專利名稱：一種微乳液克隆擴增結(jié)合水凝膠微球芯片數(shù)字化檢測微突變的方法
技術(shù)領域：
本方法屬于醫(yī)學生物技術(shù)領域，涉及一種微乳液克隆擴增結(jié)合水凝膠微球芯片數(shù)
字化檢測微突變的方法。
背景技術(shù)：
近年來，微突變檢測在疾病的早期診斷中發(fā)揮著越來越重要的作用，成為疾病診
斷的一種重要的手段。在疾病早期階段，由于相關(guān)基因的突變體數(shù)目要遠遠少于正常的DNA
分子，使得對于微突變體的檢測變得很困難。在一些已有的檢測微突變的技術(shù)中，DNA測序
是一個比較經(jīng)典的方法，但是這種方法不能夠檢測突變數(shù)量少于20%的樣本。然而，通常
癌癥早期只有極小一部分DNA有突變，為了檢測這種極少的突變，現(xiàn)今已經(jīng)發(fā)展了許多方
法，目前用于微突變檢測的方法主要有基于酶切或PCR的方法和以構(gòu)象為基礎的檢測方
法等。例如，用核酸內(nèi)切酶V結(jié)合酶連的檢測方法就可以克服上述的問題，使檢測限度達到
1%。但是這種方法不能檢測到更低的突變，因為這種方法是基于模擬信號來定量的。 一種
被稱為數(shù)字化克隆擴增的技術(shù)(Digital-PCR技術(shù))，是一種極度精確的定量方法。該方法
是將模板分散到多孔平板上，使得每個微孔中最多只含有一個突變體分子或者一個野生型
模板分子，最后通過對擴增產(chǎn)物數(shù)字化計數(shù)來實現(xiàn)對微突變的精確定量。但是由于受限于
平板上微孔的數(shù)目，檢測的靈敏度也很難繼續(xù)提高。為了增加單分子PCR擴增的微孔數(shù)，最
近提出了一種新的技術(shù)，即乳液PCR技術(shù)，這種技術(shù)是將PCR擴增混合物包裹在油包水的微
乳液中，可形成數(shù)以百萬計的油包水的微囊結(jié)構(gòu)，每個微囊也最多只含有一個突變體分子
或者一個野生型模板分子，以及一個結(jié)合有PCR擴增引物的微球，通過微乳相PCR擴增，實
現(xiàn)單分子克隆檢測，即每個微球表面擴增的片段僅來源于一個模板分子。 但是，目前尚未有將微乳液克隆擴增與水凝膠微球芯片數(shù)字化檢測結(jié)合來提高檢
測微突變靈敏度的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種提高靈敏度的微乳液克隆擴增結(jié)合水凝膠微球芯片數(shù) 字化檢測微突變的方法。 微乳液克隆擴增技術(shù)是一種新型的基因檢測技術(shù)，具有高靈敏度和保真性，能夠 實現(xiàn)單分子擴增。我們在實現(xiàn)了這種技術(shù)的基礎上，自創(chuàng)了一種新的檢測平臺，即微球水凝 膠芯片技術(shù)數(shù)字化檢測平臺，發(fā)展了一種新型的微突變檢測方法。 在本發(fā)明中，首先以片斷化的DNA分子為模板，采用微乳液-微球擴增法同時進 行百萬個以上的PCR反應，每種PCR產(chǎn)物代表一個DNA分子(模板)，并且連接在一個微球 上。運用水凝膠法制備微球芯片，使芯片上均勻地平鋪一層高密度微球，并且水凝膠既能固 定住微球，又能讓互補DNA分子通過。通過將基因突變檢測芯片與分別用于檢測兩種等位 基因類型的兩種熒光標記的探針雜交后計數(shù)不同顏色的微球，以確定樣本基因突變數(shù)的變
4化，從而得出最后的診斷依據(jù)。 本發(fā)明的目的是通過下列技術(shù)方案實現(xiàn)的 —種檢測微突變的方法，該方法是采用微球介導的微乳液克隆擴增技術(shù)結(jié)合水凝 膠芯片固定微球熒光檢測及數(shù)字化分析技術(shù)進行微突變檢測的方法。 該方法中所述微球介導的微乳液克隆擴增技術(shù)是將片段化的DNA模板、表面固定 有擴增引物的微球以及PCR反應體系的混合物分散并包裹在油包水的微乳液微囊中同時 并列進行微乳液PCR擴增，微乳液PCR擴增后，破乳，收集微球，將微球上擴增出的雙鏈目的 片段制備成單鏈DNA擴增片段；
其中 每個微囊最多僅包含一個片段化的DNA模板分子、一個微球和PCR反應體系的混 合物； 每個微球表面只固定一種擴增引物，固定的擴增引物是與片段化的DNA模板對應 的一種基因特異性引物或者是與片段化的DNA模板對應的用于PCR擴增的一種公用引物； (由于直接采用特異性引物進行擴增，如果擴增的產(chǎn)物中存在多種突變類型，則熒光探針識 別的序列需對應相應的SNP，無法使用相同序列，成本較高；而采用公用引物擴增的產(chǎn)物中 不同的突變類型可以采用相同或不同的熒光探針識別序列，當采用相同序列時成本較低， 可計算總突變率，如需分別計算不同突變類型的突變率，也可采用不同識別序列。)
PCR反應體系中的擴增引物含有與微球表面固定的擴增引物成對的引物；最好的
選擇是除了含有較多的與微球表面固定的擴增引物成對的引物外，還含有少量微球表面固 定的擴增引物。比如，固定在微球表面的是正向引物，則PCR反應體系中含有少量正向引物 和大量反向引物，正向引物與反向引物數(shù)量比最優(yōu)為1 : 10 1 : 20，PCR反應體系中含 有少量正向引物易于啟動PCR反應。 片段化的DNA模板采用將樣本DNA分子打斷成小片段直接使用(針對特異性引 物)或在采用連接加尾的方法形成小片段(針對公用引物)。DNA片段化可以通過限制性 內(nèi)切酶消化基因組DNA，將基因組DNA隨機打斷成長度大約在2-5kb的片段；或者采用多重 連接依賴式探針擴增(Multiplex Ligation-d印endent Probe Amplification, MLPA)反 應，即以基因組DNA為模板，針對每個目的基因設計相應的連接探針，反應后可形成長度在 50-200bp長度的單鏈DNA模板，該連接產(chǎn)物可以作為擴增反應的模板。
PCR反應體系中除了含有用于PCR擴增的引物，還含有PCR擴增常用的試劑，如Taq DNA聚合酶、PCR緩沖液、dNTP、 Mg2+等，這些是本領域技術(shù)人員熟知的。
所述的檢測微突變的方法，其中連接加尾的片段化的DNA模板是以樣本DNA分子 為模板，進行多重連接依賴式探針擴增連接，連接后的產(chǎn)物即為片段化的DNA模板；每個突 變位點使用三條MLPA的探針，分別為一條左探針和兩條右探針；左探針包含兩部分一是 與微球結(jié)合的公用引物(如正向引物)相同的序列，二是一段與模板突變位點左側(cè)適當長 度的基因(不包括突變位點)互補的特異性序列；兩條右探針均包含三部分一端是與微 球結(jié)合的公用引物成對的引物(如反向引物)互補的序列，中間是與不同熒光探針雜交的 特異性序列，另一端是一段與模板突變位點及突變位點右側(cè)適當長度的基因互補的特異性 序列；兩條右探針分別對應了微突變的一個等位特異性位點以及分別對應包含了一段特異 性序列用于與一種熒光探針互補雜交(熒光探針識別的特異性序列針對不同SNP位點的突變型可以采用不同序列，也可采用相同序列以節(jié)約成本)；這樣，連接加尾得到的片斷化的
DNA模板一種是加上一條左探針和一條右探針，對應微突變的一個等位特異性位點的一種
情況，如野生型；另一種是加上一條左探針和另一條右探針，對應微突變的一個等位特異性
位點的另一種情況，如突變型；或者一種代表突變型A，另一種代表突變型B。 所述的檢測微突變的方法，其中表面固定有擴增引物的微球是將3'端NH2修飾的
一種擴增引物固定在NHS-瓊脂糖微球表面而得到。微球直徑可以選擇為34 ym。 所述的檢測微突變的方法，其中每個微囊最多僅包含一個片段化的DNA模板分
子、一個微球和PCR反應體系的混合物是通過下列方法實現(xiàn)的 將225 ii 1 Mock溶液與375 y 1油相于5ml的容器中混合并用磁力攪拌子在磁力 攪拌器上以轉(zhuǎn)速1000rpm攪拌5min，可見溶液呈微乳狀，再加入200ii1 PCR混合物，繼續(xù)在 磁力攪拌器上以轉(zhuǎn)速lOOOrpm攪拌5min形成均勻的油包水的微乳液；
其中，Mock溶液的組成為1XPCR緩沖液，2mM MgCl2，0. 1 % BSA ;油相的組成為 40% (w/w)DC 5225C Formulation Aid(配方助劑)(Dow Chemical Co.，美國)，30% (w/ w)DC 749流體(Dow Chemical Co.，美國)和30% (w/w)Ar20硅油(Sigma，美國);PCR混 合物包含片段化的DNA模板，1 XPCR緩沖液，2mM MgCl2， 0. 5mM dNTP混合物，0. 1U/ ii 1 Taq DNA聚合酶，O. 06iiM的正向引物，O. 6iiM的反向引物，O. 1% BSA，O. 01% Tween-80以及表 面固定有正向引物的微球，微球的數(shù)量與DNA模板拷貝數(shù)的比例在10 : l到l : l之間， DNA模板的最大量為107數(shù)量級。(如果微球表面固定的是反向引物，則PCR混合物中的引 物為0. 06 ii M的反向引物和0. 6 ii M的正向引物)。 所述的檢測微突變的方法，其中油包水的微乳液在PCR過程中需保持微乳液的狀 態(tài)不變，不會因為溫度的變化而引起破乳；所用到的油相為40% (w/w)DC 5225C配方助劑， 30% (w/w)DC 749流體和30% (w/w) Ar20硅油，所用到的油水相體積比在3 : 5到5 : 5 之間。 所述的檢測微突變的方法，其中破乳的方法是指將擴增后的微乳液與異丙醇混合 后，注入裝有微孔濾膜(孔徑小于微球直徑)的濾器，在濾膜上截留微球，將微乳液過濾除 去；將微球上擴增出的雙鏈目的片段制備成單鏈DNA擴增片段是將微球上擴增出的雙鏈產(chǎn) 物堿變性解鏈后吸去含游離的另一條單鏈DNA的堿液，收集固定有單鏈DNA擴增片段的微 球。 所述的檢測微突變的方法，其中水凝膠芯片固定微球熒光檢測及數(shù)字化分析技術(shù)
是用水凝膠法將固定了單鏈DNA擴增片段的微球制備成單層微球芯片，然后加入分別用于
檢測兩種等位基因類型的兩種熒光標記的探針進行雜交，除去未雜交上的探針，然后熒光
掃描，根據(jù)每個微球發(fā)出的顏色進行計數(shù)檢測、數(shù)字化分析，計算突變率。 所述的檢測微突變的方法，其中水凝膠芯片固定微球技術(shù)是以聚丙烯酰胺凝膠作
為載體將收集的微球固定于芯片上；即在自由基引發(fā)劑過硫酸銨及加速劑四甲基乙二胺
的作用下，包埋有固定了單鏈DNA擴增片段的微球的水凝膠通過聚合反應形成聚丙烯酰胺
凝膠，牢固地固定在丙烯基團修飾的玻璃芯片表面；所使用的水凝膠各成分的比例為3%
(w/V)丙烯酰胺單體(丙烯酰胺雙叉丙烯酰胺=29 : 1， W/w)、30% (w/w)丙三醇、1%
(w/v， g/ml)過硫酸銨、0.4% (v/v)四甲基乙二胺，最終加(1朋20至100% ; 制備單層微球芯片是在水凝膠混合物未發(fā)生聚合反應仍呈現(xiàn)液態(tài)時，蓋上蓋玻片，通過蓋玻片的壓力使含有微球的水凝膠均勻地平鋪在玻璃芯片表面，形成單層微球芯 片。根據(jù)前述選用的微球直徑為34ym，水凝膠在芯片上形成的厚度約在在35-40 ym之間 以形成單層的微球芯片。 所述的檢測微突變的方法，其中熒光檢測及數(shù)字化分析技術(shù)是指以兩條不同熒光 標記的探針分別代表了野生型和突變型，將兩條不同熒光標記的探針與微球上單鏈DNA擴 增片段進行雜交，兩種不同熒光標記的探針分別與野生型模板擴增產(chǎn)物以及突變型模板擴 增產(chǎn)物雜交，熒光掃描，雜交有不同熒光標記的探針的微球顯示不同顏色，兩種顏色的微球 分別代表了野生型和突變型，通過計數(shù)芯片上不同顏色的微球的數(shù)目，進行數(shù)字化分析，計 算得到總突變率。 本發(fā)明中正向引物、反向引物、特異性引物、公用引物等引物的具體序列與本發(fā)明 技術(shù)方案無必然聯(lián)系，可根據(jù)樣本的基因進行設計，屬于本領域技術(shù)人員公知技術(shù)，同樣， PCR反應體系也屬于本領域技術(shù)人員公知技術(shù)。
本發(fā)明的有益效果 本發(fā)明在單分子微乳液克隆擴增技術(shù)的基礎上，結(jié)合水凝膠芯片固定微球技術(shù)將
擴增的微球制成單層微球芯片，通過芯片掃描結(jié)果，數(shù)字化計測突變數(shù)目，從而實現(xiàn)微突變
檢測。本發(fā)明提供的檢測微突變的方法，實現(xiàn)在同一芯片上同時檢測多個基因的多個突變
體。本方法實現(xiàn)了定量測定多種低豐度腫瘤相關(guān)基因的突變體，解決了在大量正常非突變
基因的背景下，分析篩選臨床樣本中微量基因突變體時存在的靈敏度低，特異性差等問題，
提高了微突變的陽性檢出率；解決了單個基因突變體檢測通量低的問題。 本方法采用微球介導進行微乳液PCR，與傳統(tǒng)的微乳液PCR不同，不但能實現(xiàn)傳統(tǒng)
的微乳液PCR降低引物二聚體以及對不同模板的非歧視性擴增，更進一步的實現(xiàn)了單個模
板分子對應單個微球的擴增，進而實現(xiàn)了單分子檢測。微球可以作為PCR產(chǎn)物的富集載體，
簡化了PCR產(chǎn)物的純化的步驟，并且不需要再在基因芯片上點樣，便于熒光檢測時數(shù)字化
處理。由于PCR產(chǎn)物連接在微球上，而微球有一定的大小和重量，因此可以有效的控制PCR
產(chǎn)物在空氣中形成氣溶膠的污染現(xiàn)象。而且，成千上萬的微球載體連接著擴增產(chǎn)物也極大
的豐富了分析目的片段手段和方法，如流式細胞儀分析，微孔陣列測序分析等。 目前，國外用于分析微球上結(jié)合產(chǎn)物的方法主要是通過流式細胞儀進行計數(shù)分
析，但是這種分析方法所用到的流式細胞儀十分昂貴，并且配套用于分析的試劑價格也很
高，因此使得該分析方法很難大范圍推廣應用，國外還有用微孔陣列來分析每一個微球序
列的方法，但是該方法的通量受使用的微孔數(shù)量的限制，而且分析成本也很高。與上述兩種
分析方法相比，本方法所使用的水凝膠芯片數(shù)字化分析的方法不需要昂貴的儀器和復雜的
操作，極大的降低了檢測成本。 此外，本方法還具有數(shù)字化分析的特點。傳統(tǒng)的微乳液PCR收集的液相產(chǎn)物混合 為一體，根據(jù)檢測的模擬信號對結(jié)果進行判讀，靈敏度受到儀器的信噪比存在上限的限制， 而本方法中的數(shù)字化分析，在于將每個模板分子的特性通過微球介導的微乳液PCR反應在 一個微球上，對微球進行數(shù)字化計數(shù)，根據(jù)數(shù)字化信號給出結(jié)果，通過簡單的增加芯片的掃 描面積即可以實現(xiàn)高靈敏度的檢測。 同時，本方法也具有很高的特異性，因為水凝膠具有多孔結(jié)構(gòu)，用于牢固地包埋微 球固定的同時，也能將包埋于多孔結(jié)構(gòu)中游離未雜交上的探針，錯配的探針以及其他雜質(zhì)利用電泳的方法有效的清除。通過電泳，本方法可以有效去除一個堿基錯配的探針。這是 本方法高特異性的保證。


圖1是本發(fā)明方法流程示意圖。
圖2是MLPA連接探針的設計。
圖3是微乳液擴增示意圖。 圖4是經(jīng)微乳液擴增后的微球連接PCR擴增產(chǎn)物示意圖。
圖5是采用水凝膠微球芯片進行數(shù)字化檢測示意圖。 圖6顯示結(jié)合有三種基因型模板(兩種純合子和一種雜合子)微球的雜交電泳后 的檢測結(jié)果。雜交后，在室溫下將芯片進行電泳處理，能除去游離以及錯配結(jié)合的探針。(A) 兩種純合子(野生型和突變型)擴增產(chǎn)物結(jié)合的微球1 : 1混合后掃描的結(jié)果；(B)雜合 子擴增產(chǎn)物結(jié)合的微球的掃描結(jié)果。 圖7顯示水凝膠微球芯片結(jié)合數(shù)字化克隆擴增檢測技術(shù)用于檢測人工制備的不
同微突變比例的樣本的鑒定。單分子克隆擴增模板的突變率分別為i : i(a)，i : io(b)， i : ioo(c)和i : 1000(D)，制備單層微球芯片后掃描。紅球代表野生型，綠球代表突變型。 圖8顯示水凝膠微球芯片結(jié)合數(shù)字化克隆擴增檢測技術(shù)用于檢測大腸癌相關(guān) 突變位點突變率的鑒定。以大腸癌病人的組織中提取的DNA為樣本，測定了 APC基因 (NG_008481. 1)上的codon 1406突變位點。(A)Cy3+Cy5， (B)Cy3， (C)Cy5。紅球代表野生 型，綠球代表突變型。
具體實施例方式以下通過實施例對本發(fā)明作進一步的闡述。 以下實施例中未詳細描述的基因工程操作步驟均為本領域公知的技術(shù)。
實施例1 結(jié)合圖1 4，具體描述如下
1、片段化的DNA模板制備 首先提取樣本的基因組DNA，按酚/氯仿法提取，再用TE緩沖液溶解，用紫外分光 光度法測定其濃度及純度，以TE緩沖液調(diào)整合適的終濃度。以提取的DNA分子為模板，加入 MLPA的探針進行連接(針對每個目的基因設計相應的連接探針)，每個突變位點使用三條 探針，分別為一條左探針和兩條位點特異性的右探針。如圖2所示，左探針包含兩部分一 是與微球結(jié)合的公用引物(如正向引物)相同的序列，二是與模板突變位點左側(cè)適當長度 的基因(不包括突變位點)互補的特異性序列；兩條右探針均包含三部分一端是與微球 結(jié)合的公用引物成對的引物(如反向引物)互補的序列，中間是與不同熒光探針雜交的特 異性序列，另一端是一段與模板突變位點及突變位點右側(cè)適當長度的基因互補的特異性序 列；兩條右探針分別對應了微突變的一個等位特異性位點(如分別對應野生型和突變型) 以及分別對應包含了一段特異性序列用于與一種熒光探針(如分別對應發(fā)紅、綠熒光)互 補雜交(熒光探針識別的特異性序列針對不同SNP位點的突變型可以采用不同序列，也可 采用相同序列以節(jié)約成本)。得到的連接產(chǎn)物為連接加尾的片段化的DNA模板，一種是加上
8一條左探針和一條右探針，對應微突變的一個等位特異性位點的一種情況，如野生型；另一 種是加上一條左探針和另一條右探針，對應微突變的一個等位特異性位點的另一種情況， 如突變型，該片段化的DNA模板作為微乳液PCR擴增的模板。或者一種代表突變型A，另一 種代表突變型B。 樣本DNA分子打斷成小片段直接使用可以通過限制性內(nèi)切酶消化基因組DNA，將 基因組DNA隨機打斷成長度大約在2-5kb的片段，方法比較簡單，本領域技術(shù)人員均熟知， 此處不再贅述。 2、微球的活化和制備 本方法選用直徑為34y m，表面修飾NHS的瓊脂糖微球作為引物結(jié)合載體。瓊脂糖 微球在lmM HC1的體系中靜置一小時，使其表面修飾的基團NHS活化。然后再將瓊脂糖微 球轉(zhuǎn)移至PH = 7. 45的結(jié)合緩沖液體系中與NH2修飾的一種擴增引物(正向引物或者反應 引物)相結(jié)合，最終，得到表面結(jié)合有NH2修飾的引物的大量瓊脂糖微球，以用于微乳液PCR 擴增。 每個微球表面只固定一種擴增引物，固定的擴增引物是與片段化的DNA模板對應 的一種基因特異性引物或者是與片段化的DNA模板對應的用于PCR擴增的一種公用引物；
3、微球介導的單分子克隆擴增技術(shù)-微乳液PCR 將以上制備的片段化的DNA模板、表面固定有擴增引物的微球以及PCR反應體系 的混合物分散并包裹在油包水的微乳液微囊中同時并列進行微乳液PCR擴增(油包水的微 乳液在PCR過程中需保持微乳液的狀態(tài)不變，不會因為溫度的變化而引起破乳，采用下述 組成的油水相且油水相體積比在3 : 5到5 : 5之間時比較穩(wěn)定)，每個微囊最多僅包含一 個片段化的DNA模板分子、一個表面固定有擴增引物的微球和PCR反應體系的混合物，達到 單分子擴增(圖3)。微乳液PCR擴增可以在油包水的微囊中同時進行100萬個以上的擴增 反應。 PCR反應體系中的擴增引物含有與微球表面固定的擴增引物成對的引物；最好的 選擇是除了含有較多的與微球表面固定的擴增引物成對的引物外，還含有少量微球表面固 定的擴增引物。比如，固定在微球表面的是正向引物，則PCR反應體系中含有少量正向引物
和大量反向引物，正向引物與反向引物數(shù)量比最優(yōu)為i : io i : 20，PCR反應體系中含
有少量正向引物易于啟動PCR反應。 其中，每個微囊最多僅包含一個片段化的DNA模板分子、一個表面固定有擴增引 物的微球和PCR反應體系的混合物是通過下列方法實現(xiàn)的 將225 ii 1 Mock溶液與375 y 1油相于5ml的容器中混合并用磁力攪拌子在磁力 攪拌器上以轉(zhuǎn)速1000rpm攪拌5min，可見溶液呈微乳狀，再加入200ii1 PCR混合物，繼續(xù)在 磁力攪拌器上以轉(zhuǎn)速1000rpm攪拌5min形成均勻的油包水的微乳液；
其中，Mock溶液的組成為1XPCR緩沖液，2mM MgCl2，0. 1% BSA ;油相的組成按為 40% (w/w)DC 5225C配方助劑(Dow Chemical Co.，美國)，30% (w/w)DC 749流體和30% (w/w) Ar20硅油；PCR混合物包含片段化的DNA模板，1 XPCR緩沖液，2mMMgCl2， 0. 5mM dNTP 混合物，O. lU/iU Taq DNA聚合酶，O. 06 ii M的正向引物，O. 6 ii M的反向引物，O. 1% BSA， 0. 01% Tween-80以及表面固定有正向引物的微球，微球的數(shù)量與DNA模板拷貝數(shù)的比例在 10 : 1到1 : 1之間，DNA模板的最大量為107數(shù)量級(詳見實施例2控制條件)。
對擴增后的微乳液進行破乳，破乳的方法是指將擴增后的微乳液與異丙醇混合 后，注入裝有孔徑為25 m的微孔濾膜(孔徑小于微球直徑)的濾器(濾器可采用可卸式 針頭濾器)，在濾膜上截留微球，將微乳液過濾除去，回收擴增后的微球。微球上擴增出的雙 鏈產(chǎn)物在0. 1M的NaOH條件下被解鏈5分鐘，充分變性后吸去含游離的一條單鏈DNA的堿 液，收集結(jié)合有單鏈DNA擴增片段的微球(圖4)，反復洗滌收集微球備用。
回收的微球中絕大多數(shù)表面都有擴增的DNA分子，也會有一些微球表面沒有擴增 的分子，但這些微球在檢測時沒有信號，對最終的結(jié)果沒有影響。
4、水凝膠法制備單層微球芯片 本方法采用水凝膠包埋微球，制備單層微球芯片。由于水凝膠具有多孔結(jié)構(gòu)的特 性，因此在包埋微球的同時也能使包埋于多孔結(jié)構(gòu)中游離未雜交上的探針、錯配的探針以 及其他雜質(zhì)通過用電泳的方法有效的清除。 所使用的水凝膠各成分的比例為3% (w/w)丙烯酰胺單體(丙烯酰胺雙叉丙烯 酰胺=29 : l，w/w)、30% (w/w)丙三醇、1% (w/v，g/ml)過硫酸銨、0. 4% (v/v)四甲基乙 二胺，最終加(1(11120至100%。 在包埋微球的水凝膠混合物未發(fā)生聚合反應仍呈現(xiàn)液態(tài)時，蓋上蓋玻片，通過蓋 玻片的壓力使含有微球的水凝膠均勻地平鋪在玻璃芯片表面，形成單層微球芯片。水凝膠 在自由基引發(fā)劑過硫酸銨及加速劑四甲基乙二胺的作用下，包埋有固定了單鏈DNA擴增片 段的微球的水凝膠通過聚合反應形成聚丙烯酰胺凝膠(具有三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu))，牢固地 固定在丙烯基團修飾的玻璃芯片表面。 采用水凝膠法將上述克隆PCR的單鏈產(chǎn)物，即表面包有單鏈DNA分子的微球制備 成單層微球芯片后，再加入分別與野生型和突變型擴增產(chǎn)物特異性互補結(jié)合的兩條不同的 熒光探針(對應于片段化的DNA模板構(gòu)建時的右探針中與不同熒光探針雜交的特異性序 列)進行雜交(雜交反應在潮濕的雜交盒中4(TC反應1小時)，電泳除去未雜交上的探針 和錯配的探針及其他雜質(zhì)，然后熒光掃描成像。雜交有不同熒光標記的探針的微球顯示不 同顏色，兩種顏色的微球分別代表了野生型和突變型。電泳除去探針的效果見圖6，圖6B為 電泳前的掃描結(jié)果，圖6A為電泳后的掃描結(jié)果。整個方法的測定原理如圖5所示，根據(jù)每 個微球發(fā)出的顏色進行計數(shù)檢測，數(shù)字化分析，計算突變率
5、多個基因突變體上多個突變位點的同時檢測。 本方法可以檢測多個基因的突變情況，并且可以同時檢測每個基因上的多個突變 位點。對于一些疾病的診斷，由于不需要檢測具體的基因突變種類和具體的突變位點，可以 一種顏色的熒光標記同時檢測多個突變位點，得到不同突變位點的突變體數(shù)目的總和，即 先克隆擴增所有需檢測的基因，然后加入用紅色熒光染料標記的野生型DNA特異性探針和 用綠色熒光染料標記的所有可能的基因突變體特異性探針(如果要區(qū)分各種可能的突變， 則需要將代表不同突變的特異性探針采用不同顏色的熒光染料標記)，雜交后進行檢測，分 別對不同顏色的微球計數(shù)。比如檢測到某樣本中含有io萬個野生型基因分子，并檢測到 100個有突變的基因分子，則該樣本中突變DNA分子的頻率為千分之一，同理，如果對這100 個突變的基因分子采用代表不同突變的特異性探針顯示不同顏色的熒光染料標記，每種顏 色代表一種等位基因類型，則可得到各個不同突變類型的突變頻率。 本方法分別對不同比例的野生型和突變型混合模板進行檢測，野生型和突變型混合的比例(突變型數(shù)量與突變型與野生型數(shù)量總和的比)分別為50%，9%，1%，0. 1%。最
終的檢測結(jié)果分別見圖7A(50% )，圖7B(9% )圖7C(1% )，圖7D(0. 1% )。 本方法同樣對實際樣本進行檢測，針對大腸癌組織樣本中APC基因上1406位的密
碼子突變進行，檢測結(jié)果見圖8，通過計數(shù)紅綠球得到的突變率為0. 75%。 5、軟件系統(tǒng)。 本方法可采用診斷評價軟件法綜合分析多個基因的突變，提出最終的報告，同時 可采用軟件系統(tǒng)控制芯片自動計數(shù)儀。 實施例2 :微乳液PCR實現(xiàn)單分子擴增的條件控制
1、控制每個微囊中最多包含有一個分子。 實現(xiàn)單分子擴增是基于稀釋的原理，S卩，通過對模板分子的稀釋最終達到一定體 積的溶液中最多包含有一個分子模板。在制備微乳液體系過程中，微囊體積的大小主要受 到以下條件的影響油相和水相的配比，水相中各種離子的濃度的配比以及在形成微乳液 時的攪拌子的大小(實驗室中通常采用市售攪拌子，一般長度不超過13mm)和攪拌速度。發(fā) 明人通過實驗確定了以下的微乳液制備過程 微乳液PCR擴增體系包含油相和水相兩部分，其中水相又分為Mock溶液和PCR 混合物。Mock溶液用于提前與油相混合，提高微乳液的穩(wěn)定性。先將225 iil Mock溶液 (1XPCR緩沖液，2mM MgCl2，0. 1% BSA)與375 ii 1油相(40% (w/w)DC 5225CFormulation Aid，30% (w/w)DC 749流體和30% (w/w)Ar20硅油)于5ml的平底燒杯中混合并用磁力 攪拌子在磁力攪拌器上以轉(zhuǎn)速1000rpm攪拌5min，可見溶液呈微乳狀。再加入200 yl PCR 混合物，包含片斷化的DNA模板，1 XPCR緩沖液，2mM MgCl2， 0. 5mM dNTP混合物，0. 1U/ y 1 Taq DNA聚合酶，O. 06 ii M的正向引物，O. 6 ii M的反向引物，O. 1% BSA，O. 01% Tween-80以 及引物交聯(lián)的34 ii m直徑的微球。將整個混合物在繼續(xù)在磁力攪拌器上以轉(zhuǎn)速1000rpm攪 拌5min成均勻的微乳液，分裝后，進行擴增。整個操作過程在4t:進行。
單分子擴增的證明是通過對每個微球上擴增片段的同一性進行考察。如果不是單 分子擴增，則微球上的擴增片段不具有同一性。我們通過熒光探針雜交的結(jié)合芯片掃描儀 掃描的方法進行檢測。若單分子擴增實現(xiàn)，微球只會在一種顏色通道中顯色。否則，單分子 擴增失敗。 為了實現(xiàn)單分子擴增，即每個微囊中最多包含有一個分子，我們通過梯度稀釋模 板來考察模板加入量范圍。理論上只要加入模板的數(shù)量一定程度的少于形成微囊的數(shù)量就 可以實現(xiàn)每個為囊中最多包含一個分子。最終我們得到結(jié)論，在上述實驗條件下模板的最 大加入量大約為107數(shù)量級。 按照所述的微乳液制備過程和模板分子以及微球的加入量進行操作，單分子擴增 得以實現(xiàn)。當然，每次操作過程中的微小差異也可能會使形成的微囊的數(shù)量有所不同。我 們通過重復性實驗證明，這種操作上的差異不會引起微囊數(shù)目的數(shù)量級的顯著變化，因此， 只要模板的最大量控制在107數(shù)量級，單分子擴增可以得以實現(xiàn)。
2、控制每個微囊中最多包含一個微球。 按照以本方法的微乳液制備過程和模板分子以及微球的加入量進行操作，單分子 擴增是可以實現(xiàn)。加入微球數(shù)量在107 108數(shù)量級之間，遠少于形成微囊的數(shù)量，可實現(xiàn) 每個微囊中最多包含一個微球，且經(jīng)過實驗證明，每次操作中的差異也不會帶來微囊數(shù)目
11的數(shù)量級的顯著變化，說明在一定的油水相配比，和乳化條件下， 一個微囊中包含兩個或者
更多的微球的機率很小。 3、形成穩(wěn)定的油包水結(jié)構(gòu)。 由于PCR擴增需要進行多次高低溫循環(huán)，因此微乳液在整個熱循環(huán)過程中的穩(wěn)定 性十分重要。我們參考文獻中的數(shù)據(jù)，并通過試驗確定了油相和水相的體積比為375 iU : 425 iil。油相包含40% (w/w)DC 5225C Formulation Acid，30% (w/w)DC 749Fluid以及 30% (w/w)Ar20 Silicone 0il(硅油)；水相包含片斷化的DNA模板，1 XPCR緩沖液，2mM MgCl2，0. 5mM dNTP混合物，O. 1U/ii 1 Taq DNA聚合酶，0. 06 ii M的正向引物，0. 6 ii M的反向 引物，O. 1%BSA，0.01% Tween-80以及與正向引物交聯(lián)的34 y m直徑的微球。為了提高微 乳液的穩(wěn)定性，我們將整個乳化過程分成了兩個步驟。首先是預乳化，將225iU Mock溶 液(1XPCR緩沖液，2mM MgCl2，0. 1% BSA)與375 yl油相于5ml的平底燒杯中混合并用B 型轉(zhuǎn)子(5mmX13mm)在磁力攪拌器上以轉(zhuǎn)速1000rpm攪拌5min，可見溶液呈微乳狀。再將 200 ii 1 PCR混合物(包含片斷化的DNA模板，1 XPCR緩沖液，2mM MgCl2， 0. 5mM dNTP混合 物，O. 1U/ii 1 Taq DNA聚合酶，O. 06 ii M的正向引物，O. 6 ii M的反向引物，O. 1%BSA，0.01% Tween-80以及與正向引物交聯(lián)的34 y m直徑的微球)加入繼續(xù)以轉(zhuǎn)速1000rpm攪拌5min 最終形成均勻的油包水微乳液。 我們通過實驗證明，以上方法制備的微乳液，在經(jīng)過4小時的PCR循環(huán)后未出現(xiàn)破 乳現(xiàn)象，PCR擴增程序如下40個循環(huán)(94°C，30s ;58°C，60s ;68°C，90s)的擴增，然后進行 13個循環(huán)(94°C，30s ;58°C，360s)的雜交延伸，充分說明該方法制備的微乳液油包水體系 穩(wěn)定性很好。
權(quán)利要求
一種檢測微突變的方法，其特征在于該方法是采用微球介導的微乳液克隆擴增技術(shù)結(jié)合水凝膠芯片固定微球熒光檢測及數(shù)字化分析技術(shù)進行微突變檢測的方法。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測微突變的方法，其特征在于微球介導的微乳液克隆擴增 技術(shù)是將片段化的DNA模板、表面固定有擴增引物的微球以及PCR反應體系的混合物分散 并包裹在油包水的微乳液微囊中同時并列進行微乳液PCR擴增，微乳液PCR擴增后，破乳， 收集微球，將微球上擴增出的雙鏈目的片段制備成單鏈DNA擴增片段；其中每個微囊最多僅包含一個片段化的DNA模板分子、一個微球和PCR反應體系的混合物；每個微球表面只固定一種擴增引物，固定的擴增引物是與片段化的DNA模板對應的一 種基因特異性引物或者是與片段化的DNA模板對應的用于PCR擴增的一種公用引物； PCR反應體系中的擴增引物含有與微球表面固定的擴增引物成對的引物； 片段化的DNA模板是指將DNA模板打斷成小片段直接使用或者連接加尾。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測微突變的方法，其特征在于連接加尾的片段化的DNA模 板是以樣本DNA分子為模板，進行多重連接依賴式探針擴增連接，連接后的產(chǎn)物即為片段 化的DNA模板；每個突變位點使用三條MLPA的探針，分別為一條左探針和兩條右探針；左 探針包含兩部分一是與微球結(jié)合的公用引物相同的序列，二是一段與模板突變位點左側(cè) 適當長度的基因互補的特異性序列；兩條右探針均包含三部分一端是與微球結(jié)合的公用 引物成對的引物互補的序列，中間是與不同熒光探針雜交的特異性序列，另一端是一段與 模板突變位點及突變位點右側(cè)適當長度的基因互補的特異性序列；兩條右探針分別對應了 微突變的一個等位特異性位點以及分別對應包含了一段特異性序列用于與一種熒光探針 互補雜交。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測微突變的方法，其特征在于表面固定有擴增引物的微球 是將3'端NH2修飾的一種擴增引物固定在NHS-瓊脂糖微球表面而得到。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測微突變的方法，其特征在于每個微囊最多僅包含一個片 段化的DNA模板分子、一個微球和PCR反應體系的混合物是通過下列方法實現(xiàn)的將225 1 Mock溶液與375 y 1油相于5ml的容器中混合并用磁力攪拌子在磁力攪拌 器上以轉(zhuǎn)速1000rpm攪拌5min，可見溶液呈微乳狀，再加入200ii1 PCR混合物，繼續(xù)在磁力 攪拌器上以轉(zhuǎn)速lOOOrpm攪拌5min形成均勻的油包水的微乳液；其中，Mock溶液的組成為1XPCR緩沖液，2mM MgCl2，0. 1% BSA ;油相的組成按為40% (w/w)DC 5225C配方助劑，30X (w/w)DC 749流體和30% (w/w)Ar20硅油；PCR混合物包含 片段化的DNA模板，1XPCR緩沖液，2mM MgCl2，0. 5mM dNTP混合物，O. 1U/ii 1 Taq DNA聚合 酶，O. 06iiM的正向引物，O. 6iiM的反向引物，O. 1% BSA，O. 01% Tween-80以及表面固定有 正向引物的微球，微球的數(shù)量與DNA模板拷貝數(shù)的比例在10 : l到l : l之間，DNA模板 的最大量為107數(shù)量級。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測微突變的方法，其特征在于油包水的微乳液在PCR過程 中需保持微乳液的狀態(tài)不變，不會因為溫度的變化而引起破乳；所用到的油相為40% (w/ w)DC 5225C配方助劑，30X (w/w)DC 749流體和30% (w/w)Ar20硅油，所用到的油水相體 積比在3:5到5:5之間。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測微突變的方法，其特征在于破乳的方法是指將擴增后 的微乳液與異丙醇混合后，注入裝有微孔濾膜的濾器，在濾膜上截留微球，將微乳液過濾除 去；將微球上擴增出的雙鏈目的片段制備成單鏈DNA擴增片段是將微球上擴增出的雙鏈產(chǎn) 物堿變性解鏈后吸去含游離的另一條單鏈DNA的堿液，收集固定有單鏈DNA擴增片段的微 球。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測微突變的方法，其特征在于水凝膠芯片固定微球熒光檢 測及數(shù)字化分析技術(shù)是用水凝膠法將固定了單鏈DNA擴增片段的微球制備成單層微球芯 片，然后加入分別用于檢測兩種等位基因類型的兩種熒光標記的探針進行雜交，除去未雜 交上的探針，然后熒光掃描，根據(jù)每個微球發(fā)出的顏色進行計數(shù)檢測、數(shù)字化分析，計算突變率。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1或8所述的檢測微突變的方法，其特征在于水凝膠芯片固定微球技 術(shù)是以聚丙烯酰胺凝膠作為載體將收集的微球固定于芯片上；即在自由基引發(fā)劑過硫酸銨 及加速劑四甲基乙二胺的作用下，包埋有固定了單鏈DNA擴增片段的微球的水凝膠通過聚 合反應形成聚丙烯酰胺凝膠，牢固地固定在丙烯基團修飾的玻璃芯片表面；所使用的水凝 膠各成分的比例為3% (w/w)丙烯酰胺單體(丙烯酰胺雙叉丙烯酰胺=29 : 1， w/w)、 30% (w/w)丙三醇、1% (w/v，g/ml)過硫酸銨、0. 4% (v/v)四甲基乙二胺，最終加ddH20至 100% ;制備單層微球芯片是在水凝膠混合物未發(fā)生聚合反應仍呈現(xiàn)液態(tài)時，蓋上蓋玻片，通 過蓋玻片的壓力使含有微球的水凝膠均勻地平鋪在玻璃芯片表面，形成單層微球芯片。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的檢測微突變的方法，其特征在于熒光檢測及數(shù)字化分析技 術(shù)是指以兩條不同熒光標記的探針分別代表了野生型和突變型，將兩條不同熒光標記的探 針與微球上單鏈DNA擴增片段進行雜交，兩種不同熒光標記的探針分別與野生型模板擴增 產(chǎn)物以及突變型模板擴增產(chǎn)物雜交，熒光掃描，雜交有不同熒光標記的探針的微球顯示不 同顏色，兩種顏色的微球分別代表了野生型和突變型，通過計數(shù)芯片上不同顏色的微球的 數(shù)目，進行數(shù)字化分析，計算得到總突變率。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)學生物技術(shù)領域，公開了一種微乳液克隆擴增結(jié)合水凝膠微球芯片數(shù)字化檢測微突變的方法。該方法是采用微球介導的微乳液克隆擴增技術(shù)結(jié)合水凝膠芯片固定微球熒光檢測及數(shù)字化分析技術(shù)進行微突變檢測的方法。本方法提高了微突變的陽性檢出率，成本低，靈敏度高，特異性好，可用于定量測定多種低豐度腫瘤相關(guān)基因的微突變。
文檔編號C12Q1/68GK101736087SQ20101010216
公開日2010年6月16日 申請日期2010年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月28日
發(fā)明者乞宗泰, 周國華, 黃歡 申請人:華東醫(yī)學生物技術(shù)研究所