專利名稱：組成型干擾棉花細胞分裂素代謝相關(guān)基因及其在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，具體涉及干擾棉花細胞分裂素代謝相關(guān)基因的載體及應(yīng)用以及含有上述表達載體的轉(zhuǎn)基因棉花的制備方法。
背景技術(shù)：
棉花是世界上最重要的天然纖維作物，也是最重要的經(jīng)濟作物。我國是世界上最大的紡織品生產(chǎn)國和消費國，棉花產(chǎn)業(yè)在我國的國民經(jīng)濟中具有舉足輕重的地位。隨著全球經(jīng)濟在經(jīng)歷衰退之后的逐步復(fù)蘇，中國紡織行業(yè)將恢復(fù)增長，棉花需求量將相應(yīng)增加(王莉，杜珉，農(nóng)業(yè)展望，2009, 。食品與農(nóng)業(yè)政策研究會(Food and A gricultural Policy Research Institute, FAPRI)預(yù)測，未來10年內(nèi)，中國棉花單位面積產(chǎn)量和栽培面積沒有明顯變化，但由于需求的持續(xù)增加，導(dǎo)致每年進口大量棉花才能滿足國內(nèi)需求，到 2020年甚至需要進口 30%的棉花。對棉花生產(chǎn)育種來說，這既是機遇，更是挑戰(zhàn)。因為經(jīng)濟的進步、人口的增加使得可用耕地面積日漸減少，與此同時人民群眾對純棉產(chǎn)品的需要卻不斷增加。如何在不占用有限耕地資源的前提下增加棉花的產(chǎn)量就成為擺在廣大棉花科研工作者面前的一個重要課題。能否迅速提高我國棉花產(chǎn)量，直接關(guān)系到我國棉花產(chǎn)業(yè)的興衰和紡織品生產(chǎn)加工業(yè)的生存與發(fā)展。棉花的產(chǎn)量和品質(zhì)性狀為多基因控制的數(shù)量性狀，且產(chǎn)量與品質(zhì)性狀之間存在遺傳上的負相關(guān)。棉花栽培品種主要是陸地棉，而優(yōu)良纖維品質(zhì)基因主要源于二倍體的瑟伯氏棉(纖維強度)、異常棉(纖維強度與細度)以及四倍體的海島棉(纖維強度與細度) 等。這些優(yōu)良性狀基因的利用，卻在常規(guī)育種中受到諸多限制，單靠現(xiàn)有的棉花遺傳種質(zhì)資源和常規(guī)育種手段已經(jīng)難以大幅度提高棉花產(chǎn)量，難以滿足快速發(fā)展的紡織工藝革命對纖維品質(zhì)的要求。利用基因工程技術(shù)育種可以打破物種間的遺傳障礙，實現(xiàn)優(yōu)良目的基因的定向轉(zhuǎn)移，同時具有后代易于穩(wěn)定，育種周期短等優(yōu)點，這為棉花纖維產(chǎn)量和品質(zhì)的改良提供了新的途徑。但是目前人們還未得到與棉花產(chǎn)量和品質(zhì)(強度、細度和長度等)直接相關(guān)的基因，使得利用基因工程提高棉花纖維缺乏有效的目的基因。人們對棉花產(chǎn)量和品質(zhì)形成的分子機理也知之甚少。這些都極大的阻礙了對棉花纖維進行產(chǎn)量和品質(zhì)改良的進程。細胞分裂素是一類N6取代的腺嘌呤同系物，參與調(diào)節(jié)細胞分裂、芽的發(fā)育、根的分枝、葉綠體的發(fā)育、葉片的發(fā)育及衰老(Mok et al，1994，Cytokinins chemistry, activity, and function, CRC Press Boca Raton, pp 155—156)。細胞分裂素氧化酶 CKX，不可逆降解側(cè)鏈含不飽和雙鍵的細胞分裂素，在調(diào)節(jié)細胞分裂素含量上起十分重要的作用(Armstrong et al, 1994, Cytokinins :chemistry, activity, and function, CRC Press Boca Raton, pp 139-154)。Namken(Namken, 1984, Proceedings Beltwide Cotton Production Research Conferences)發(fā)現(xiàn)在1/3花蕾期和初花期葉面噴施細胞分裂素明顯提高了棉花纖維的產(chǎn)量。葉面噴施細胞分裂素復(fù)合物Burst能促進芽的起始和發(fā)育， 增加棉花花蕾發(fā)育因此引起豐產(chǎn)(Mayeux et al, 1985, Proceedings Beltwide CottonProduction Research Conferences)。細胞分裂素復(fù)合物能明顯增加棉鈴的數(shù)目和第一
(Mayeux et al, 1987, Proceedings Beltwide Cotton Production Research Conferences) 0美國九個州九年共83個實驗點外施細胞分裂素復(fù)合物增加了 帛花產(chǎn)量，平均達至IJ 491 int/ha(Parker and Salk, 1990, Proceedings Beltwide Cotton Production Research Conferences)。Hedin (Hedin, 1991,Journal of Agricultural and Food Chemistry 39 :549-553 ；Hedin and McCarty,1994, Journal of Agricultural and Food Chemistry 42:1355-1357)發(fā)現(xiàn)在田間施用激動素能使棉花增產(chǎn)。葉面噴施細胞分裂素4PU-30和矮壯素DPC混合物能使棉花纖維產(chǎn)量增加17 %，而只噴施DPC僅增產(chǎn) 7% (Deng,1996,China Cotton 23 13—14)。Sawan(Sawan et al,2000,Environmental and Experimental Botany 44 :59-68)發(fā)現(xiàn)，海島棉Giza75種子在播種前用5mg L-1的激動素處理，在播種后60天和70天用相同濃度的激動素葉面噴施棉花能提高棉花的萌發(fā)率，棉花的種子和纖維產(chǎn)量。現(xiàn)蕾期和早花期噴施Cytokin (主要成分是細胞分裂素)和Cytokin 與Pix(M印iquat Chloride，赤霉素拮抗劑)的混合物都能增加棉花的產(chǎn)量(Albers and Schnakenberg，1994，Agriculture publication G :4258)。中棉所 30 的苗期和蕾期葉施 0. 00001%異戊烯基腺嘌呤水劑能增加株高、單株果枝數(shù)，提高單株成鈴數(shù)、增加鈴重、提高單產(chǎn)(郭宗培等，2001，江西棉花23:9-10)。棉花種子浸泡時、棉花幼苗的子葉期和六葉期施用低濃度的細胞分裂素能減少頂端優(yōu)勢、增加果枝數(shù)、增加花蕾數(shù)目，下胚軸增厚、延緩葉片衰老，增強根系發(fā)育(Burke, 2009, United States Patent :7634870)。外源施用細胞分裂素雖然有很好的效果，但所用勞動力成本高，且細胞分裂素的大量使用，不但增加了生產(chǎn)成本，而且會帶來環(huán)境污染。相比之下，通過控制細胞分裂素代謝酶基因，從內(nèi)源的角度來調(diào)節(jié)植株中的細胞分裂素含量，改變株型，提高棉花產(chǎn)量、干旱抗性，延緩衰老，是個十分有效的策略。這一策略至少具有下述幾方面的優(yōu)點1)效率高、 成本低，因為一旦將細胞分裂素氧化酶基因干擾序列導(dǎo)入植物，就無需外加施用細胞分裂素或其它處理。而且，外源施用細胞分裂素是通過擴散進入細胞，而內(nèi)源激素則產(chǎn)生自細胞內(nèi)。因此，用轉(zhuǎn)基因內(nèi)源控制細胞分裂素的效果往往比外源施用更好；幻對作物負面影響小，由于細胞分裂素的作用濃度很低，通過調(diào)節(jié)細胞分裂素氧化酶基因的表達，可實現(xiàn)細胞分裂素含量的適當增加，不會產(chǎn)生濃度過高對植物的發(fā)育帶來的不良影響；；3)與外源施用細胞分裂素和人工合成生產(chǎn)調(diào)節(jié)物質(zhì)相比，內(nèi)源調(diào)控細胞分裂素氧化酶基因?qū)Νh(huán)境污染小，對人類健康造成的危害也小(Li Y et al，2004，Transgenics of plant hormones and their potential application in horticultural crops. In Geneticallt Modified Crops :their development,uses,and risks. New York :Food Products Press,101-112)。外源施用細胞分裂素能增加棉花產(chǎn)量，因此，研究者們試圖利用內(nèi)源增加細胞分裂素來提高產(chǎn)量。1999年John ME將涉及細胞分裂素生物合成的IPT基因置于纖維特異性啟動子E6下，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入陸地棉D(zhuǎn)P50中，轉(zhuǎn)基因植株的纖維品質(zhì)與野生型相比并、沒有改變(Basra AS et al, 1999, Cotton Fiber, New York :Food Products Press, 271-292)。Yu 等(Yu et al，2000，Acta Botanica Sinica 42 :59-63)將 IPT 基因置于菜豆種子Wiaseolin基因啟動子后，通過花粉管通道法導(dǎo)入中棉19、蘇棉12、泗棉3號等品種中，轉(zhuǎn)Phaseolin IPT基因棉花小苗普遍粗壯，根系很發(fā)達，側(cè)根數(shù)目約為對照的3_4倍， 然而大田生長的轉(zhuǎn)基因棉花外形與對照沒有差異，有些轉(zhuǎn)基因品系的纖維長度明顯變短。上述實驗不成功的原因可能在于細胞分裂素的過度積累是有害的，能導(dǎo)致生長矮化、產(chǎn)生欠發(fā)達的維管組織、失頂端優(yōu)勢；同時過量或低量合成細胞分裂素的突變體、信號傳導(dǎo)缺陷的突變體都難以獲得衰老延緩的功能(段留生，2008，植物激素全成、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和作用，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，第3版)。蕃茄果實發(fā)育早期PZ130誘導(dǎo)IPT基因的表達使每株鈴數(shù)增加，纖維長度增加，強度增加，馬克隆值降低(Martineau and Davis, 2001, United States Patent :6329570B1)?？梢?，通過適當增加內(nèi)源細胞分裂素提高棉花纖維產(chǎn)量和品質(zhì)是可行的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種植物表達載體，其包含干擾棉花細胞分裂素代謝相關(guān)基因表達的核苷酸和啟動子，通過在棉花中組成型干擾細胞分裂素代謝相關(guān)基因表達， 調(diào)控細胞分裂素氧化酶的水平，從而改良植物性狀。將所述植物表達載體應(yīng)用于棉花纖維性狀的改良，增加棉花產(chǎn)量，解決現(xiàn)有的單位面積產(chǎn)量難以提高同時可用耕地有限的問題。本發(fā)明進一步提供所述植物表達載體在棉花纖維性狀改良上的應(yīng)用。本發(fā)明進一步提供基于所述植物表達載體制備轉(zhuǎn)基因植物的方法。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，所述植物表達載體至少含有由干擾棉花細胞分裂素代謝相關(guān)基因表達的核苷酸和組成型啟動子。所述植物表達載體通過將干擾細胞分裂素代謝相關(guān)基因表達的核苷酸與編碼組成型啟動子的核苷酸可操作地連接而構(gòu)建。優(yōu)選地，所述細胞分裂素代謝相關(guān)基因為細胞分裂素氧化酶CKX(cyt0kinin dehydrogenase)基因。更優(yōu)選地，所述細胞分裂素代謝相關(guān)基因為棉花細胞分裂素氧化酶基因(簡稱(^hCKX基因)。在一種實施方式中，所述干擾棉花細胞分裂素代謝基因表達的核苷酸為RNA干擾的棉花細胞分裂素氧化酶(RNA Interference Gossypium hirsutum. L cytokinin dehydrogenase)基因(簡稱RNAWhCKX基因)，該基因能夠干擾細胞分裂素氧化酶基因的mRNA表達，內(nèi)源調(diào)控細胞分裂素含量。優(yōu)選的組成型啟動子為花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S啟動子。優(yōu)選的植物表達載體具有如圖2所示的結(jié)構(gòu)。進一步地，通過所述植物表達載體轉(zhuǎn)染宿主而獲得的轉(zhuǎn)化體也屬于本發(fā)明的范圍。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供所述植物表達載體在棉花纖維性狀改良上的應(yīng)用。 通過RNA干擾，下調(diào)細胞分裂素氧化酶基因在棉花中的表達，在棉花中適度提高內(nèi)源細胞分裂素的含量，從而增加棉花蕾數(shù)，延緩棉花的衰老，提高干旱抗性，降低株高，提高棉花的產(chǎn)量，改善棉花的品質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供轉(zhuǎn)基因植物的制備方法，包括以下步驟1)獲得組成型啟動子核苷酸；幻獲得干擾細胞分裂素代謝相關(guān)基因表達的核苷酸；幻將步驟1)中分離克隆到的組成型啟動子核苷酸與步驟2)中分離克隆到的干擾細胞分裂素代謝相關(guān)基因的核苷酸進行融合，構(gòu)建表達組成型干擾細胞分裂素代謝相關(guān)基因的植物表達載體；4) 將步驟幻得到的表達組成型干擾細胞分裂素代謝相關(guān)基因的植物表達載體整合到棉花基因組中力)將通過步驟4)獲得的棉花進行進一步的培養(yǎng)、栽培，并獲得轉(zhuǎn)基因的棉花植株。在更詳細的實施方式中，所述方法包括步驟1)獲得組成型啟動子核苷酸；2)獲得干擾細胞分裂素代謝相關(guān)基因表達的核苷酸；幻將步驟1)中分離克隆到的組成型啟動子核苷酸與步驟2)中分離克隆到的干擾細胞分裂素代謝相關(guān)基因的核苷酸進行融合，構(gòu)
5建表達組成型干擾細胞分裂素代謝相關(guān)基因的植物表達載體；4)將步驟幻得到的表達組成型干擾細胞分裂素代謝相關(guān)基因的植物表達載體整合到棉花基因組中力)將通過步驟 4)獲得的棉花進行進一步的培養(yǎng)、栽培，并獲得轉(zhuǎn)基因的棉花植株。優(yōu)選地，本發(fā)明中所述細胞分裂素代謝相關(guān)基因為細胞分裂素氧化酶 CKX(cytokinin dehydrogenase)基因。更優(yōu)選地，所述細胞分裂素代謝相關(guān)基因為棉花細胞分裂素氧化酶基因(簡稱(^hCKX基因)。本發(fā)明中所指的“棉花纖維性狀”是指棉花纖維品質(zhì)性狀，包括纖維長度、細度、強
度、整齊度等。本發(fā)明中所指的“轉(zhuǎn)基因棉花”是指通過分子生物學(xué)、生物技術(shù)手段，將目標基因轉(zhuǎn)移到棉花中，從而使被改造棉花的遺傳物質(zhì)得到改造的棉花。用于改造的基因可以來源于植物、動物以及微生物或者人工合成改造。本發(fā)明中所指“衣分”是指籽棉上纖維重量對籽棉重量之比，以百分率表示。也就是纖維重量占整個種子及纖維總重量的比例。本發(fā)明通過大量研究和分析以及前期實驗，認為John和于曉紅等未能成功并不意味著調(diào)節(jié)內(nèi)源細胞分裂素含量來提高棉花產(chǎn)量的策略是不可行的。因為，既然外施低濃度的細胞分裂素能增加棉花纖維產(chǎn)量，那么，通過控制植物激素合成酶基因、或者代謝酶基因，從內(nèi)源角度來調(diào)節(jié)激素含量，增加棉花纖維產(chǎn)量，應(yīng)該是可行的。而現(xiàn)有研究的結(jié)果未能取得預(yù)期效果的原因關(guān)鍵在于未能找到內(nèi)源細胞分裂素含量適當增加的轉(zhuǎn)基因植株。 因此選擇適當增加內(nèi)源細胞分裂素含量的方法，才可以有效的影響棉花的生長發(fā)育，獲得預(yù)期的效果。但是，通過激素合成酶基因獲得的轉(zhuǎn)基因植株，內(nèi)源細胞分裂素含量往往增加較劇烈，難以獲得細胞分裂素含量適當增加的植株；然而采用PZ130組織特異性啟動子獲得了細胞分裂素含量增加的株系，轉(zhuǎn)基因棉花的鈴數(shù)、纖維長度、強度增加。本發(fā)明根據(jù)細胞分裂素合成酶和代謝酶的特點，創(chuàng)造性地采用了棉花細胞分裂素氧化酶tehCKX)基因來調(diào)節(jié)內(nèi)源細胞分裂素含量，并通過RNA干擾(ihCKX基因的表達，上調(diào)細胞分裂素含量，從中篩選出細胞分裂素含量適當增加的轉(zhuǎn)基因株系。本發(fā)明方法在選定了啟動子和目的基因的情況下，本發(fā)明的啟動子和目的基因融合成新的基因的方式可以采用本領(lǐng)域常用的方式，并可以將融合成的新的基因轉(zhuǎn)入本領(lǐng)域常用的載體中構(gòu)建成表達載體再轉(zhuǎn)入棉花中。顯然，上述表達載體可以構(gòu)建成含單個基因的單價載體，也可以構(gòu)建含多基因的雙價或三價等類型的載體。在使用本發(fā)明方法改良棉花的過程中，在整個生長發(fā)育過程中都可以表達形成雙鏈RNA，干擾目標基因的mRNA，本發(fā)明方法已經(jīng)提供了技術(shù)方案。本發(fā)明降低植株高度、延緩棉花衰老、增加干旱抗性進而提高產(chǎn)量的方法，是通過在棉花中組成型干擾細胞分裂素代謝酶相關(guān)基因，進而調(diào)控細胞分裂素氧化酶基因的表達，通過內(nèi)源調(diào)控棉花相應(yīng)激素含量的方式，控制棉花株型、延緩衰老、增加干旱抗性，達到提高棉花產(chǎn)量的目的。試驗結(jié)果證明，經(jīng)本發(fā)明提高棉花產(chǎn)量的方法所改良的棉花植株變矮，衰老明顯延緩，干旱抗性明顯提高，鈴重和纖維產(chǎn)量明顯提高，棉花纖維品質(zhì)沒有明顯變化。本發(fā)明方法簡便易行，效果顯著，能在不占用有限耕地的情況下，為紡織工業(yè)帶來更多的纖維原料，產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟效益。


圖1 干擾棉花細胞分裂素氧化酶基因表達載體的構(gòu)建流程圖Km，卡那霉素抗性基因；Amp，氨芐青霉素抗性基因；NPTII，新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因；⑶S，β-葡萄糖酸苷酶基因；35S，來源于花椰菜花葉病毒的植物組成性啟動子；Pnos， 冠癭堿合成酶基因啟動子；nos，冠癭堿合成酶基因終止子；LB，T-DNA左邊界；RB，T-DNA右邊界。用于構(gòu)建植物表達載體的骨架載體為PBI121基礎(chǔ)上改造的p5載體，具有CaMV 35S 啟動子調(diào)控下的GUS基因，便于在植物遺傳轉(zhuǎn)化的過程中對轉(zhuǎn)化子進行GUS染色的篩選。圖2 干擾棉花細胞分裂素氧化酶基因表達載體的結(jié)構(gòu)示意3 :35S =RNAiGhCKX轉(zhuǎn)基因棉花蓬中GhCKX基因的Real-time PCR分析(ihCKX基因在11個轉(zhuǎn)基因株系中表達程度不同，株系13-1、16-8的表達量最低，株系16-5、16-7、5-6、11-1、Ρ中的表達水平依次升高。WT，未轉(zhuǎn)化的冀棉14號棉花作為對照。圖4 :35S :RNAi(ihCKX轉(zhuǎn)基因棉花與對照幼嫩莖反玉素(ZT)和反玉素核苷(ZR)比較通過測定盛花期莖(莖尖下2cm處，取3cm左右莖段)細胞分裂素含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 轉(zhuǎn)基因株系P、5-6、16-5和16-7的ZT和觀含量之和高于野生型，特別是ZT含量，野生型植株含量很低或檢測不到。WT，未轉(zhuǎn)化的冀棉14號棉花作為對照；N/A，指沒有檢測到或者含量很低。所有株系重復(fù)取材測定3次，取平均值進行作圖分析。圖5 :35S =RNAiGhCKX轉(zhuǎn)基因棉花與對照開花后一天每鈴胚珠數(shù)目的比較統(tǒng)計開花后一天棉鈴胚珠數(shù)目發(fā)現(xiàn)，株系16-5、16-7、16-8的每鈴胚珠數(shù)目顯著降低。WT，未轉(zhuǎn)化的冀棉14號棉花作為對照。所有株系統(tǒng)計30個棉鈴，取平均值進行作圖分析。圖6 :35S =RNAiGhCKX轉(zhuǎn)基因棉花與對照植株形態(tài)和現(xiàn)蕾數(shù)考察通過調(diào)查盛花期植株高度、果枝數(shù)、果枝間距和現(xiàn)蕾數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株的株高、果枝間距顯著降低(A)；現(xiàn)蕾數(shù)目增加(A、B)，果枝數(shù)目沒有變化。P，35S:RNAi(ihCKX 轉(zhuǎn)基因棉花株系P ；WT，未轉(zhuǎn)化的冀棉14號棉花作為對照。隨機選擇30株植株調(diào)查，取其平均值進行作圖分析。圖7 :35S =RNAiGhCKX轉(zhuǎn)基因棉花與對照子葉脫落率統(tǒng)計統(tǒng)計種子萌發(fā)后37d和42d田間中試植株的子葉脫落情況，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株的子葉脫落顯著低于野生型。P，35S :RNAi(ihCKX轉(zhuǎn)基因棉花株系P ;WT，未轉(zhuǎn)化的冀棉14號棉花作為對照。共統(tǒng)計120株棉花植株調(diào)查，以40株為一個重復(fù)，取其平均值進行作圖分析。圖8 :35S =RNAiGhCKX轉(zhuǎn)基因棉花與對照子葉可溶性蛋白質(zhì)含量的比較檢測種子萌發(fā)后43d和64d田間中試植株的子葉可溶性蛋白質(zhì)含量，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株子葉可溶性蛋白質(zhì)含量顯著高于野生型；萌發(fā)后43d(A)的可溶性蛋白質(zhì)含量顯著高于64d含量(B)。P，35S =RNAiGhCKX轉(zhuǎn)基因棉花株系P ；WT,未轉(zhuǎn)化的冀棉14號棉花作為對照。隨機選取3片子葉進行檢測，取其平均值進行作圖分析。圖9 :35S =RNAiGhCKX轉(zhuǎn)基因棉花與對照主莖葉脫落率統(tǒng)計統(tǒng)計種子育種移栽138d后田間中試植株的主莖第一葉到第十三片葉脫落情況， 結(jié)果表明，除第一、二和第十三片葉以外，轉(zhuǎn)基因植株的主莖葉脫落顯著低于野生型。P，35S :RNAi(ihCKX轉(zhuǎn)基因棉花株系P ;WT，未轉(zhuǎn)化的冀棉14號棉花作為對照。共統(tǒng)計120株棉花植株調(diào)查，以40株主莖葉脫落率為一個重復(fù)，取其平均值進行作圖分析。圖10 :35S =RNAiGhCKX轉(zhuǎn)基因棉花與對照主莖第十片葉表型的比較觀察種子育種移栽135d后田間中試植株主莖第十片葉表型，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株葉片沒有明顯黃化衰老，而野生型葉片已呈現(xiàn)出顯著的黃化、衰老情況。P，35S: RNAiGhCKX轉(zhuǎn)基因棉花株系P ；WT,未轉(zhuǎn)化的冀棉14號棉花作為對照。標尺表示1cm。圖11 :35S =RNAiGhCKX轉(zhuǎn)基因棉花與對照主莖第十片葉可溶性蛋白質(zhì)含量的比較測定育種移栽135d后田間中試植株主莖第十片葉可溶性蛋白質(zhì)含量，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株葉片可溶性蛋白質(zhì)含量顯著高于野生型。P，35S =RNAiGhCKX轉(zhuǎn)基因棉花株系P ； WT，未轉(zhuǎn)化的冀棉14號棉花作為對照。隨機選取3片主莖葉進行檢測，取其平均值進行作圖分析。圖12 :35S :RNAi(ihCKX轉(zhuǎn)基因棉花與對照主莖葉的葉綠素、類胡蘿卜素含量的比較檢測育種移栽135d后田間中試植株主莖第十片葉的葉綠素、類胡蘿卜素含量， 結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株的葉綠素含量(A)和類胡蘿卜素含量(B)顯著高于野生型。P，35S RNAiGhCKX轉(zhuǎn)基因棉花株系P ；WT,未轉(zhuǎn)化的冀棉14號棉花作為對照。隨機選取3片主莖葉進行檢測，取其平均值進行作圖分析。圖13 :35S =RNAiGhCKX轉(zhuǎn)基因棉花與對照主莖葉光合速率的比較用LI-6400便攜式光合作用測定儀檢測第六和第十片主莖葉的光合速率，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株的光合速率高于野生型，特別是第六片葉光合速率明顯比野生型高。P，35S RNAiGhCKX轉(zhuǎn)基因棉花株系P ；WT,未轉(zhuǎn)化的冀棉14號棉花作為對照。選取10片主莖葉進行檢測，取其平均值進行作圖分析。
具體實施例方式以下結(jié)合附圖對本發(fā)明進行進一步的詳細說明，但以下說明并不對本發(fā)明進行限定，任何對本發(fā)明的變形和改變，只要不脫離本發(fā)明的精神，均應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求所定義的范圍。本發(fā)明實施例中的試劑藥品未做具體說明的均為普通市售，材料方法未做具體說明的均參考《分子克隆實驗指南》(Sambrook和Russell，2001)。所用的棉花實驗材料為冀棉 14,來自陸地棉(Gossypium hirsutum)。實施例一棉花基因組的制備1、DNA 的提取選取棉花幼葉0. 5-lg，在液氮中快速研磨至精細粉末，加入3mL 65°C預(yù)熱的CTAB 提取液(IOOmmol/L Tris-HCl (ρΗ8· 0)，20mmol/L EDTA(ρΗ8· 0)，1. 5mol/LNaCl, 2% CTAB (W/ V), 4% PVP40 (ff/V)和2%巰基乙醇(V/V)，PVP和巰基乙醇使用前加入)，快速顛倒振蕩混勻。65°C水浴40min，然后加入ImL 5mol/LKAc，冰浴20min后，用等體積的氯仿異戊醇 (24 1)抽提1次(10，000r/min，4°C離心5min)，取上清，加入2/3倍體積的_20°C預(yù)冷異丙醇，混勻靜置約30min，用玻棒挑出絮狀沉淀，用75%的乙醇漂洗三次，再用無水乙醇漂洗1次，自然風(fēng)干，重懸于500 μ L TE中。加入IyL RNaseA (10mg/ml)，37°C處理lh。再用酚(ρΗ8· 0)氯仿異戊醇(25 24 1)和氯仿異戊醇(24 1)各抽提1次(10，OOOr/ min，4°C離心5min)，取上清，乙醇沉淀。沉淀用75%的乙醇漂洗，自然風(fēng)干，溶于200 μ L TE 中，-20°C保存?zhèn)溆谩?. RNA 的提取選取約3g新鮮棉花材料，在液氮中快速磨成至精細粉末，裝入50mL離心管，加入 15mL 65°C預(yù)熱的 RNA提取液 CTAB (ff/V) ,2% PVP (W/V)，IOOmmol/L Tris-HCl (pH8. 0)， 0. 5g/L Spermidine，2. Omol/L NaCl，2 %巰基乙醇(V/V，使用前加入))，顛倒混勻。65 V 水浴3 lOmin，期間混勻2 3次。氯仿異戊醇Q4 1)抽提2次(10，000r/min, 室溫，5min)。取上清，加入1/4體積lOmol/L LiCl溶液，4 °C放置6h，以氯仿異戊醇 (25 24 1)各抽提1次(10，000r/min，室溫，5min)。加2倍體積的無水乙醇，在_70°C 冰箱沉淀30min以上。12，000r/min，4°C離心20min，棄上清。沉淀用200 μ L的DEPC處理水溶解。酚(ΡΗ4. 5)氯仿異戊醇05 24 1)、氯仿異戊醇Q4 1)各抽提1 次(10，000r/min,室溫，5min)。加1/10體積3mol/L NaAc溶液和2. 5倍體積的無水乙醇， 在-70°C冰箱沉淀30min以上。12，000r/min，4°C離心20min，棄上清。沉淀用70%的酒精漂洗一次，風(fēng)干。加200μ L的DEPC處理水溶解。用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量。3、基因組序列的PCR擴增
權(quán)利要求
1.一種植物表達載體，含有干擾棉花細胞分裂素代謝相關(guān)基因表達的核苷酸和組成型啟動子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物表達載體，其特征在于，所述植物表達載體至少包含RNA 干擾的棉花細胞分裂素氧化酶基因RNAWhCKX和花椰菜花葉病毒35S啟動子。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的植物表達載體，其特征在于，所述植物表達載體具有如圖2所示的結(jié)構(gòu)。
4.一種含有權(quán)利要求1所述的植物表達載體的轉(zhuǎn)基因植物的制備方法，包括下述步驟1)將干擾棉花細胞分裂素代謝相關(guān)基因表達的核苷酸與植物組成型啟動子可操作地連接；2)構(gòu)建含有干擾棉花細胞分裂素代謝相關(guān)基因表達的核苷酸和組成型啟動子的植物表達載體；3)用所述植物表達載體轉(zhuǎn)化宿主，獲得轉(zhuǎn)化體；4)用所述轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)化植物，獲得轉(zhuǎn)基因植物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其中所述干擾棉花細胞分裂素代謝相關(guān)基因表達的核苷酸為RNA干擾的棉花細胞分裂素氧化酶基因RNAWhCKX，具有如SEQ ID No. 3所示的序列，所述植物組成型啟動子為花椰菜花葉病毒35S啟動子。
6.權(quán)利要求1所述的植物表達載體在棉花纖維性狀改良中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1所述的植物表達載體在培育植物新品種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明將組成型啟動子與干擾棉花細胞分裂素氧化酶基因表達的核苷酸可操作地連接，構(gòu)建含RNA干擾的棉花細胞分裂素氧化酶基因的植物表達載體，將該植物表達載體整合到棉花基因組中，獲得轉(zhuǎn)基因的棉花。該方法通過在棉花中組成型干擾細胞分裂素代謝酶相關(guān)基因，進而調(diào)控細胞分裂素氧化酶基因的表達，控制棉花株型、延緩衰老、增加干旱抗性，達到提高棉花產(chǎn)量和改良棉花纖維品質(zhì)的目的。
文檔編號C12N15/84GK102229949SQ201110126039
公開日2011年11月2日 申請日期2011年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月13日
發(fā)明者侯磊, 劉文英, 劉若塵, 宋水清, 張瑞芝, 張覓, 曾其偉, 李先碧, 王劍, 白文欽, 肖月華, 裴炎, 趙娟 申請人:西南大學(xué)