專利名稱：一種用于雜交捕獲檢測(cè)基因組整合型病毒的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種用于雜交捕獲檢測(cè)基因組整合型病毒的試劑
品.O
背景技術(shù)：
病毒脫氧核糖核酸整合到人體細(xì)胞基因組中是感染的后期事件。常見的病毒 整合現(xiàn)象可以分為兩大類，一類是脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，縮寫DNA)病 毒的整合，比如乙型肝炎病毒Gfepatitis B virus，縮寫HBV)、EB病毒(Epstein-Barr virus，縮寫EBV)、腺相關(guān)病毒(Adenovirus-associated virus，縮寫AAV)和人乳頭瘤病 毒(Humanpapillomavirus，縮寫 HPV)；另一類是核糖核酸(ribonucleic acid，縮寫 RNA) 病毒的整合，比如丙型肝炎病毒Ofepatitis C virus，縮寫HCV)和人免疫缺陷病毒 (Humanimmunodeficiency virus，縮寫HIV)。DNA病毒整合主要借助細(xì)胞內(nèi)已有表達(dá)的整 合酶或轉(zhuǎn)座酶類實(shí)現(xiàn)，它們中一些需要等到細(xì)胞分裂時(shí)才能開始整合過程。RNA病毒的整合 則要更復(fù)雜一些，它們先逆轉(zhuǎn)錄成DNA形式，然后才能在自身整合酶介導(dǎo)下，插入人類基因 組中。病毒基因組整合將導(dǎo)致長期感染發(fā)生，這種情況下宿主細(xì)胞無法通過細(xì)胞內(nèi)酶降 解外源性DNA的方式，或以細(xì)胞分裂、增殖、凋亡等病理機(jī)制清除已經(jīng)侵入的病毒，故感染 不易消退。而且，病毒攜帶的癌基因還會(huì)使細(xì)胞獲得無限制繁殖能力。這使有絲分裂過程 中，細(xì)胞經(jīng)常出現(xiàn)染色體復(fù)制結(jié)構(gòu)和數(shù)量異常。因此，當(dāng)病毒DNA長期留存時(shí)，受感染細(xì)胞 就會(huì)逐步轉(zhuǎn)化為癌細(xì)胞。由病毒整合而導(dǎo)致癌癥發(fā)生的現(xiàn)象對(duì)于人類來說是十分常見的， 比如絕大多數(shù)肝癌、鼻咽癌和宮頸癌都是在病毒整合進(jìn)入細(xì)胞基因組后才逐步引發(fā)的； 血液系統(tǒng)淋巴瘤和白血病，也與多種親造血細(xì)胞病毒的基因組整合有關(guān)。所以，當(dāng)我們注意 到了病毒整合早于癌細(xì)胞發(fā)生的事實(shí)，并且認(rèn)識(shí)到了病毒整合后，其對(duì)細(xì)胞基因組持續(xù)誘 變作用是癌癥產(chǎn)生的主要原因，就會(huì)理解到這一點(diǎn)及時(shí)了解受感染的細(xì)胞中有否存在病 毒的基因組整合事件，會(huì)為臨床惡性腫瘤的防治工作提供具有非常重要價(jià)值的預(yù)警信息。然而，現(xiàn)在用于檢測(cè)整合型病毒的技術(shù)并不多，其關(guān)鍵在于如何獲得病毒DNA與 人類基因組DNA存在共價(jià)聯(lián)結(jié)證據(jù)。從工作原理來說，目前檢測(cè)方法大致分可以為三類1) 利用人基因組上已知的某些高度重復(fù)DNA序列和病毒已知DNA序列，設(shè)計(jì)引物對(duì)，進(jìn)行聚合 酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction，縮寫PCR)，以此證明病毒DNA與人基因組之間 的物理連續(xù)性。2)利用病毒基因組限制性酶切片斷長度的變化，以判斷病毒整合是否發(fā)生。 具體的操作原理和方法是先以限制性內(nèi)切核酸酶消化整合型病毒DNA。由于酶解片段如 攜帶人基因組DNA成分，則其長度必然大于正常。因此，當(dāng)發(fā)現(xiàn)異常增長的基因組限制性片 段后，則意味著病毒已經(jīng)完成基因組整合。3)建立細(xì)胞基因組文庫，然后對(duì)其中含有病毒基 因成分的文庫克隆測(cè)序鑒定，若測(cè)序結(jié)果中出現(xiàn)病毒基因和人基因的嵌合型序列，且交界 部位清晰可辨，則可以直接證明病毒DNA整合存在的事實(shí)。上述三種方法都有一定的缺陷，簡要說明如下
1)PCR方法是以人類基因組上的已知序列為擴(kuò)增基礎(chǔ)的，因此要求供引物結(jié)合的 人DNA序列屬于多拷貝基因家族，結(jié)構(gòu)相似，數(shù)量眾多，且在人基因組中分布均勻。已知符 合該條件的各基因家族中，以Alu序列最為合適，其拷貝數(shù)達(dá)到100萬個(gè)，但其分布仍不夠 均勻，相鄰區(qū)域間常存在大跨度空白區(qū)，均大于普通PCR技術(shù)所能擴(kuò)增到達(dá)的DNA片段長 度。而且，即便在密集分布區(qū)，也有多拷貝Alu串聯(lián)、倒位現(xiàn)象發(fā)生，常導(dǎo)致無效擴(kuò)增得發(fā) 生?？梢哉f，這種方法對(duì)整合型病毒的檢測(cè)靈敏度和特異性是有限的。2)限制性酶切方法雖然在靈敏度和特異性方面都可以達(dá)到一個(gè)比較高的檢測(cè)水 平，但其先決條件是能夠獲得單克隆細(xì)胞系，而且，細(xì)胞數(shù)量至少需要達(dá)到IO3個(gè)。這些限 制性條件決定了此類方法只適于一些已經(jīng)建成細(xì)胞系，無法推廣到真正的臨床實(shí)際工作中 去。3)基因組文庫方法不僅需要獲得已建成的腫瘤細(xì)胞系，還要耗費(fèi)大量勞動(dòng)力去對(duì) 得到的文庫克隆進(jìn)行大規(guī)模篩選和測(cè)序鑒定。所以，這類方法除了能夠提供最為直接和可 靠的病毒整合證據(jù)之外，就幾乎不再具有任何其他實(shí)際的臨床應(yīng)用價(jià)值了。核酸分子雜交研究初見于Dory P.等人60年代的系列工作中，他們首先證明溶液 中，低于DNA熔解溫度條件下，兩條堿基互補(bǔ)的單鏈DNA分子可以結(jié)合成為一條DNA雙鏈。 這個(gè)結(jié)論經(jīng)過不斷發(fā)展，便出現(xiàn)了例如將一條DNA單鏈固定在硝酸纖維素膜上，以另一條 帶放射性同位素標(biāo)記DNA單鏈對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)的Southern Blot技術(shù)；或用帶有放射性同位 素標(biāo)記的DNA單鏈分子對(duì)細(xì)胞內(nèi)部染色體上的序列或病毒顆粒DNA進(jìn)行測(cè)定的原位雜交技 術(shù)。近年來，分子生物技術(shù)領(lǐng)域中還出現(xiàn)了一種將已知DNA單鏈固定在塑料板、玻璃珠等 固相介質(zhì)上，待其雜交和富集樣品中的特定DNA分子后，再以另一條帶有化學(xué)標(biāo)記物的DNA 單鏈對(duì)由已知DNA分子雜交固定下來的未知DNA分子進(jìn)行鑒定的方法，稱為“夾心雜交”技 術(shù)。通常，我們把那些專用于探測(cè)某種未知DNA分子，帶有放射性同位素或其他化學(xué)標(biāo)記物 比如5氟尿嘧啶、生物素酰基、地高辛分子的DNA單鏈分子稱為“分子探針”。并且，將通過 其與固相介質(zhì)上DNA單鏈分子雜交，富集得到樣品中某種特定DNA分子的化學(xué)反應(yīng)過程，形 象稱為“雜交捕獲”。DNA分子間的雜交反應(yīng)需在一定緩沖條件下才能完成。雜交緩沖液中通常含鈉離 子、共軛酸根對(duì)和甲酰胺等成分。而緩沖溶液之外，“退火溫度”則對(duì)雜交反應(yīng)成敗起到了至 關(guān)重要的作用。當(dāng)溫度過高時(shí)，雜交反應(yīng)特異性雖好，但其敏感性下降；而當(dāng)溫度過低時(shí)，雜 交的敏感性增高，特異性卻變差。雜交反應(yīng)所形成的異源DNA雙鏈的熔解溫度可用公式計(jì) 算出來，這個(gè)公式是Tm = 81. 50C +16. 6Ig[Na+]+41 (GC 堿基對(duì)比例)-63 (甲酰胺比例)_500/n式中Tm表示DNA雙鏈熔解溫度，[Na+]表示鈉離子摩爾濃度，η表示探針堿基個(gè) 數(shù)。實(shí)際工作中，通常取Tm-25作為相對(duì)理想、合適的雜交退火溫度，但這個(gè)理論計(jì)算的退 火溫度值還需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果加以一定修正。雜交完成后，對(duì)于捕獲到的DNA，可再通過PCR技術(shù)加以鑒定。PCR是檢測(cè)微量DNA 的一種方法，由Mullis KB在1983 1985年間發(fā)明。其原理是利用引物與模板DNA分子 間反復(fù)的結(jié)合、延伸和分離循環(huán)，使原始DNA模板得到大量擴(kuò)增。因此，只要存在目標(biāo)序 列，PCR引物就會(huì)與之結(jié)合，并加以擴(kuò)增，從而可明確捕獲物中是否含有預(yù)期DNA序列。不 過，雖然PCR可以保證分子檢測(cè)的靈敏度，但擴(kuò)增過程中也有產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物的可能。因此，我們需要對(duì)產(chǎn)物作進(jìn)一步鑒定，以提高特異性，比如DNA測(cè)序。如果DNA測(cè)序的結(jié)果 和預(yù)期的片段成分一致，我們即可作出陽性結(jié)論，否則認(rèn)為是擴(kuò)增假陽性。另外還有一種 技術(shù)手段也可以提高PCR檢測(cè)的特異性，它使用了一種分子探針，我們將該技術(shù)稱為實(shí)時(shí) PCR(Real-time PCR)。其原理是以帶有熒光物質(zhì)標(biāo)記的分子探針，對(duì)每輪PCR循環(huán)的擴(kuò)增 產(chǎn)物作實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。以常見Taqman探針為例PCR所用的Taq酶可切割此類探針5’端的熒 光基團(tuán)，使之脫離3’端淬滅基團(tuán)的抑制，釋放到液相中，并發(fā)出熒光，因此，如果擴(kuò)增產(chǎn)物正 確，所用的Taqman探針就能和產(chǎn)物完全配對(duì)結(jié)合。于是，熒光基團(tuán)便會(huì)在PCR過程中被不 斷切割下來，其信號(hào)強(qiáng)度將呈指數(shù)上升。實(shí)際應(yīng)用時(shí)，Real-time PCR擴(kuò)增對(duì)象只要在規(guī)定 的循環(huán)數(shù)內(nèi)，達(dá)到了熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)，就可以判斷為陽性樣品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種用于雜交捕獲檢測(cè)基因組整合型病毒的試劑盒。這種試劑盒的 檢測(cè)技術(shù)建立在DNA-DNA分子雜交原理上，將與病毒DNA共價(jià)聯(lián)結(jié)的人基因組DNA作為捕 獲對(duì)象。這種試劑盒利用了固定于固相介質(zhì)上的人基因組DNA混合物，使之通過DNA-DNA雜 交的方式，從待測(cè)樣品中，捕捉到人源性DNA和病毒DNA通過共價(jià)聯(lián)結(jié)而成的嵌合性分子， 然后試劑盒通過Real-time PCR方法，對(duì)捕獲得到的基因組DNA加以鑒定，以正確判斷整合 型病毒是否存在(

圖1)。該基因組整合型病毒檢測(cè)試劑盒包括以下這些主要組分1)固定有人基因組 "DNA單鏈分子捕獲混合物”的固相介質(zhì)，2)用于鑒定雜交捕獲效率、特異性的“陽性”和“陰 性質(zhì)控品”，3)可對(duì)捕獲得到的“目標(biāo)DNA分子被捕獲混合物”進(jìn)行Real-time PCR鑒定的 引物對(duì)和分子探針。試劑盒主要組分中，所稱“DNA單鏈分子捕獲混合物”是指一組包含多 重、完整人類基因組序列。它們以單鏈形式存在，平均長度為256 4096堿基對(duì)的DNA片 段。而所稱“目標(biāo)DNA分子被捕獲混合物”則是指一組從待測(cè)樣品中通過雜交捕獲得到的 細(xì)胞基因組DNA片段，其平均大小彡1024堿基對(duì)，可能含有整合型病毒DNA。1、固定有人基因組“DNA單鏈分子捕獲混合物”的固相介質(zhì)。為獲得最大捕獲能力，并考慮人類基因組多樣性和人種間差異性，將來自1個(gè)或1 個(gè)以上不同個(gè)體的人類有核細(xì)胞DNA加以混合，構(gòu)建“DNA單鏈分子捕獲混合物”，使之具有 最大的人群代表性。我們所用于制備DNA混合物的細(xì)胞類型既可為已建成的各種腫瘤細(xì)胞 系，也可為外周血白細(xì)胞，或?yàn)檠蛩衫w維細(xì)胞等。但要求每份樣品中含有IO6 IO9個(gè)細(xì) 胞(IO6有核體細(xì)胞大致相當(dāng)于鋪滿1個(gè)75cm2培養(yǎng)瓶的細(xì)胞量，ImL血液中所有白細(xì)胞量， 或是IOmL羊水中含有的成纖維細(xì)胞數(shù)量)，以獲得足夠的DNA量。設(shè)共準(zhǔn)備N份細(xì)胞樣品。先抽提出這些樣品的基因組DNA，并將它們混合起來， 取混合物總體積1/N，作為待酶解樣品。此時(shí)，DNA混合物中包含了來自多個(gè)體的人基因組 DNA,總拷貝數(shù)IO6 IO9個(gè)，DNA總質(zhì)量為3 3000 μ g。然后根據(jù)限制性酶使用要求，以可 識(shí)別4 6核苷酸序列、含量足夠且不過量的II型限制性內(nèi)切核酸酶，例如Hae III等， 對(duì)DNA混合物進(jìn)行完全酶解，即片段化。酶切緩沖液體積為50 μ L，時(shí)間1小時(shí)。繼而以高 溫(90 100攝氏度)對(duì)反應(yīng)結(jié)束后，仍具活性的核酸內(nèi)切酶作滅活處理。將DNA酶解產(chǎn)物繼續(xù)加熱至100攝氏度，保持10分鐘，使DNA分子充分變性，完全 成為單鏈形式，然后立即置于冰水浴里，此即為“DNA單鏈分子捕獲混合物”。通過計(jì)算，我們可以證明，這些片段化的單鏈DNA分子的平均長度為256 4096個(gè)堿基。這里以識(shí)別4 核苷酸序列的限制性內(nèi)切酶為例，加以說明按概率估計(jì)，一個(gè)基因組中，大約每隔44個(gè)堿 基對(duì)會(huì)出現(xiàn)一個(gè)識(shí)別位點(diǎn)。因此，酶解片段平均長度為44 = 256個(gè)堿基。取固態(tài)材料，即固相介質(zhì)材料，比如尼龍膜、硝酸纖維素膜以及各種塑料或玻 璃質(zhì)地的微珠，與前述經(jīng)過酶解的DNA樣品偶聯(lián)。所使用固相介質(zhì)應(yīng)占據(jù)盡可能最小的體 積或面積，以便放置于1. 5mL離心管內(nèi)。操作時(shí)，要先根據(jù)所用固相介質(zhì)材料，將經(jīng)熱變性 處理的DNA樣品稀釋于它們所對(duì)應(yīng)的不同類型緩沖液中。然后按不同介質(zhì)的固化要求，對(duì) DNA樣品施以最適合的偶聯(lián)處理。待DNA完全結(jié)合后，從DNA單鏈分子混合物溶液中取出固 相介質(zhì)，并使之干燥。2、固相介質(zhì)的應(yīng)用——“雜交捕獲”過程和“陽性”、“陰性質(zhì)控品”的制備?！半s交捕獲”以DNA-DNA分子雜交方法捕捉待測(cè)樣品中所有人基因組DNA成分。故 為提高捕獲效率，我們也對(duì)樣品DNA進(jìn)行酶解處理。同時(shí)考慮到限制性DNA片段中可能含 有一定量病毒DNA，故為保持病毒序列完整性，將酶切所得的產(chǎn)物長度控制在1024堿基對(duì) 以上。為此，采用能識(shí)別5個(gè)或5個(gè)以上核苷酸序列的II型限制性內(nèi)切核酸酶，比如=BamH I等，對(duì)待測(cè)細(xì)胞樣品的DNA抽提物進(jìn)行酶切消化處理。所用方法如同前述，即經(jīng)過DNA定 量、酶解、滅活和熱變性各步驟，最后得到DNA單鏈產(chǎn)物。需注意的是，制備得到的待測(cè)樣品所含DNA量不應(yīng)多于制備于固相介質(zhì)上的“DNA 單鏈分子捕獲混合物”的分子總數(shù)。這樣方可保證樣品中所有基因組DNA都能被固相吸附 介質(zhì)捕獲到。為此，待側(cè)樣品細(xì)胞數(shù)應(yīng)被控制在IO3 IO6之間。如此，既不會(huì)因細(xì)胞DNA樣 品太少而影響整合型病毒DNA分子的捕獲量，也不會(huì)因樣品中含有過多的人類基因組DNA 成分，干擾了少量病毒_人基因組嵌合型DNA分子與固相介質(zhì)的雜交結(jié)合，從而保證了應(yīng)有 病毒DNA捕獲靈敏度。具體捕獲反應(yīng)是在ImL雜交液中進(jìn)行的。所用雜交體系和操作流程與常用分子雜 交方法一致，整個(gè)雜交過程包括預(yù)雜交、雜交和洗滌等各步驟。由于現(xiàn)有多種雜交緩沖試劑 可供選擇，如SSC，SSPE, Denhardt試劑，磷酸-SDS洗液等，配方成熟，也有很多文獻(xiàn)可供借 鑒，故這里不多作敘述。但要說明的是，雜交結(jié)束后，要對(duì)雜交捕獲的效率和特異性進(jìn)行判 別，以選擇最佳雜交退火溫度。本發(fā)明為此采用的具體效率判別和溫度選擇方法為先在兩 個(gè)獨(dú)立的雜交捕獲體系中(不含待檢測(cè)樣品)分別加入陽性和陰性質(zhì)控品。待雜交捕獲反 應(yīng)結(jié)束后，以Real-time PCR方法分別測(cè)定捕獲到的陽性和陰性質(zhì)控品量。然后，根據(jù)質(zhì)控 品實(shí)驗(yàn)結(jié)果，調(diào)整合適雜交退火溫度，使這一溫度下，"DNA單鏈分子捕獲混合物”所能捕捉 到的“陽性質(zhì)控品”數(shù)量最多，“陰性質(zhì)控品數(shù)”量最少，即使該雜交捕獲體系達(dá)到最大靈 敏度和特異性。“陽性質(zhì)控品”和“陰性質(zhì)控品”是人工合成DNA分子，以單鏈或環(huán)狀雙鏈質(zhì)粒形式 提供。這些質(zhì)控品有相似基本結(jié)構(gòu)，即1)上、下游引物結(jié)合區(qū)，2)分子探針結(jié)合區(qū)，3)雜交 識(shí)別區(qū)和4)下游引物結(jié)合區(qū)，具體可見圖2、3。其中，供上、下游引物結(jié)合的序列分別位于 兩端，并且上、游引物結(jié)合區(qū)與雜交識(shí)別區(qū)之間，有供分子探針結(jié)合的區(qū)域，以對(duì)質(zhì)控品捕 獲量進(jìn)行Real-time PCR鑒定。質(zhì)控品雜交識(shí)別區(qū)片段長度為幾十 幾百個(gè)堿基。并且，陽 性和陰性質(zhì)控品中，雜交識(shí)別區(qū)的序列結(jié)構(gòu)是不相同的如是陽性質(zhì)控品，則其雜交識(shí)別區(qū) 中既含人源性序列，也含病毒序列；如是陰性質(zhì)控品，則其雜交識(shí)別區(qū)只含病毒序列，不含任何人基因組DNA成分。上下游引物結(jié)合區(qū)和分子探針結(jié)合區(qū)內(nèi)DNA序列經(jīng)過特殊設(shè)計(jì)， 使之與人或HPV基因組無相似性，不會(huì)導(dǎo)致無關(guān)擴(kuò)增產(chǎn)物或非特異性熒光信號(hào)出現(xiàn)。陽性 質(zhì)控品雜交結(jié)合區(qū)內(nèi)人源性序列也經(jīng)過特殊設(shè)計(jì)，是一段高度保守、易于被捕獲到的人基 因組序列，長度為50核苷酸。陰性質(zhì)控品雜交識(shí)別區(qū)內(nèi)不含人源序列，除非發(fā)生非特異性 結(jié)合，否則其不會(huì)被固相介質(zhì)雜交捕獲得到。故一旦從雜交捕獲產(chǎn)物中鑒定出陰性質(zhì)控品， 則意味著假陽性產(chǎn)生，此時(shí)需調(diào)整雜交退火溫度。陽性質(zhì)控品上、下游引物結(jié)合區(qū)序列、探針結(jié)合區(qū)序列和雜交識(shí)別區(qū)的人源性序 列，以及陰性質(zhì)控品的上下游引物結(jié)合區(qū)序列和探針識(shí)別區(qū)序列，如表1所示。表1.陽性和陰性質(zhì)控品各結(jié)構(gòu)區(qū)域的具體DNA序列
權(quán)利要求
一種用于雜交捕獲檢測(cè)基因組整合型病毒的試劑盒，其特征在于該試劑盒包括以下這些主要組分1)固定有人基因組DNA單鏈分子捕獲混合物的固相介質(zhì)，2)用于鑒定雜交捕獲效率、特異性的陽性和陰性質(zhì)控品，3)可對(duì)捕獲得到的目標(biāo)DNA分子被捕獲混合物進(jìn)行Real time PCR鑒定的引物對(duì)和分子探針。
2.如權(quán)利要求1所述用于雜交捕獲檢測(cè)基因組整合型病毒的試劑盒，其特征在于在制 備固定有人基因組DNA單鏈分子捕獲混合物的固相介質(zhì)的過程中用到的DNA單鏈分子具有 如下特征1)這些單鏈DNA分子是一種片段化的單鏈DNA分子混合物，它們來自于1個(gè)或1個(gè)以 上不同個(gè)體的人類有核細(xì)胞；2)這些單鏈DNA分子是通過將片段化的雙鏈DNA分子經(jīng)過加熱變性處理而得到，它們 是以單鏈形態(tài)存在的DNA分子；3)這些單鏈DNA分子對(duì)應(yīng)的片段化雙鏈DNA分子是通過可識(shí)別4 6核苷酸序列、足 夠且不過量的II型限制性內(nèi)切核酸酶處理人類有核細(xì)胞DNA后得到。
3.如權(quán)利要求1所述用于雜交捕獲檢測(cè)基因組整合型病毒的試劑盒，其特征在于陽性 質(zhì)控品為一個(gè)化學(xué)結(jié)構(gòu)上連續(xù)的DNA分子，此DNA分子包含如下序列成分1)上游引物結(jié)合區(qū)5，-GGAATGGACTGGCTGGTAGATGGG-3，，2)探針結(jié)合區(qū)5，-GGGAGTAGGCTGTGTATGGAA-3，，3)雜交識(shí)別區(qū)人源性序列5’-ACTGGGACGACATGGAGAAATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAG CTG-3，，4)下游引物結(jié)合區(qū)5，-GACAAGCGTGGAGTGACTGACT-3，。
4.如權(quán)利要求1所述用于雜交捕獲檢測(cè)基因組整合型病毒的試劑盒，其特征在于陰性 質(zhì)控品為一個(gè)化學(xué)結(jié)構(gòu)上連續(xù)的DNA分子，此DNA分子包含如下序列成分1)上游引物結(jié)合區(qū)5，-GAGACAATCAATCGGACGACAGGG-3，，2)探針結(jié)合區(qū)5，-GGGAGTAGGCTGTGTATGGAA-3，，3)下游引物結(jié)合區(qū)5’-GGTGTAGTACATTCTGAGCCGA-3，。
5.如權(quán)利要求1所述用于雜交捕獲檢測(cè)基因組整合型病毒的試劑盒，其特征在于按照 如下DNA序列，合成引物對(duì)和分子探針，對(duì)陽性質(zhì)控品進(jìn)行Real-time PCR鑒定1)上游引物序列5，-GGAATGGACTGGCTGGTAGATGGG-3，，2)下游引物序列5’-AGTCAGTCACTCCACGCTTGTC-3，，3)分子探針序列5’-GGGAGTAGGCTGTGTATGGAA-3，。
6.如權(quán)利要求1所述用于雜交捕獲檢測(cè)基因組整合型病毒的試劑盒，其特征在于按照 如下DNA序列，合成引物對(duì)和分子探針對(duì)陰性質(zhì)控品進(jìn)行Real-time PCR鑒定1)上游引物序列5，-GAGACAATCAATCGGACGACAGGG-3，，2)下游引物序列5，-TCGGCTCAGAATGTACTACACC-3，，3)分子探針序列5’-GGGAGTAGGCTGTGTATGGAA-3，。
7.如權(quán)利要求1所述用于雜交捕獲檢測(cè)基因組整合型病毒的試劑盒，其特征在于按照 如下DNA序列，合成引物對(duì)和探針對(duì)整合型病毒DNA分子進(jìn)行Real-time PCR鑒定1)用于鑒定人乙肝病毒的引物對(duì)和探針序列 上游引物序列5' -CTTCTCATCTGCCGGACCGTN-3 ‘ 下游引物序列5' -CTCCATGCTACGTGCAGAGGN-3 ‘ 分子探針序列5' -TCGCTTCACCTCTGCACGTA-3 ‘2)用于鑒定人乳頭瘤病毒的引物對(duì)和探針序列 上游引物序列5’ -GATTTAWBHATAGTRTATAGAGAN-3‘ 下游引物序列5，-ANATGTCTTHNTTTTTCTDSWGGRN-3‘ 分子探針序列5，-TTIIIIICIAIIITIAGIGAIT-3’3)用于鑒定EB病毒的引物對(duì)和探針序列 上游引物序列5' -CCTCGGACAGCTCCTAAGAAN-3 ‘ 下游引物序列5' -CCTGAAGGTGAACCGCTTACN-3 ‘ 分子探針序列5' -GGTCCTCGTCCAGCAAGAAG-3 ‘4)用于鑒定I型人單純皰疹病毒的引物對(duì)和探針序列 上游引物序列5' -GGCGATTGGTCGTAATCCAGN-3 ‘ 下游引物序列5' -CGGCGACCTGTATAACGTGTN-3 ‘ 分子探針序列5' -GTTATACAGGTCGCCGTTGG-3 ‘5)用于鑒定II型人單純皰疹病毒的引物對(duì)和探針序列 上游引物序列5' -GTCGGCCAAGACGTCCAAGAN-3 ‘ 下游引物序列5' -CGCATCGAGGACACGCTGTTN-3 ‘ 分子探針序列5' -ATGTGGTACAAGTCCCCGTT-3 ‘其中R = A、G ;Y = C、T ;K = G、T ;S = G、C ;M = A、C = A、T ;B = G、C、T ;V = A、 G、C ;D = A、G、T ;H = A、C、T ;N = A、G、C、T ;I =肌苷。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種用于雜交捕獲檢測(cè)基因組整合型病毒的試劑盒。該試劑盒的主要組成部分包括1)固定有人基因組DNA單鏈分子捕獲混合物的固相介質(zhì)，2)用于鑒定雜交捕獲效率、特異性的陽性和陰性質(zhì)控品，3)可對(duì)捕獲得到的目標(biāo)DNA分子被捕獲混合物進(jìn)行Real-time PCR鑒定的引物對(duì)和分子探針。利用本發(fā)明所述全部或部分組分，可以裝配出完全的或具有類型專一性的基因組整合型病毒檢測(cè)試劑盒。所獲得的病毒檢測(cè)試劑盒可對(duì)組織或細(xì)胞學(xué)標(biāo)本中，一些比較常見的整合性、致癌性病毒，包括人乙肝病毒、人乳頭瘤病毒、Epstein-Barr病毒、人單純皰疹病毒進(jìn)行基因組整合狀態(tài)的檢測(cè)和鑒別。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101974652SQ20101002301
公開日2011年2月16日 申請(qǐng)日期2010年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月20日
發(fā)明者何以豐 申請(qǐng)人:何以豐