專利名稱：：一種反向非病毒載體基因轉(zhuǎn)染的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及基因轉(zhuǎn)染
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種反向非病毒載體基因轉(zhuǎn)染的方法。
背景技術(shù)：
：基因治療自1989年首次進入臨床試驗以來，已經(jīng)經(jīng)歷了近二十年的發(fā)展，其應(yīng)用也從最初的針對遺傳性病癥的治療擴展到對獲得性疾病的防治，迄今為止已有上千例基因治療被批準(zhǔn)進入臨床試驗。而基因重組及轉(zhuǎn)染技術(shù)也進入到越來越多的研究領(lǐng)域，如組織工程與再生醫(yī)學(xué)等。對于基因重組及基因轉(zhuǎn)染而言，安全性好且能產(chǎn)生基因高效、定位表達的載體的構(gòu)建是關(guān)鍵所在。眾所周知，基因治療載體有病毒載體與非病毒載體兩大類，病毒載體盡管具有轉(zhuǎn)染效率高、基因表達持續(xù)時間長等優(yōu)點，但由于其安全性差，易引起免疫反應(yīng)以及易整合入基因組帶來突變風(fēng)險等，其使用往往受到限制。非病毒載體因其安全和易于大量獲得等優(yōu)點而日益受到關(guān)注，但是由于非病毒載體的轉(zhuǎn)染效率普遍較低，限制了非病毒載體的廣泛應(yīng)用?？梢姡环N成功而高效的基因轉(zhuǎn)染方法的確立可以方便地應(yīng)用于一大類相關(guān)載體及細胞，為非病毒基因載體在臨床的廣泛應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，并可進一步推廣到組織工程與再生醫(yī)學(xué)、腫瘤基因治療、樹突狀細胞等更多研究領(lǐng)域，具有重要的應(yīng)用價值。研究發(fā)現(xiàn)，基因轉(zhuǎn)染效率的提高不僅依賴于載體技術(shù)的進步，而且與轉(zhuǎn)染方法密切相關(guān)。運用非病毒載體在體外對細胞進行基因轉(zhuǎn)染的常規(guī)轉(zhuǎn)染方法是先將細胞加入培養(yǎng)器皿，然后加入載體與基因的復(fù)合物進行轉(zhuǎn)染。細胞培養(yǎng)所需的血清通常會影響載體與基因的復(fù)合物的穩(wěn)定性，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率的下降，所以大多數(shù)轉(zhuǎn)染是在無血清的條件下進行的，待細胞對復(fù)合物的攝取結(jié)束后再加入血清進行培養(yǎng)。雖然無血清條件下的轉(zhuǎn)染可以保全非病毒載體的轉(zhuǎn)染效率，但是對細胞的正常生長造成了不利影響。為了解決上述基因轉(zhuǎn)染存在的問題，目前一方面嘗試制備穩(wěn)定性更佳的載體，另一方面嘗試改變載體加入轉(zhuǎn)染體系的方式來減輕血清的影響。實驗顯示反向轉(zhuǎn)染方法能改善血清存在對基因轉(zhuǎn)染效率的影響。此外，運用非病毒載體進行的基因轉(zhuǎn)染表達時間短，常規(guī)轉(zhuǎn)染方法對基因藥物的釋放可調(diào)控性差，為實現(xiàn)某些基因治療中所需的持續(xù)高效基因表達常需要反復(fù)給藥，而反向轉(zhuǎn)染方法可實現(xiàn)對基因復(fù)合物釋放的控制，滿足長期給藥或智能給藥的需要。但現(xiàn)有技術(shù)中還未見有關(guān)于反向非病毒載體基因轉(zhuǎn)染方法的報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了一種反向非病毒載體基因轉(zhuǎn)染的方法，采用高分子溶液與細胞培養(yǎng)器皿或生物材料表面進行修飾，再將非病毒載體與基因的復(fù)合物結(jié)合到細胞培養(yǎng)器皿或生物材料表面后對細胞進行轉(zhuǎn)染，大大提高了基因轉(zhuǎn)染的效率。—種反向非病毒載體基因轉(zhuǎn)染的方法，包括步驟(1)將高分子化合物水溶液與細胞培養(yǎng)器皿或?qū)⑸锊牧霞毎囵B(yǎng)支架接觸，經(jīng)孵育后除去液體，制得表面改性的細胞培養(yǎng)器皿或表面改性的生物材料；3(2)將非病毒載體與基因混合，制得非病毒載體與基因的復(fù)合物；(3)向表面改性的細胞培養(yǎng)器皿或表面改性的生物材料滴加非病毒載體與基因的復(fù)合物，經(jīng)孵育后再加入待轉(zhuǎn)染的細胞，進行基因的轉(zhuǎn)染。所述的高分子化合物可選用本領(lǐng)域常用的高分子化合物，主要包括合成高分子化合物如聚乙二醇(PEG)、多聚賴氨酸(PLL)、聚乙烯亞胺(PEI)等，以及天然高分子化合物及其衍生物如明膠、陰離子化的明膠、透明質(zhì)酸、殼聚糖、海藻酸鈉、白蛋白等。本發(fā)明可優(yōu)選聚乙二醇、多聚賴氨酸、聚乙烯亞胺、明膠、透明質(zhì)酸、殼聚糖、海藻酸鈉或白蛋白中的一種。進一步優(yōu)選，分子量為20020000的PEG、分子量為6萬30萬的PLL、分子量為80025000的PEI、分子量為l萬15萬的明膠、分子量為5萬100萬的透明質(zhì)酸或者分子量為50095萬的殼聚糖。所述的高分子化合物水溶液中高分子化合物的濃度優(yōu)選為50iig/ml10mg/ml。所述的高分子化合物水溶液中還可以添加促進基因轉(zhuǎn)染的物質(zhì)，所述的促進基因轉(zhuǎn)染的物質(zhì)選自纖維連接蛋白、含有RGD序列的多肽、魚精蛋白或組氨酸中的一種。所述的高分子化合物水溶液中促進基因轉(zhuǎn)染的物質(zhì)的濃度優(yōu)選為10iig/ml5mg/ml。所述的高分子化合物水溶液的zeta電位優(yōu)選為_50mv50mv。所述的細胞培養(yǎng)器皿和生物材料細胞培養(yǎng)支架均為本領(lǐng)域常用的細胞培養(yǎng)容器，其中，所述的細胞培養(yǎng)器皿可選自常見的細胞培養(yǎng)板、細胞培養(yǎng)瓶或細胞培養(yǎng)皿中的一種，細胞培養(yǎng)板、細胞培養(yǎng)瓶或細胞培養(yǎng)皿的材料一般為聚苯乙烯類材料。所述的生物材料細胞培養(yǎng)支架中采用的材料既可以為可降解生物材料也可以為不可降解生物材料，具體可選自聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、膠原、透明質(zhì)酸、殼聚糖或聚對苯二甲酸乙二醇酯屬聚酯(PET)中的一種。所述方法中高分子化合物水溶液可以以滴加或浸泡的方式與細胞培養(yǎng)器皿或生物材料細胞培養(yǎng)支架接觸，例如可以將高分子化合物水溶液涂布到細胞培養(yǎng)器皿表面或?qū)⑸锊牧霞毎囵B(yǎng)支架浸泡到高分子化合物水溶液中，使高分子化合物或者高分子化合物及添加的促進基因轉(zhuǎn)染的物質(zhì)充分結(jié)合到培養(yǎng)器皿或生物材料表面，對培養(yǎng)器皿或生物材料表面進行修飾，再將非病毒載體與基因的復(fù)合物結(jié)合到培養(yǎng)器皿或生物材料表面。所述的非病毒載體為本領(lǐng)域常用的細胞轉(zhuǎn)染用非病毒載體，可選自聚陽離子、脂質(zhì)體、囊泡、樹突狀大分子化合物，如殼聚糖、聚乙烯亞胺(PEI)、Lipofectamine2000、FuGENE⑧HD、NanoJuice、聚酰胺-胺(PAMAM)等非病毒載體中的一種。所述的非病毒載體與基因的復(fù)合物的平均粒徑為5nm5iim。在此粒徑范圍內(nèi)的非病毒載體與基因的復(fù)合物更有利于細胞對其的有效攝取。為了保證高分子化合物能更加充分地結(jié)合到培養(yǎng)器皿或生物材料表面，步驟(1)中，所述的孵育時間為lh24h。為了保證非病毒與基因復(fù)合物能更加充分地結(jié)合到經(jīng)表面改性的細胞培養(yǎng)器皿或生物材料上，步驟(3)中，所述的孵育時間為0.5h24h。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點本發(fā)明運用含有高分子化合物或者高分子化合物及蛋白多肽類促進基因轉(zhuǎn)染的物質(zhì)的溶液對細胞培養(yǎng)器皿或生物材料表面進行修，使非病毒載體與基因的復(fù)合物可以通過非共價鍵結(jié)合到培養(yǎng)器皿或生物材料表面，用于體外基因輸送，且可以直接運用于局部給藥，較直接注射基因復(fù)合物可以更好實現(xiàn)靶向性。本發(fā)明可以根據(jù)基因治療對基因釋放速率及數(shù)量的要求調(diào)整高分子化合物水溶液的成分，實現(xiàn)基因的智能輸送。本發(fā)明操作簡單，各物質(zhì)都是以溶液狀態(tài)加入體系中以非共價鍵進行結(jié)合，不涉及專業(yè)性要求高的對高分子材料表面的化學(xué)改性；另外，本發(fā)明所采用的高分子化合物及添加物容易獲得且成本低廉，具有可推廣性；本發(fā)明方法安全性與轉(zhuǎn)染效率均佳，能改善血清存在情況下血清對基因轉(zhuǎn)染效率的影響，具有很好的應(yīng)用前景。由于基因治療方案所需治療基因表達持續(xù)時間各異，基因復(fù)合物從生物材料表面的控制釋放性能就顯得尤為重要，顯然反向轉(zhuǎn)染方法在此方面較常規(guī)轉(zhuǎn)染方法具有更大的可控性與靈活性。通過改變?nèi)芤旱乃釅A度、溶液中各成分的比例、高分子化合物的類型、分子量與濃度，可以改變生物材料表面的電性與親水性，進而影響非病毒載體與基因的復(fù)合物與細胞培養(yǎng)器皿或生物材料表面的結(jié)合與釋放。通過添加可加強細胞與材料粘附作用或可促進基因轉(zhuǎn)染的蛋白質(zhì)或多肽，可以增加生物材料的生物相容性以及非病毒載體的轉(zhuǎn)染效率。圖1為常規(guī)轉(zhuǎn)染方法與本發(fā)明反向轉(zhuǎn)染方法在無血清情況下的轉(zhuǎn)染效果對比圖2為常規(guī)轉(zhuǎn)染方法與本發(fā)明反向轉(zhuǎn)染方法在無血清情況下的轉(zhuǎn)染效果對比圖3為常規(guī)轉(zhuǎn)染方法與反向轉(zhuǎn)染方法在血清體積百分濃度為10%的培養(yǎng)液中的轉(zhuǎn)染效果對比圖；圖4為常規(guī)轉(zhuǎn)染方法與反向轉(zhuǎn)染方法在血清體積百分濃度為10%的培養(yǎng)液中的轉(zhuǎn)染效果對比圖；圖5為PEI/DNA復(fù)合物以反向轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染HeLa細胞的存活率結(jié)果圖。具體實施方式實施例1(1)將PEG(Mw=3400)的濃度為2mg/ml、纖維連接蛋白的濃度為20yg/ml的高分子化合物水溶液涂布到24孔細胞培養(yǎng)板(美國corning公司生產(chǎn))，孵育4h后除去液體，用PBS緩沖液(即吐溫-20的質(zhì)量百分濃度為0.05%、pH7.4的磷酸鹽緩沖液)清洗兩次，制得表面改性的細胞培養(yǎng)板。(2)以殼聚糖作為非病毒載體，與含編碼蟲熒光素酶的基因的質(zhì)粒DNA(即pGL3質(zhì)粒DNA，浙江大學(xué)藥理所)混合制備殼聚糖與DNA的復(fù)合物。(3)將殼聚糖與DNA的復(fù)合物滴加到上述表面改性的細胞培養(yǎng)板上，孵育2h后加入人宮頸癌HeLa細胞進行轉(zhuǎn)染。實施例2(1)將透明質(zhì)酸支架浸泡在PLL(Mw=10萬)的濃度為60iig/ml、含RGD序列的多肽(GRGDSP，由上海生工生物工程公司合成)的濃度為lmg/ml的高分子化合物水溶液中，孵育lh后除去液體，用PBS緩沖液清洗兩次，制得表面改性的透明質(zhì)酸支架。5(2)以Lipofectamine2000(Invitrogen公司)作為非病毒載體，與pGL3質(zhì)粒DNA混合制備Lipofectamine2000與DNA的復(fù)合物。(3)將Lipofectamine2000與DNA的復(fù)合物滴加到上述表面改性的透明質(zhì)酸支架上，孵育0.5h后加入人肝癌H印G2細胞進行轉(zhuǎn)染。實施例3(1)將陰離子化明膠(Mw=5萬)的濃度為500iig/ml、魚精蛋白(Sigma公司)的濃度為200i！g/ml的高分子化合物水溶液涂布到細胞培養(yǎng)皿(杭州生友公司生產(chǎn))，孵育12h后除去液體，用PBS緩沖液清洗兩次，制得表面改性的細胞培養(yǎng)皿。(2)以Fugene⑧HD(羅氏公司生產(chǎn))作為非病毒載體，與pGL3質(zhì)粒DNA混合制備FugeneHD與DNA的復(fù)合物。(3)將Fugene⑧HD與DNA的復(fù)合物滴加到上述表面改性的細胞培養(yǎng)皿上，孵育5h后加入白血病K562細胞進行轉(zhuǎn)染。實施例4(1)將PLGA支架浸泡在透明質(zhì)酸(Mw=40萬)的濃度為lmg/ml的高分子化合物水溶液中，孵育24h后除去液體，用PBS緩沖液清洗兩次，制得表面改性的PLGA支架。(2)以聚酰胺PAMAM(Sigma公司)作為非病毒載體，與含編碼綠色熒光蛋白的基因的質(zhì)粒DNA(pEGFP-Nl質(zhì)粒DNA，浙江大學(xué)傳染病研究所)混合制備PAMAM與DNA的復(fù)合物。(3)將PAMAM與DNA的復(fù)合物滴加到上述表面改性的PLGA支架上，孵育18h后加入人乳腺HBL細胞進行轉(zhuǎn)染。實施例5(1)將PET支架浸泡在白蛋白(sigma公司生產(chǎn))的濃度為8mg/ml、組氨酸的濃度為500iig/ml的高分子化合物水溶液中，孵育6h后除去液體，用PBS緩沖液清洗兩次，制得表面改性的PET支架。(2)以NanoJuice(默克公司生產(chǎn))作為非病毒載體，與pEGFP-Nl質(zhì)粒DNA混合制備NanoJuice與DNA的復(fù)合物。(3)將NanoJuice與DNA的復(fù)合物滴加到上述表面改性的PET支架上，孵育6h后加入大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(bMSC)進行轉(zhuǎn)染。本發(fā)明采用如下實驗方法對實施例15進行性能測定1、高分子化合物水溶液zeta電位的測定配置lmg/ml明膠溶液作為對照例，用zeta電位測定儀測量zeta電位，結(jié)果見表1。由表1可見，可選用的高分子化合物可具有不同的帶電性質(zhì)，所帶電荷的多少會影響到體系吸附非病毒載體與基因復(fù)合物的量，以及復(fù)合物從體系中釋放的速率等。為了實現(xiàn)對復(fù)合物釋放量與釋放速率的控制，可根據(jù)實際需要選擇不同帶電性質(zhì)的高分子化合物或?qū)μ囟ǜ叻肿踊衔镞M行化學(xué)修飾。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2、非病毒載體與基因的復(fù)合物的粒徑與zeta電位的測定采用PEI作為非病毒載體，與pGL3質(zhì)粒DNA(浙江大學(xué)藥理所)混合制備載體與DNA的復(fù)合物作為對照例，用純水稀釋，利用激光粒度測定儀測定復(fù)合納米粒的粒徑分布，利用zeta電位測定儀測量zeta電位，結(jié)果見表2。表2顯示了本發(fā)明方法適用于具有不同粒徑與電位分布的非病毒載體與基因復(fù)合物，此體系不僅適用于帶正電的復(fù)合物，對于常規(guī)轉(zhuǎn)染方法下轉(zhuǎn)染效率較低的帶負電荷的復(fù)合物也可以取得更佳的轉(zhuǎn)染效果。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>3、體外轉(zhuǎn)染效率測定對照例采用PEI作為非病毒載體，pGL3作為質(zhì)粒DNA。將一定量載體溶解在一定體積的純水中，與一定濃度的質(zhì)粒DNA等體積混合，在室溫下孵育15分鐘以獲得載體與DNA的復(fù)合物，用純水進行稀釋。(1)常規(guī)轉(zhuǎn)染方法在對照例中以HeLa細胞作為模型細胞。將細胞以每孔5萬個細胞的數(shù)量種在24孔板中培養(yǎng)24h，除去培養(yǎng)液，以PBS緩沖液清洗兩遍，加入0.5ml不含小牛血清或小牛血清體積百分濃度為10X的DMEM培養(yǎng)液(GIBCO公司)，將對照例或者實施例中配好的復(fù)合物加入到細胞中，放入37t:的C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)。對于不含血清組，轉(zhuǎn)染6小時后吸去轉(zhuǎn)染液，每孔加0.5ml小牛血清體積百分濃度為10%的DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24小時；對于含血清組，轉(zhuǎn)染液與細胞持續(xù)作用24h。對于EGFP質(zhì)粒，24h后用熒光倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況，拍片記錄。對于pGL3質(zhì)粒，培養(yǎng)好后不含血清組和含血清組均吸去24孔板中培養(yǎng)液，PBS緩沖液清洗兩次，每孔加入200iU細胞裂解液，靜置5分鐘，小心吹打，吸取細胞于12000rpm、4t:離心兩分鐘。取上清液20y1，加入100iU蟲熒光素酶底物用化學(xué)發(fā)光儀測定熒光強度。配制濃度為0.5mg/ml的蛋白質(zhì)水溶液，蒸餾水稀釋至濃度25yg/ml，50yg/ml，100iig/ml，200iig/ml，300iig/ml，400iig/ml，500iig/ml，以每孑L20ii1力口入至lj96孑L板中，每孔再加入200ii1二喹林甲酸(BCA)工作液(碧云天公司)，595nm紫外測吸光度，繪標(biāo)準(zhǔn)曲線。將所得樣品上清液另取lOiU，稀釋到20iU，加入200iUBCA工作液測吸光光度值，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線得蛋白質(zhì)含量。采用相對光單位與蛋白質(zhì)量的比值作為轉(zhuǎn)染效率的評價指標(biāo)。(2)反向轉(zhuǎn)染方法配置海藻酸鈉濃度為200iig/ml、魚精蛋白的濃度為400yg/ml的溶液作為對照例中的高分子溶液。滴加80iU對照例或者實施例中的高分子溶液到24板中，37t:靜置lh，用PBS緩沖液清洗兩次。將對照例或者實施例中制備好的載體與DNA的復(fù)合物以每孔40ii1的體積滴加到24板中，37t:靜置30min。對于含血清組，細胞用胰酶消化后加入小牛血清體積百分濃度為10%、雙抗(100U/ml)的DMEM培養(yǎng)液，吹打成細胞懸液，以每孔5萬個細胞的數(shù)量加到上述24孔板中培養(yǎng)24h;對于不含血清組，用不含血清的培養(yǎng)液制備細胞懸液，以相同密度種到24孔板，6h后換成小牛血清體積分?jǐn)?shù)為10%的DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)18h。對于pGL3質(zhì)粒，按(1)中相同的方法進行蟲熒光素酶檢測與蛋白質(zhì)濃度測定。采用相對光單位與蛋白質(zhì)量的比值作為轉(zhuǎn)染效率的評價指標(biāo)。對于EGFP質(zhì)粒，24h后用熒光倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況，拍片記錄。常規(guī)轉(zhuǎn)染方法與本發(fā)明反向轉(zhuǎn)染方法在無血清情況下的轉(zhuǎn)染效果對比圖，見圖1和圖2;常規(guī)轉(zhuǎn)染方法與反向轉(zhuǎn)染方法在血清體積分?jǐn)?shù)為10%的培養(yǎng)液中的轉(zhuǎn)染效果對比圖，見圖3和圖4。圖1、圖2、圖3和圖4顯示，在無血清情況下，反向轉(zhuǎn)染方法與常規(guī)轉(zhuǎn)染方法的轉(zhuǎn)染效率無顯著性差異。但當(dāng)轉(zhuǎn)染時加入了體積分?jǐn)?shù)為10%的血清時，運用本發(fā)明的反向轉(zhuǎn)染方法可以取得顯著高于常規(guī)轉(zhuǎn)染方法的轉(zhuǎn)染效果。4、細胞存活率實驗反向轉(zhuǎn)染方法下細胞存活率測定96孔培養(yǎng)板每孔滴加20ii1對照例或者實施例中用于轉(zhuǎn)染的高分子化合物水溶液，37t:靜置lh，用PBS緩沖液清洗兩次。每孔滴加10iUPEI與DNA的復(fù)合物或者實施例中的復(fù)合物，空白對照組加10ii1純水，37t:靜置30min后除去液體。細胞用胰酶消化后加入小牛血清體積百分濃度為10%、雙抗(100U/ml)的DMEM培養(yǎng)液吹打成細胞懸液，以每孔1.5萬個細胞的數(shù)量接種到96孔板中培養(yǎng)24h。除去培養(yǎng)液，PBS緩沖液清洗兩次，每孔加入20ii1噻唑蘭(MTT)水溶液(濃度5mg/ml)和80yl培養(yǎng)液，4h后吸去培養(yǎng)液，每孔加入150iU二甲基亞砜(匿SO)，振搖10min，在酶標(biāo)儀上于570nm測定A值。按以下公式計算細胞生存率(即細胞存活率)。細胞生存率(％)=(樣品的A值/對照組的A值)X100%PEI與DNA的復(fù)合物以反向轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染HeLa細胞的存活率結(jié)果圖，見圖5。由圖5可看出，采用本發(fā)明的反向轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染HeLa細胞時，細胞存活率良好，表明此轉(zhuǎn)染方法不會對細胞的生長產(chǎn)生抑制。上述測試結(jié)果表明本發(fā)明的反向轉(zhuǎn)染方法能顯著改善血清存在對基因轉(zhuǎn)染效率的影響，非病毒載體運用反向轉(zhuǎn)染方法進行轉(zhuǎn)染安全性良好。8權(quán)利要求一種反向非病毒載體基因轉(zhuǎn)染的方法，其特征在于，包括步驟(1)將高分子化合物水溶液與細胞培養(yǎng)器皿或生物材料細胞培養(yǎng)支架接觸，經(jīng)孵育后除去液體，制得表面改性的細胞培養(yǎng)器皿或表面改性的生物材料細胞培養(yǎng)支架；(2)將非病毒載體與基因混合，制得非病毒載體與基因的復(fù)合物；(3)向表面改性的細胞培養(yǎng)器皿或表面改性的生物材料細胞培養(yǎng)支架滴加非病毒載體與基因的復(fù)合物，經(jīng)孵育后再加入待轉(zhuǎn)染的細胞，進行基因的轉(zhuǎn)染。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的高分子化合物選自聚乙二醇、多聚賴氨酸、聚乙烯亞胺、明膠、透明質(zhì)酸、殼聚糖、海藻酸鈉或白蛋白中的一種。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的高分子化合物水溶液中高分子化合物的濃度為50iig/ml10mg/ml。4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的高分子化合物水溶液中添加有促進基因轉(zhuǎn)染的物質(zhì)，所述的促進基因轉(zhuǎn)染的物質(zhì)選自纖維連接蛋白、含有RGD序列的多肽、魚精蛋白或組氨酸中的一種。5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的高分子化合物水溶液中促進基因轉(zhuǎn)染的物質(zhì)的濃度為lOiig/ml5mg/ml。6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的高分子化合物水溶液的zeta電位為-50mv50mv。7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的細胞培養(yǎng)器皿選自細胞培養(yǎng)板、細胞培養(yǎng)瓶或細胞培養(yǎng)皿中的一種；所述的生物材料細胞培養(yǎng)支架中的生物材料選自聚乳酸-乙醇酸共聚物、膠原、透明質(zhì)酸、殼聚糖或聚對苯二甲酸乙二醇酯屬聚酯中的一種。8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的非病毒載體選自聚陽離子、脂質(zhì)體、囊泡、樹突狀大分子化合物中的一種。9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的非病毒載體與基因的復(fù)合物的平均粒徑為5nm5iim。10.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，所述的孵育時間為lh24h;步驟(3)中，所述的孵育時間為0.5h24h。全文摘要本發(fā)明公開了一種反向非病毒載體基因轉(zhuǎn)染的方法，包括步驟(1)將高分子化合物水溶液與細胞培養(yǎng)器皿或?qū)⑸锊牧霞毎囵B(yǎng)支架接觸，經(jīng)孵育后除去液體，制得表面改性的細胞培養(yǎng)器皿或表面改性的生物材料；(2)將非病毒載體與基因混合，制得非病毒載體與基因的復(fù)合物；(3)向表面改性的細胞培養(yǎng)器皿或表面改性的生物材料滴加非病毒載體與基因的復(fù)合物，經(jīng)孵育后再加入待轉(zhuǎn)染的細胞，進行基因的轉(zhuǎn)染。該方法操作簡單，成本低廉，可以顯著提高血清存在情況下非病毒載體的基因轉(zhuǎn)染效率，且可以對基因復(fù)合物的釋放加以控制。文檔編號C12N15/87GK101787375SQ20101010889公開日2010年7月28日申請日期2010年2月10日優(yōu)先權(quán)日2010年2月10日發(fā)明者何彩霞,胡瑜蘭,高建青申請人:浙江大學(xué)