載體，工具和各種稀釋液如水、乙醇、多羥基化合物(如丙烯乙二醇、聚乙烯二醇、丙三醇及其類似物)，合適的混合物，菜油(如橄欖油)，和可用于注射的有機脂，如乙烷油酸，如使用卵磷脂衣殼維持藥物的合適流動性，如使用氣霧劑、表面活性劑以維持合適的顆粒尺寸。本發(fā)明所述的藥物組合物還可含有一些起保護性、保濕、乳化和氣霧化的佐劑，也可以含有預防微生物污染的速溶成分，如各種抗細菌試劑、抗真菌試劑，如對羥苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸及類似物。也可以包括維持滲透壓的試劑，如糖、NaCl及其類似物。還可使用延長吸附的試劑來延長注射用藥物成分吸附時間，如單硬脂酸鹽和凝膠等?？诜滔鄤┬桶z囊、片劑、粉劑、顆粒劑等。這些固相劑型中的活性成分至少混有一種傳統(tǒng)的惰性藥物賦形劑(或載體)如檸檬酸鈉、磷酸鈣，或(a)填充劑或添加劑如淀粉、乳糖、蔗糖、甘露糖和硅酸；(b)粘合劑，如羧甲基纖維素、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯樹膠；(c)濕潤劑，如甘油；(d)碎裂劑，如瓊脂，碳酸鈣，馬鈴薯粉或木 薯粉；(e)緩凝劑，如石蠟；(f)促吸收劑，如四氨基混合物；(g)保濕劑，如十六烷基醇和單硬脂酸甘油酯；(h)吸附劑，如高嶺土和斑脫土；(i)潤滑劑，如滑石，硬脂酸鈣，硬脂酸鎂，固體聚乙二醇，硫酸十二烷醇鈉，或其上述物質的混合物。在片劑和膠囊劑型中，可能還含有緩沖劑。固相劑型還可以制成改良釋放或脈沖釋放劑型，其是通過在上述提到的各種直接釋放賦形劑中添加一些能改變藥物釋放速率的賦形劑而形成，可以包含在上述劑型中也可以做成外衣的形式。速率釋放改造劑包括羧丙基甲基纖維素，甲基纖維素，碳甲基纖維素鈉，纖維素乙烷，醋酸纖維素，聚乙烯氧化物，黃原膠糖，異丙烯酸氨共聚物，氫化調味油，巴西棕櫚蠟，石蠟，鄰苯二酸醋酸纖維素，鄰苯二甲酸羧丙基甲基纖維素，甲基丙烯酸共聚物或上述物質的混合物。改良釋放和脈沖釋放劑型可能含有一種或多種具有改良釋放速率的賦形劑。用于口服的液體劑型，包括符合藥物要求的乳狀劑、溶液、懸浮液、糖漿和西也劑等。除了活性成分，所述液體劑型也可含有本領域常用的一些惰性溶液，如水或其它溶劑，可溶性試劑和乳化劑，如乙烷基醇，異丙基醇，乙烷基碳酸鹽，苯基安息香酸鹽，丙稀乙二醇，1，3-丁烯乙二醇，油，特別是，棉籽油，落花生油，玉米油，橄欖油，調味油和芝麻油，甘油，氫糠基醇，聚乙二醇和脂肪酸山梨醇酯，以及上述物質的混合物或類似的物質。除了這些惰性稀釋液，所述藥物組合物也可包括保濕劑、乳化劑、懸浮劑、糖化劑、調味劑和香味劑等佐劑。另外，所述藥物組合物還可包括乙氧基化均聚乙醇，聚氧乙烯烷基山梨醇和山梨聚糖脂，微晶纖維素，間氫氧化鋁，膨潤土，瓊脂聚合物和黃芪膠，或這些物質的混合物之類的懸浮劑。本發(fā)明所述的藥物組合物也可制成適合用于獸用預防和/或治療的混合物，或符合獸用的溶劑或初成藥，并根據普通獸醫(yī)和獸醫(yī)從業(yè)者的要求制成最適合某種特定動物的給藥劑量和途徑藥物的合適劑型。本發(fā)明所述的核酸組合物、組合物、病毒顆粒、藥物組合物或試劑盒還可以與其他的抗病毒試劑或療法聯合施用，而用于預防或治療由病毒感染引起的疾病，例如物理或化學療法。其中，其它抗病毒試劑包含但不限于利巴韋林，金剛燒，羧基脲，IL-2, IL-12和五羧鏈胞酸。
本領域技術人員可以通過增加或減少持續(xù)或間斷施用本發(fā)明的藥物組合物的時間、劑量或施用策略等，根據具體的需求和受試者的個體情況，容易地選擇合理的施用方案。在本發(fā)明的一個具體實施方式
中，為了克服由HBsAg在轉基因小鼠或慢性感染的患者中持續(xù)的存在引起的免疫耐受性，發(fā)明人測試了新的策略。發(fā)明人首先使用HBsAg的中和抗體從淋巴組織中去除目標病毒抗原，從而降低耐受狀況并為更好地響應本發(fā)明的藥物組合物(例如，含有位于腺病毒載體上的、編碼LIGHT多肽和編碼HBsAg的多核苷酸的藥物組合物)做準備。發(fā)明人揭示了 1)所述藥物組合物產生強的CTL并產生針對HBsAg的抗體；2)HBsAg的中和抗體可以減少足夠的抗原負荷從而減少耐受性并允許所述藥物組合物破壞耐受性；3)用抗體進行預處理，隨后使用所述藥物組合物可以清除轉基因小鼠中或被HBsAg感染的人化小鼠模型中的HBV。因此，發(fā)明人已經通過使用中和抗體，繼而使用本發(fā)明的藥物組合物作為治療性疫苗開發(fā)出了清除病毒的新的策略。本領域技術人員能夠明了，在上述技術方案中，使用中和抗體的目的是為了清除預先存在的病毒抗原，因此，凡是 能夠中和目標病毒抗原的抗體均可用于本發(fā)明的目的。根據具體的實驗要求和應用目的，本領域技術人員完全有能力選擇合適的中和抗體，從而達到降低免疫耐受性的目的。下述的實施例僅用于闡釋本發(fā)明的目的，而不以任何方式限制本申請的保護范圍。實施例實施例I. Ad-LIGHT在肝內清除肝炎相關抗原I.重組AAV病毒可引起小鼠肝臟內的持續(xù)病毒感染發(fā)明人使用自我互補的腺相關病毒(scAAV)血清型8作為基因遞送載體。所述scAAV趨向于肝并且能夠高效地在體內轉導肝細胞。發(fā)明人構建了重組病毒AAV-GFP和AAV-HCV-核心，其中使用了 Ula啟動子來驅動GFP在肝細胞內的表達，其中AAV-GFP和AAV-HCV-核心的構建如PLoS One. 5(5) :el0585，2010中所描述。隨后，發(fā)明人通過向C57/BL6小鼠的門靜脈中注射16xlOnVp的重組病毒AAV-GFP或AAV-HCV-核心以獲得最大程度的肝轉導。之后，通過使用來自eGFP的引物進行PCR擴增，從而確定被感染的小鼠的肝組織中AAV基因組的相對數量。此外，發(fā)明人從被感染小鼠的肝臟中提取總蛋白，并通過蛋白質印跡法(Western Blotting)測定GFP蛋白的表達。發(fā)明人在注射AAV-GFP后86天將小鼠處死，并在肝的切片中觀察到了 GFP的表達。這一結果表明，AAV-GFP的感染導致肝內持續(xù)的GFP表達，而不引起免疫反應。因此，發(fā)明人高效地建立了帶有肝內持續(xù)GFP表達的AAV感染，而沒有引起強的肝浸潤或創(chuàng)傷。II. Ad-LIGHT能夠在肝臟內清除HCV-核心LIGHT蛋白會與其受體LTP R相互作用以使局部的趨化因子和粘著分子增加8’1(1，而這種增加將募集各種免疫細胞，包括DC和T細胞。此外，LIGHT可以通過HVEM協同刺激T細胞。因此，發(fā)明人進而想要測試是否能夠在肝內上調LIGHT蛋白的水平而清除肝內持續(xù)的AAV感染。由于腺病毒可以靶向肝組織，發(fā)明人使用復制缺陷性的腺病毒載體來表達LIGHT多肽(稱為Ad-LIGHT，參見圖I)，所表達的LIGHT多肽的氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示，編碼所述LIGHT多肽的多核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示。同時，使用表達半乳糖苷酶的重組腺病毒(Ad-LacZ)或Ad-null (不含任何外源插入片段的腺病毒載體)作為對照。其中，使用Ad5 (E1/E3-)腺病毒載體來構建Ad-LIGHT、Ad-LacZ和Ad-null，并使用CMV5啟動子來驅動LIGHT的表達，Ad-LIGHT、Ad-LacZ和Ad-null通過之前描述的方法8構建。發(fā)明人首先(在第0天)將2X101(lVp的AAV-HCV-核心通過門靜脈注射到C57/BL6小鼠或LT PR-/-小鼠中，從而在肝內建立持續(xù)的HCV感染(圖2A)。第9天時，再將
2.5xl010vp的Ad-LIGHT或Ad-null分別通過門靜脈注射到所述小鼠中(圖2A)。在注射AAV-HCV-核心之后第40天(第40天)將所述小鼠處死以確定肝內剩余的AAV含量。收集來自肝組織的RNA用于PCR，并對肝組織進行H&E染色，以檢測HCV和AAV基因組的表達，并檢測肝組織中淋巴細胞的募集情況。所述H&E染色依照本領域常用的一般步驟進行。發(fā)明人觀察到，用Ad-LIGHT處理時，所述小鼠顯示出其肝內表達的HCV核心被清除，但用Ad-null處理時沒有這一現象(圖2B)。進行PCR檢測以確定肝內的AAV基因組，得到了類似的結果。這些數據表明通過腺病毒載體在肝內異位表達LIGHT，使得LIGHT能夠清除已經建立的AAV感染。由LIGHT介導的AAV的清除與增加的肝內感染、肝內白細胞總 數(圖2C)的增加相關，這可以通過H&E染色確定。實施例2. Ad-LIGHT-HBAgs在野牛型小鼠中誘導強的應答。I. Ad-LIGHT-HBsAg的構建和重組腺病毒的生產使用非復制型腺病毒作為HBV疫苗的優(yōu)勢是I)低毒性；2)易于產生高滴度；3)有效刺激CTL的I類通路；和4)特異性靶向肝組織，但是本領域技術人員明了，也可選擇其他的載體(特別是病毒載體)達到本實驗的目的。發(fā)明人能夠生產腺病毒Ad-LIGHT-HBsAg并檢測其表達。首先，發(fā)明人通過下述方法構建了表達LIGHT和HBsAg的重組腺病毒用限制性內切酶BamHl和NotI消化質粒pcDNA3. I-LIGHT-HBsAg (其中HBsAg的氨基酸序列如SEQ IDNO. 4所示)，從而得到含有LIGHTcDNA的片段，并將其克隆到第一親本質粒pLEP-ubp (左端質粒，帶有四環(huán)素抗性(Tetr))的BamHl/Notl位點之間以獲得pLEP-LIGHT，其中所述含有LIGHT cDNA的片段位于人泛素(ubiquitin)啟動子(ubp)之后。隨后，將所述pLEP_LIGHT與第二個質粒pREP(右端質粒，帶有氨節(jié)青霉素(Ampr))相連,質粒pREP中的連接位點為位于其中編碼內含子的多核苷酸序列中的唯一的Cla I位點。使用\噬菌體包裝提取物包裝所獲得的連接產物，然后將其在Amp/Tet LB瓊脂平板上培養(yǎng)以選擇pLEP/pREP雜合粘粒。之后，使用Bgl II消化所獲得的粘粒以進一步識別含有LIGHT-HBsAg插入片段的重組粘粒。通過I-Ceu I消化將Ad-LIGHT-HBsAg DNA片段從所述重組粘粒中釋放出來，然后，不經進一步純化而用經I-Ceu I消化后的混合物轉染293細胞以生產重組腺病毒及病毒顆粒。II. Ad-LIGHT-HBsAg可以提供保護性抗原和對T細胞的共刺激并可作為引起免疫應答的強效疫苗病毒特異性CD8+T細胞是清除肝臟內病毒的關鍵的免疫細胞群，它們對于成功的治療性疫苗而言是關鍵的。提供保護性抗原和對T細胞的共刺激將允許淋巴細胞上更好的抗原呈現。LIGHT可以提供對T細胞的共刺激，而Ad-LIGHT-HBsAg可同時提供保護性抗原以及對T-細胞的共刺激，從而有效地刺激和擴增對HBsAg有特異性反應的T細胞。用IO9Vp上述得到的Ad-LIGHT-HBsAg或PBS刺激野生型小鼠。在第9天收集脾臟用于ELISPOT或流式細胞計數分析。用ELISPOT試驗測定分泌IFN- Y的T細胞。在這一試驗中，使用HBsAg或其片段(例如肽ENV190)作為刺激抗原，使用卵清蛋白(OVA)作為對照抗原，從而允許測定HBsAg特異性⑶8+T細胞應答。將脾細胞或淋巴結(DLN)細胞(反應細胞)重懸于添加了 10%FCS、2mmol/LL-谷氨酰胺、100單位/mL青霉素、和100 u g/ml鏈霉素的RPMI 1640中。向96孔HTS IP板(Millipore)的每個孔中加入l_4xl0 5個脾細胞或淋巴結細胞。以2. 5 y g/mL大鼠-抗-小鼠IFN- Y (克隆R4-6A2 ;BD_PharMingen)預包被所述96孔HTS IP板。其中反應細胞與抗原呈遞細胞(APC)的比率為10 I。孵育48小時之后，除去細胞并加入
2u g/mL生物素化的大鼠-抗-小鼠-IFN- y (克隆XMG I. 2 ；BD-PharMingen)。在4°C再孵育平板12小時，然后清洗平板以去除未結合的抗體。用0. g/mL抗生物素蛋白-辣根過氧化物酶(BD-PharMingen)在室溫孵育平板2小時，以檢測結合的抗體。加入底物3-氨基-9-乙基咔唑(AEC ;PharMingen)，所述底物用0. lmol/L乙酸和0. 003%過氧化氫稀釋，且溫育所述平板3至5分鐘。丟棄AEC溶液,并用水清洗平板6次。用ImmunoSpot分析儀(CTL)計數可見的細胞因子點，結果表示為產生細胞因子的細胞的數目/IO4細胞。通過這一試驗，發(fā)明人很容易地檢測到了對肽ENV190(即HBsAg)有反應的分泌IFN-Y的細胞(圖3A)，而不相關的對照蛋白OVA完全不能刺激所述細胞群體的產生。為了進一步檢測所述分泌IFN-Y的細胞群是否主要是⑶8+T細胞，發(fā)明人對脾細胞或DLN細胞進行了 CD8和IFNg的細胞內染色，具體步驟如下用HBsAg(liig/ml)在細胞培養(yǎng)物中刺激脾細胞或DLN細胞6小時，其中，在刺激2小時后向細胞中加入GolgiStop (BDPharMingen)。然后用經標記的表面抗體和細胞內抗-IFN y -FITC對細胞進行染色。上述細胞內染色或ELISPOT實驗的結果表明，Ad-LIGHT-HBsAg能夠誘導強的HBsAg特異性⑶8+T細胞應答，且這種應答并不限于CTL應答(圖3B)。此外，發(fā)明人還通過下述實驗發(fā)現，Ad-LIGHT-HBsAg在野生型和HBsAg轉基因小鼠中都引起了抗-HBsAg抗體應答。用ELISA檢測小鼠血清中的抗-HBsAg抗體，具體實驗步驟如下用 2U/ml HBsAg 于 4°C過夜包被 ELISA 平板(Dynex Technologies, Chantilly,Virginia, USA)。用水清洗平板并用PBS/0. I % BSA封閉。將血清樣品稀釋為各種濃度，并用 AP-綴合的山羊-抗-小鼠 IgG(Southern Biotechnology Associates,Birmingham,Alabama, USA)檢測所結合的抗體。用分光光度計(Molecular Devices, Menlo Park,California,USA)在405nm處測量0D。其中，在HBsAg轉基因小鼠中產生強的應答是有重要意義的，雖然這些轉基因小鼠耐受HBsAg刺激，但是它們仍然對本發(fā)明的Ad-LIGHT-HBsAg產生應答(圖4)。此類轉基因小鼠至今為止對許多治療性疫苗有抗性，而本發(fā)明的Ad-LIGHT-HBsAg不僅在野生型小鼠中，也在所述轉基因小鼠中產生了強的抗-HBsAg抗體(圖4)。因此，在存在強耐受性及過量的抗原時，本發(fā)明的Ad-LIGHT-HBsAg是第一個有治療效果的疫苗。實施例3.在施用HBsAg抗體之后，Ad-LIGHT-HBsAg可在轉基因小鼠中產牛強的■實施例2的方法中，已存在的HBV抗原在慢性感染或轉基因肝細胞中可導致和保持耐受性，而這將限制這種治療性疫苗的臨床效力。的確，在病毒DNA已被建立起來之后，少有疫苗可在肝內清除病毒DNA。發(fā)明人提出在循環(huán)系統(tǒng)中減少HBV抗原可能可以減少抗原載荷、降低病毒誘導的耐受性，從而允許HBV的強疫苗作為治療性疫苗破壞耐受性。為了驗證這一想法，發(fā)明人進行了下述試驗首先發(fā)明人在小鼠體內注射0. 5mg抗-HBsAg的單克隆抗體H25B10以減少血清中的HBsAg，并在注射后的第3、5、7、8、10、15天取血以通過ELISA測定血清中的HBsAg水平。通過這一實驗，發(fā)明人發(fā)現施用HBsAg中和抗體可以非常有效地清除HBsAg轉基因小鼠血清中的HBsAg (圖5)。其中，由于HBsAg轉基因小鼠具有白蛋白啟動子，其隨著年齡而變強，未處理的轉基因小鼠具有增加的血清HBsAg(圖5)。發(fā)明人的研究表明HBsAg中和抗體可以很有效地中和HBsAg，而其可能創(chuàng)造使淋巴細胞應答的新條件。基于這一實驗結果，發(fā)明人首先用所述抗-HBsAg單克隆抗體H25B10隨時間推移耗盡血清中的HBsAg以去除由抗原誘導的耐受性，繼而用本發(fā)明的組合物(包含Ad-LIGHT-HBsAg)來靶向和協同刺激DC和T細胞，從而恢復或再活化那些被耐受的或被抑制的T細胞。HBsAg的持續(xù)感染誘導產生了耐受性并限制疫苗的效力。為了避免這一點，用中和抗體預處理轉基因小鼠以將血清病毒負荷減少至檢測不到的水平。因此，為了檢測·HBsAg，發(fā)明人使用了產生來自肝組織的持續(xù)抗原的HBsAg轉基因小鼠。發(fā)明人連續(xù)四周每周向所述小鼠施用所述的抗-HBsAg抗體H25B10以耗盡宿主中游離的抗原，在第二周使用所述的抗-HBsAg抗體H25B10來降低耐受性狀態(tài)之后，使用包含Ad-LIGHT-HBsAg (2xl09v.p.)的組合物進行疫苗接種以破除耐受性并產生強的免疫力。然后，發(fā)明人檢測了 CTL的產生和內源性抗體的產生。發(fā)明人發(fā)現，使用Ad-LIGHT-HBsAg可于2周內在HBsAg轉基因小鼠中破壞耐受性并產生眾多產生IFNg的T細胞(圖6A和B)。實驗結果顯示，即使在轉基因小鼠中，HBsAg的中和抗體也可以有效地清除HBsAg。因此，很明顯，進一步使用病毒抗原的中和抗體將能夠產生更強的免疫應答，從而有利于病毒抗原的清除。由此可見，先施用病毒抗原的中和抗體，而后施用本發(fā)明的藥物組合物以產生強的免疫應答的這種新策略能夠成為清除病毒感染的新的治療方法。由于單克隆抗體H25B10針對的是ayw亞型的HBsAg (所述ayw亞型HBsAg在歐美更常見)，發(fā)明人進一步開發(fā)了針對在中國普遍存在的adr和adw亞型HBsAg的單克隆抗體scFvC-hlgGlFc (其中編碼scFvC的DNA序列如SEQ ID NO 5所示，hlgGlFc的序列參見NCBI 參考序列 NM_001136019. 2)和 scFvD-hlgGlFc (其中編碼 scFvD 的 DNA 序列如 SEQ IDNO 6所示)，所述抗體的構建方法如Powers，D. B.等人的文章13中所描述的。實驗表明，單克隆抗體scFvC-hlgGlFc對于adr和adw亞型的HBsAg具有很高的親和力(圖7),其可以以很快的速度中和目標抗原，并且其親和力比單克隆抗體H25B10與目標抗原的親和力更高。此外，發(fā)明人發(fā)現單克隆抗體scFvD-hlgGlFc可以完全阻礙HBsAg與Chang肝細胞的結合(圖8),而通過這一靈敏度很高的實驗,也表明了抗體scFvD-hlgGlFc能夠很好地中和目標抗原，從而用于本發(fā)明的目的。所以，上述實驗表明，抗體scFvC-hlgGlFc和抗體scFvD-hlgGlFc也可以理想地作為用于本發(fā)明的目的的中和抗體。因此，由上面的實驗結果可以了解，凡是能夠中和目標病毒抗原的抗體均可用于本發(fā)明的目的。根據具體的實驗要求和應用目的，本領域技術人員完全有能力選擇合適的中和抗體，從而達到降低免疫耐受性的目的。參考文獻
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權利要求
1.分離的核酸分子，其包含 (a)編碼LIGHT多肽的多核苷酸或與之互補的多核苷酸；和 (b)編碼病毒抗原的多核苷酸或與之互補的多核苷酸。
2.權利要求I所述的分離的核酸分子，其中所述編碼LIGHT多肽的多核苷酸包含 (i)序列如SEQID NO 2所示的多核苷酸或其片段；或 (ii)因為遺傳密碼簡并性而與(i)的多核苷酸在密碼子序列中不同的多核苷酸。
3.權利要求I或2所述的分離的核酸分子，其中所述病毒抗原選自引起腫瘤或慢性病原體感染的病毒的免疫原性抗原，所述病毒為例如HBV、HCV、HIV、HPV或EBV ;例如，所述病毒抗原可以是HBV的免疫原性抗原，優(yōu)選地，所述病毒抗原為HBsAg或其免疫原性片段。
4.核酸組合，其包含至少兩種不同的核酸分子，其中所述至少兩種不同的核酸分子中包含 (a)編碼LIGHT多肽的多核苷酸或與之互補的多核苷酸；和 (b)編碼病毒抗原的多核苷酸或與之互補的多核苷酸。
其中，所述(a)和(b)中的多核苷酸位于相同和/或不同的核酸分子中。
5.權利要求4所述的核酸組合，其中所述編碼LIGHT多肽的多核苷酸包含 (i)序列如SEQID NO 2所示的多核苷酸或其片段；或 (ii)因為遺傳密碼簡并性而與(i)的多核苷酸在密碼子序列中不同的多核苷酸。
6.權利要求4或5所述的核酸組合，其中所述病毒抗原選自引起腫瘤或慢性病原體感染的病毒的免疫原性抗原，所述病毒為例如HBV、HCV、HIV、HPV或EBV ;例如，所述病毒抗原可以是KW的免疫原性抗原,優(yōu)選地,所述病毒抗原為HBsAg或其免疫原性片段。
7.載體，其包含權利要求1-3中任一項所述的分離的核酸分子。
8.權利要求7所述的載體,其為病毒載體,例如選自腺病毒載體、腺伴隨病毒載體、逆轉錄病毒載體、鼠哈維肉瘤病毒載體、鼠乳腺腫瘤病毒載體、勞斯肉瘤病毒載體、SV40-型病毒載體、多瘤病毒載體、EB病毒載體、乳頭狀瘤病毒載體、皰疹病毒載體、牛痘病毒載體、脊髓灰質炎病毒載體和RNA病毒載體；優(yōu)選地，所述病毒載體為腺病毒載體。
9.載體系統(tǒng)，其包含至少兩個載體，所述至少兩個載體中包含 (a)編碼LIGHT多肽的多核苷酸或與之互補的多核苷酸；和 (b)編碼病毒抗原的多核苷酸或與之互補的多核苷酸； 其中，所述(a)和(b)中的多核苷酸位于相同和/或不同的載體中。
10.權利要求9所述的載體系統(tǒng)，其中所述編碼LIGHT多肽的多核苷酸包含 (i)序列如SEQID NO 2所示的多核苷酸或其片段；或 (ii)因為遺傳密碼簡并性而與(i)的多核苷酸在密碼子序列中不同的多核苷酸。
11.權利要求10所述的載體系統(tǒng)，其中所述病毒抗原選自引起腫瘤或慢性病原體感染的病毒的免疫原性抗原，所述病毒為例如HBV、HCV、HIV、HPV或EBV ;例如，所述病毒抗原可以是HBV的免疫原性抗原，優(yōu)選地，所述病毒抗原為HBsAg或其免疫原性片段。
12.權利要求9-11中任一項所述的載體系統(tǒng)，其中所述至少兩個載體為病毒載體，且彼此獨立地選自例如腺病毒載體、腺伴隨病毒載體、逆轉錄病毒載體、鼠哈維肉瘤病毒載體、鼠乳腺腫瘤病毒載體、勞斯肉瘤病毒載體、SV40-型病毒載體、多瘤病毒載體、EB病毒載體、乳頭狀瘤病毒載體、皰疫病毒載體、牛痘病毒載體、脊髓灰質炎病毒載體和RNA病毒載體；優(yōu)選地，所述病毒載體為腺病毒載體。
13.組合物，其包含LIGHT多肽和病毒抗原。
14.權利要求13所述的組合物，其中所述LIGHT多肽包含SEQIDNO 1所示的氨基酸序列、其片段或變體，且足以刺激細胞毒性T淋巴細胞；例如，所述變體為在SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列或其片段中經過一個或多個保守氨基酸置換而得到的氨基酸序列。
15.權利要求13或14所述的組合物，其中所述病毒抗原選自引起腫瘤或慢性病原體感染的病毒的免疫原性抗原，所述病毒為例如HBV、HCV、HIV、HPV或EBV ;例如，所述病毒抗原可以為HBV的免疫原性抗原,優(yōu)選地,所述病毒抗原為HBsAg或其免疫原性片段。
16.病毒顆粒，其包含權利要求8所述的載體，權利要求12所述的所述的載體系統(tǒng)，或 權利要求13-15中任一項所述的組合物；例如，所述病毒顆粒為腺病毒顆粒。
17.宿主細胞，其包含權利要求7-8中任一項所述的載體、權利要求9-12中任一項所述的載體系統(tǒng)、或權利要求16所述的病毒顆粒。
18.權利要求1-3中任一項所述的分離的核酸分子、權利要求4-6中任一項所述的核酸組合、權利要求7-8中任一項所述的載體、權利要求9-12中任一項所述的載體系統(tǒng)、權利要求13-15中任一項所述的組合物或權利要求16所述的病毒顆粒用于制備藥物的用途，其中所述藥物用于預防和/或治療由病毒引起的腫瘤或慢性病原體感染，例如與HBV、HCV、HIV、HPV或EBV感染相關的病癥或病況；特別地，所述藥物可以用于預防和/或治療肝內的病毒感染，例如乙型肝炎病毒感染，例如所述藥物用于刺激和擴增對HBsAg有特異性反應的T細胞。
19.藥物組合物，其包含 (i)權利要求1-3中任一項所述的分離的核酸分子、權利要求4-6中任一項所述的核酸組合、權利要求7-8中任一項所述的載體、權利要求9-12中任一項所述的載體系統(tǒng)、權利要求13-15中任一項所述的組合物或權利要求16所述的病毒顆粒；和 (ii)任選地可藥用的載體。
20.一種試劑盒，其包含權利要求19中所述的藥物組合物和針對病毒抗原的中和抗體，其中 所述中和抗體所針對的病毒抗原與所述藥物組合物中分離的核酸分子、核酸組合、載體、載體系統(tǒng)、組合物或病毒顆粒所編碼或包含的病毒抗原可以相同或不同；優(yōu)選地，所述中和抗體所針對的病毒抗原與所述藥物組合物中分離的核酸分子、核酸組合、載體、載體系統(tǒng)、組合物或病毒顆粒所編碼或包含的病毒抗原是相同的；并且其中，所述藥物組合物和所述中和抗體彼此不相混合。
21.權利要求20所述的試劑盒，其進一步包含使用說明書，從所述使用說明書中可以了解到在施用所述藥物組合物之前，至少施用一次所述中和抗體。
22.權利要求20或21所述的試劑盒，其中所述中和抗體所針對的病毒抗原與所述藥物組合物中分離的核酸分子、核酸組合、載體、載體系統(tǒng)、組合物或病毒顆粒所編碼或包含的病毒抗原是相同的，均為HBsAg或其免疫原性片段。
23.權利要求22所述的試劑盒，其中所述針對病毒抗原的中和抗體為任何能夠中和HBsAg或其免疫原性片段的中和抗體；例如，所述中和抗體選自 (i)單克隆抗體H25B10、可變區(qū)序列包含SEQ ID NO :5中所示的核酸序列所編碼的氨基酸序列的抗體或可變區(qū)序列包含SEQ ID NO :6中所示的核酸序列所編碼的氨基酸序列的抗體；或 (ii)與(i)中的抗體具有同等水平的抗原親和力的抗體，所述親和力為例如Kd ( 1x10_8M，優(yōu)選 Kd ( IxIO-9M0
24.權利要求23所述的試劑盒，其中所述針對病毒抗原的中和抗體的重鏈CDR1-3分別與(i)中的任一抗體的重鏈⑶R1-3相同。
25.權利要求23或24所述的試劑盒，其中所述針對病毒抗原的中和抗體的輕鏈⑶R1-3分別與⑴中的任一抗體的輕鏈⑶R1-3相同。
26.權利要求25所述的試劑盒，其中所述針對病毒抗原的中和抗體的重鏈和輕鏈⑶R1-3分別與(i)中的同一抗體的重鏈和輕鏈⑶R1-3相同。
27.權利要求23-26中任一項所述的試劑盒，其中所述針對病毒抗原的中和抗體的重鏈可變區(qū)序列與(i)中的任一抗體的重鏈可變區(qū)序列相同。
28.權利要求23-27中任一項所述的試劑盒，其中所述針對病毒抗原的中和抗體的輕鏈可變區(qū)序列與(i)中的任一抗體的輕鏈可變區(qū)序列相同。
29.權利要求28中所述的試劑盒，其中所述針對病毒抗原的中和抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)序列分別與(i)中的同一抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)序列相同。
30.權利要求19中所述的藥物組合物與針對病毒抗原的中和抗體共同用于制備藥物的用途，其中 所述中和抗體所針對的病毒抗原與所述藥物組合物中分離的核酸分子、核酸組合、載體、載體系統(tǒng)、組合物或病毒顆粒所編碼或包含的病毒抗原可以相同或不同；優(yōu)選地，所述中和抗體所針對的病毒抗原與所述藥物組合物中分離的核酸分子、核酸組合、載體、載體系統(tǒng)、組合物或病毒顆粒所編碼或包含的病毒抗原是相同的；并且 其中所述藥物用于預防和/或治療由病毒引起的腫瘤或慢性病原體感染，例如與HBV、HCV、HIV、HPV或EBV感染相關的病癥或病況；特別地，所述藥物可以用于預防和/或治療肝內的病毒感染，例如乙型肝炎病毒感染，例如所述藥物用于刺激和擴增對HBsAg有特異性反應的T細胞。
31.權利要求30所述的用途，其中所述中和抗體所針對的病毒抗原與所述藥物組合物中分離的核酸分子、核酸組合、載體、載體系統(tǒng)、組合物或病毒顆粒所編碼或包含的病毒抗原是相同的，均為HBsAg或其免疫原性片段；并且其中所述藥物用于預防和/或治療乙型肝炎病毒感染，例如所述藥物用于刺激和擴增對HBsAg有特異性反應的T細胞。
32.權利要求31所述的用途，其中所述針對病毒抗原的中和抗體選自權利要求23-29的任一項中所述的中和抗體。
33.LIGHT多肽、或編碼LIGHT多肽的多核苷酸用于制備藥物的用途，所述藥物用于預防和/或治療肝臟內的病毒感染。
34.權利要求33所述的用途，其中所述病毒為HBV或HCV。
35.權利要求33-34中任一項所述的用途，其中所述LIGHT多肽包含SEQID NO:l所示的氨基酸序列、其片段或變體，且足以刺激細胞毒性T淋巴細胞；特別地，所述變體為在SEQID NO :I所示的氨基酸序列或其片段中經過一個或多個保守氨基酸置換而得到的氨基酸序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及病毒感染的預防和/或治療領域，特別是對由病毒感染引起的疾病，例如肝炎的預防和/或治療。本發(fā)明涉及利用LIGHT多肽，或者編碼所述LIGHT多肽的多核苷酸在肝內預防和/或治療由病毒感染引起的疾病或病況。本發(fā)明還涉及LIGHT多肽、病毒抗原、和/或所述病毒抗原的高親和性中和抗體的組合，及其預防和/或治療病毒感染的用途和方法。
文檔編號C12N1/19GK102787119SQ201110126289
公開日2012年11月21日 申請日期2011年5月17日 優(yōu)先權日2011年5月17日
發(fā)明者傅陽心 申請人:傅陽心