專利名稱：：結(jié)核分枝桿菌免疫優(yōu)勢抗原的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的領(lǐng)域是與結(jié)核分枝桿菌選定抗原有關(guān)的組合物和方法，特別是涉及在診斷性和治療性組合物和方法中的用途。用于免疫接種和/或診斷目的的抗原通常是來自病原體的單一抗原，或者是來自病原體的多個已知抗原的復(fù)雜混合物，或病原體的多個已知和未知抗原的復(fù)雜混合物，比如活的、減毒的或滅活的細(xì)菌或病毒。根據(jù)病原體的具體類型，單一抗原可能在免疫診斷測試(抗體或細(xì)胞反應(yīng))中提供量化信號。然而，由于個體免疫反應(yīng)情況的不同，單一抗原檢測往往不足以獲得具備有用的特異性和敏感性的可用診斷信息。例如，準(zhǔn)確診斷結(jié)核病(TB)往往需要多項(xiàng)測試。最典型的，對于被懷疑感染結(jié)核分枝桿菌的人使用結(jié)核菌素皮試(TST)進(jìn)行檢測，該項(xiàng)測試經(jīng)常會給出各異的結(jié)果，使得對結(jié)果的解釋很少一致。替代的測試是干擾素Y釋放檢驗(yàn)(IGRAs)。這些檢驗(yàn)比TST測試特異性更強(qiáng)，但它們?nèi)匀徊荒芴峁┮粋€方法將帶有活動性結(jié)核病的人與染菌了但目前沒有活躍的疾病進(jìn)程的人區(qū)分開來。對于活動性結(jié)核病的調(diào)查，可以采用痰抗酸桿菌涂片檢驗(yàn)來直接鑒定結(jié)核分枝桿菌，該項(xiàng)檢驗(yàn)往往能提供良好的特異性。但是，不同實(shí)驗(yàn)室之間的靈敏度差別很大。為了獲得較明確的結(jié)果，可以由例如痰或其它體液進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)來診斷活動性結(jié)核病。不幸的是，這樣的測試需要一個專門的微生物實(shí)驗(yàn)室，并且要幾個星期才能得到結(jié)果。近期發(fā)展的方法，比如實(shí)時PCR檢測相對準(zhǔn)確，但需要復(fù)雜的設(shè)備和訓(xùn)練有素的人員，而且非常容易受到樣品之間的交叉污染。鑒于以上的缺陷，需要開發(fā)基于抗體的測試，所述測試能夠克服與細(xì)菌培養(yǎng)、基因分析或其他已知方法相關(guān)的至少某些困難。大量工作已致力于界定和識別結(jié)核分枝桿菌膜組分中的和結(jié)核分枝桿菌條件培養(yǎng)基(“培養(yǎng)濾液蛋白”或CFPQ中的免疫反應(yīng)性蛋白。通常在ELISA和Western印跡中利用TB血清和來自健康對照的血清檢測候選抗原是否可用于診斷。由于可溶性蛋白操作方面的便利，CFPS得到更廣泛的研究。在培養(yǎng)濾液里>100M的結(jié)核蛋白(代表大約2.5%的結(jié)核分枝桿菌蛋白質(zhì)組)中，大約二十幾個被來自TB患者的血清識別，其中大部分此前已得到鑒定。然而，盡管這些努力，仍然沒有具備準(zhǔn)確診斷結(jié)核病(尤其是在感染的早期階段)所需的靈敏度和特異性的有效血清學(xué)檢測。此外，迄今已知的抗原都不能普遍適用于區(qū)分疾病的不同階段(例如，活動性疾病與非活動性)、繼發(fā)感染等，因?yàn)樾盘柣蛘邿o法去卷積(deconvolute)(例如，來自滅活病原體的復(fù)合信號)或者只提供了一個單一的數(shù)據(jù)點(diǎn)。同樣，對于已知抗原在疫苗中的使用，我們知道有許多由于個體免疫反應(yīng)的差異和潛在的先前接觸帶來的問題。最近，已出現(xiàn)了多價疫苗制品，所述制品在單個劑量中結(jié)合了來自單一病原生物體的多種不同血清型的多個不同抗原(Prevnar抗肺炎鏈球菌莢膜血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的7價疫苗)。雖然這種混合制劑往往提供了抗不同血清型的更廣范的保護(hù)，但各種困難仍然存在。最顯著的是，當(dāng)單一抗原不能引起免疫反應(yīng)時，就涵蓋不了抗相應(yīng)血清型的保護(hù)。因此，來自幾個血清型的單一確定抗原的組合，只是將與單一抗原關(guān)聯(lián)的好處和問題合并在了一起。因此，盡管本領(lǐng)域已知的抗原鑒定和使用方法有很多，但它們?nèi)炕驇缀跞慷加幸粋€或多個缺點(diǎn)。因此，對于用在TB診斷和治療中的來自結(jié)核分枝桿菌的抗原的改進(jìn)組合物和方法仍然存在一個很大的尚未滿足的需求。發(fā)明概述本發(fā)明涉及來自結(jié)核分枝桿菌的免疫優(yōu)勢抗原，其中所述抗原已知對來自感染病原體的患者群的血清有反應(yīng)，即對所述血清有已知的反應(yīng)性(尤其是已知的相對反應(yīng)性)。因此，本文介紹的抗原在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有高概率在比較大的患者群體中引發(fā)免疫反應(yīng)。此外，對于確定是來自選定亞群(例如，活躍階段、潛伏階段、過去的感染、先前的接種、沒有感染或者合并感染了其他病原體等)的抗原，抗原也可能具有與疾病參數(shù)的已知相關(guān)性。發(fā)明主題的一個方面，抗原組合物包含由選自SEQIDNO:1至586(或者這些序列的任何亞組)的核酸或其片段所編碼的復(fù)數(shù)種結(jié)核分枝桿菌抗原，其中至少有兩個抗原能夠引發(fā)免疫反應(yīng)。發(fā)明主題的其他考慮方面，抗原組合物包含致病生物體的兩個或兩個以上的免疫優(yōu)勢抗原，并且抗原與載體相連，其中所述抗原與感染了生物體的群體的血清有已量化且已知的相對反應(yīng)性，其中所述抗原與疾病參數(shù)有已知的相關(guān)性。最優(yōu)選地，免疫優(yōu)勢抗原是多肽，由具有SEQIDNO:1至SEQIDNO:586序列(或包含其片段)的核酸所編碼。還考慮了所述已知反應(yīng)性可以由多種因素表征，但是，特別優(yōu)選已知反應(yīng)性是由免疫原性強(qiáng)度和/或感染的時間進(jìn)程表征。通常優(yōu)選參數(shù)是疾病的活躍狀況、以前與病原體的接觸、與病原體的接觸時間、慢性感染、過去的疾病、活動性感染、非活動性感染、對病原體感染的至少部分免疫，和/或經(jīng)過治療的結(jié)果。發(fā)明主題的另一個方面，載體是醫(yī)藥學(xué)可接受的載體，組合物被制成疫苗。這些方面中，通常優(yōu)選疫苗包含多個抗原(例如，至少有兩個、四個或六個)。再進(jìn)一步考慮了抗原或其片段是至少部分純化和/或重組的。再有的考慮方面，載體也可能是固體載體，多個抗原在載體上排列為混合物或者陣列。在這類陣列中，優(yōu)選抗原具有至少兩種不同的反應(yīng)性和/或參數(shù)。還考慮了抗原或其片段可能處于未加工的表達(dá)提取物、部分純化的形式(例如，低于60%的純度)、或者高度純化的形式(例如，至少95%的純度)。這種陣列中的抗原可以是重組的或天然的。替代地，固相不必局限于平面陣列，而是還可以包括珠子、柱子、試紙條(dipstick)形式等等。本發(fā)明的方面包括利用結(jié)核分枝桿菌的至少兩種免疫優(yōu)勢抗原進(jìn)行的診斷方法。抗體檢測包括將含有抗結(jié)核分枝桿菌的抗體的體液樣本(例如血清)與至少兩種本發(fā)明的免疫優(yōu)勢抗原進(jìn)行接觸；通過任何令人滿意的方法，優(yōu)選通過生色或產(chǎn)生熒光信號來檢測抗原抗體結(jié)合。例如，固定在固體表面的抗原(或者各自分布在離散的區(qū)域或者是混合物)可用于固定樣品中的抗體，然后可以加入直接或間接連接著生色酶的抗抗體以便在標(biāo)準(zhǔn)ELISA形式中產(chǎn)生信號。替代地，通過比如將抗抗體(直接或間接地)連接熒光發(fā)射物質(zhì)的方法，可以生成熒光信號。本發(fā)明的方面還包括使用游離于溶液，而不是固定在表面上的至少兩種免疫優(yōu)勢抗原。例如，外周血樣本，含有T淋巴細(xì)胞的體液，可以與此類抗原在體外接觸。T淋巴細(xì)胞和(抗原呈遞細(xì)胞上的)抗原之間的反應(yīng)和抗原抗體反應(yīng)一樣，都是表位特異的，即使T淋巴細(xì)胞和抗體可能識別不同的表位。如果抗原被識別，T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生至少一種細(xì)胞因子(比如干擾素Y)，后者然后被(直接或間接)標(biāo)記的抗體所檢測。本發(fā)明的方面還包括執(zhí)行檢測的試劑盒。根據(jù)本發(fā)明，這些試劑盒包含至少兩種免疫優(yōu)勢抗原。由以下對優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述連同附圖(同樣的數(shù)字代表同樣的成分)，發(fā)明主題的各種目的、特征、方面和優(yōu)勢將更加明顯。圖IA和IB描繪了分別用來自TB陽性和LTBI陰性(即沒有感染結(jié)核分枝桿菌)個體的血清探測的示范性微陣列。圖2A和2B描繪了示范性TB陽性和LTBI陰性結(jié)果的信號統(tǒng)計(jì)差異。圖2C的表列出了使用優(yōu)選的示范性排序算法選定的TB抗原。圖3A和:3B描繪了示范性微陣列的示范性熒光和比色顯譜，各自的散點(diǎn)圖表明顯譜之間的相關(guān)性。圖4A和4B描述了隨機(jī)森林、CERNO和經(jīng)CERNO預(yù)過濾數(shù)據(jù)的隨機(jī)森林中的蛋白質(zhì)排名。圖5描述的蛋白質(zhì)在TB樣品中顯示更高強(qiáng)度信號的尾分布，這在非TB樣品中未看到。發(fā)明詳述發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了適合診斷和治療目的的多種來自結(jié)核分枝桿菌的免疫優(yōu)勢抗原。特別優(yōu)選的免疫優(yōu)勢抗原是具有SEQIDNO:1至SEQIDNO:586序列的核酸所編碼的那些抗原，通常設(shè)想這種抗原在生產(chǎn)各種診斷裝置、治療組合物和疫苗中可作為單一抗原，或(任選與來自另一種病原體的抗原)組合使用。優(yōu)選適用于診斷和治療目的的免疫優(yōu)勢抗原是由如下命名的序列編碼的Rv0798c(SEQIDNO:121)、Rvl886c(SEQIDNO:270)、Rv2031c(SEQIDNO:284),Rv3616c(SEQIDNO:509)、Rv3804c(SEQIDNO:534)、Rv3874(SEQIDNO:547)、Rv0302(SEQIDNO:52)、Rv0379(SEQIDNO:65)、Rv0394c(SEQIDNO:66)、Rv0456c(SEQIDNO:74)、Rv0632c(SEQIDNO:103)、Rv0944(SEQIDNO:142)、Rv0984(SEQIDNO:146)、Rvl030(SEQIDNO:153)、RvI196(SEQIDNO:174)、Rvl242(SEQIDNO:180)、Rvl284(SEQIDNO:187)、Rvl387(SEQIDNO:206)、Rvl837c(SEQIDNO:264),Rvl926c(SEQIDNO:275)、Rvl980c(SEQIDNO:281)、Rv2094c(SEQIDNO:294),Rv2544(SEQIDNO:363)、Rv2618(SEQIDNO:375)、Rv2746c(SEQIDNO:391)、Rv2870c(SEQIDNO:407)、Rv2873(SEQIDNO:408)、Rv2875(SEQIDNO:409)、Rv3050c(SEQIDNO434)、Rv3248c(SEQIDNO:458)、Rv3376(SEQIDNO:478)、Rv3763(SEQIDNO:527)、Rv3810(SEQIDNO:536)、Rv3864(SEQIDNO:545)、Rv2252(SEQIDNO:323)、Rv2282c(SEQIDNO:569)、Rv0212c(SEQIDNO:557)、Rv3243c(SEQIDNO:456)、Rv3675(SEQIDNO519)、Rv2984(SEQIDNO:423)、RvI175c(SEQIDNO:169)、Rv3326(SEQIDNO:578)、Rv3628(SEQIDNO:513)、Rv3775(SEQIDNO:584)、Rv3362c(SEQIDNO:475)、Rv0801(SEQIDNO:122)、Rvl629(SEQIDNO:566)、Rv0272c(SEQIDNO:558)、Rv3762c(SEQIDNO:583)、Rv3319(SEQIDNO:577)、Rv3495c(SEQIDNO:581)、Rv2151c(SEQIDNO:308)、Rv0227c(SEQIDNO:37)、Rv0280(SEQIDNO:50)、Rv0993(SEQIDNO:148)、Rvl306(SEQIDNO:192)、Rvl363c(SEQIDNO:204)、Rv2050(SEQIDNO:288)、Rv2116(SEQIDNO:299)、Rv3417c(SEQIDNO:486)、Rv3653(SEQIDNO:516)、Rvl253(SEQIDNO:182)、Rv3413c(SEQIDNO:485)、Rvl635c(SEQIDNO:232)、Rv3021c(SEQIDNO:432)、RvI193(SEQIDNO:173)、Rv2592c(SEQIDNO:369)、Rv3620c(SEQIDNO:510)、Rv0929(SEQIDNO:139)、Rv0959(SEQIDNO:145)、RvI162(SEQIDNO:166)、Rv2389c(SEQIDNO:341)、Rv2984(SEQIDNO:423)、Rv2588c(SEQIDNO:367)、Rv0171(SEQIDNO:26)、RvI865c(SEQIDNO:267)、Rv2074(SEQIDNO:290)、Rv0543c(SEQIDNO:87)、Rvl677(SEQIDNO:237)、Rv1304(SEQIDNO:191)、Rv2841c(SEQIDNO:400)、Rv3680(SEQIDNO:520)、Rv0831c(SEQIDNO:125)、Rv2032(SEQIDNO:285),Rv3127(SEQIDNO:446)、Rv3272(SEQIDNO:464)、Rv3323c(SEQIDNO:470)、Rv3508(SEQIDNO:494)、Rv3628(SEQIDNO:513)、RvI173(SEQIDNO167),Rv2623(SEQIDNO:376)、Rv0527(SEQIDNO:85)、Rvl620c(SEQIDNO:229),Rvl901(SEQIDNO:272)、Rv215Ic(SEQIDNO:308)、Rv0362(SEQIDNO:60)、Rv3129(SEQIDNO:447)、Rv3140(SEQIDNO:449)、Rv0340(SEQIDNO:56)、Rv2792c(SEQIDNO:395)、Rv3003c(SEQIDNO:426)、Rv3019c(SEQIDNO:431)、Rv3862c(SEQIDNO544)、Rv0572c(SEQIDNO:91)、Rv2477c(SEQIDNO:356),Rv2659c(SEQIDNO:379)、Rv0311(SEQIDNO:54)、Rv0350(SEQIDNO:57)、Rv2127(SEQIDNO:301)、Rv3875(SEQIDNO:548)、Rv0877(SEQIDNO:134)、Rvl916(SEQIDNO:274)、Rv2138(SEQIDNO:303)、Rv2847c(SEQIDNO:403)、Rv3118(SEQIDNO:444)、Rv2495c(SEQIDNO:358)、Rv3669(SEQIDNO:517)、Rv0281(SEQIDNO:51)、Rv2711(SEQIDNO:383)、Rv2744c(SEQIDNO:390)、Rv3803c(SEQIDNO:533)、Rvl239c(SEQIDNO:179)、Rv2147c(SEQIDNO:307)、Rv2253(SEQIDNO:324)、Rv0308(SEQIDNO:53)、Rv0587(SEQIDNO:95)、Rvl564c(SEQIDNO:224)、Rv2185c(SEQIDNO:313)、Rvl805c(SEQIDNO:261)、Rv2729c(SEQIDNO:386)、Rv3386(SEQIDNO:481)、Rv3515c(SEQIDNO:497)、Rv0772(SEQIDNO:116)、Rv2948c(SEQIDNO:420)、Rv0006(SEQIDNO1),Rvl906c(SEQIDNO:273)、Rv2244(SEQIDNO:322)、Rv2468c(SEQIDNO:354)、Rv3701c(SEQIDNO:522)、Rv0054(SEQIDNO:6)、Rvl945(SEQIDNO:277)、Rv3345c(SEQIDNO:472)、Rv0276(SEQIDNO:48)、Rv0709(SEQIDNO:108)、Rvl527c(SEQIDNO:220)、Rv2048c(SEQIDNO:287)、Rv2414c(SEQIDNO345)、Rv3524(SEQIDNO:499)、Rv3556c(SEQIDNO:502)、Rvl322(SEQIDNO:196)、Rv2934(SEQIDNO:417)、Rv0270(SEQIDNO:47)、Rv0612(SEQIDNO:99)、Rvl699(SEQIDNO:242)、Rv2728c(SEQIDNO:385)、Rv3017c(SEQIDNO:430)、Rv3364c(SEQIDNO476)、Rv3418c(SEQIDNO:487)、Rv3718c(SEQIDNO:525)、Rv0426c(SEQIDNO:70)、RvI181(SEQIDNO:171)、Rvl725c(SEQIDNO:250)、Rv0256c(SEQIDNO:44)、Rv0605(SEQIDNO:98)、Rv0737(SEQIDNO:114)、Rv0834c(SEQIDNO:126)、Rvl255c(SEQIDNO:184)、Rv2224c(SEQIDNO:320)、RvI843c(SEQIDNO:265)、Rv2333c(SEQIDNO:334)、Rv2490c(SEQIDNO:357)、Rv3183(SEQIDNO:454)、Rv0668(SEQIDNO:106)、Rvl556(SEQIDNO:223)、Rvl673c(SEQIDNO:236)、Rv3513c(SEQIDNO:496)、Rv3675(SEQIDNO:519)、Rv3870(SEQIDNO:546)、Rv3891c(SEQIDNO:552)、Rv0163(SEQIDNO:24)、Rv0710(SEQIDNO:109)、Rvl297(SEQIDNO:189)、Rvl745c(SEQIDNO:255)、Rv0600c(SEQIDNO:97)、Rvl536(SEQIDNO:222)、Rvl738(SEQIDNO:254)、Rv2524c(SEQIDNO:359)、Rv3086(SEQIDNO:440)、Rv3367(SEQIDNO:477)、Rv0135c(SEQIDNO:20)、Rv0627(SEQIDNO:101)、Rvl448c(SEQIDNO:213)、Rv3224a(SEQIDNO:455)、Rv0029(SEQIDNO:2)、Rv0846c(SEQIDNO:129)、RvI159(SEQIDNO:165)、RvI186c(SEQIDNO:172)、Rvl705c(SEQIDNO:243)、Rvl713(SEQIDNO:248)、Rv2476c(SEQIDNO:355)、Rv3402c(SEQIDNO:483)、Rv2615c(SEQIDNO:374),Rv2995c(SEQIDNO:425)、Rv3788(SEQIDNO:585)、Rv0140(SEQIDNO:555)、Rv0203(SEQIDNO:33)、Rvl531(SEQIDNO:565)、Rvl693(SEQIDNO:241)、Rvl882c(SEQIDNO:269)、Rv2143(SEQIDNO:568)、Rv2367c(SEQIDNO:570)、Rv0584(SEQIDNO:94)、Rvl651c(SEQIDNO:567)、Rv3197a(SEQIDNO:576)、Rv3369(SEQIDNO:579)、Rv3825c(SEQIDNO:586)、RvOlOl(SEQIDNO15)、Rv0808(SEQIDNO:123)、Rv0814c(SEQIDNO:560)、Rv2153c(SEQIDNO:309)、Rv2933(SEQIDNO:416)、Rv0071(SEQIDNO:9)、Rv2471(SEQIDNO:571),Rv2979c(SEQIDNO:575)、Rv0155(SEQIDNO:556)、Rv0581(SEQIDNO:559)、Rv2631(SEQIDNO:377)、Rv3455c(SEQIDNO:489)、Rv3601c(SEQIDNO:505)、Rv0896(SEQIDNO:562)、Rvl641(SEQIDNO:234)、Rv3005c(SEQIDNO:427)、Rv3759c(SEQIDNO:582)、Rv3800c(SEQIDNO532)、Rv0187(SEQIDNO:30)、Rv2379c(SEQIDNO:338)、Rv2434c(SEQIDNO:352)、Rv2940c(SEQIDNO:574)、Rv3477(SEQIDNO:580)、Rv0435c(SEQIDNO:72)、Rv0844c(SEQIDNO:128)、Rv0856(SEQIDNO:561)、RVI191(SEQIDNO:564)、Rv2803(SEQIDNO:397)、Rv0783c(SEQIDNO:118)、Rvl054(SEQIDNO:563)、Rvl689(SEQIDNO:240)、Rv2539c(SEQIDNO:572),Rv2859c(SEQIDNO:573)、Rv3777(SEQIDNO:528)及它們的片段。最優(yōu)選地，免疫優(yōu)勢抗原是由被命名為Rv0798c(SEQIDNO121)、Rvl886c(SEQIDNO:270)、Rv2031c(SEQIDNO:284),Rv3616c(SEQIDNO:509)、Rv3804c(SEQIDNO:534)和Rv3874(SEQIDNO547)的序列所編碼。用于本文，名詞“免疫優(yōu)勢抗原”是指這樣的抗原，所述抗原在接觸該抗原的群體的至少20%、更典型的至少40%、最典型的至少70%中，引發(fā)在感染的至少一個階段產(chǎn)生一或多種類型的抗體(例如，IgG,IgA,IgE,IgM等)，或者，其中與同一病原體的其他抗原相比，患者在至少一個疾病階段產(chǎn)生的抗體的平均結(jié)合親和力和/或平均量至少在上半部分，更典型的在上三分位數(shù)(uppertertile)，最典型的在上四分位值(upperquarti1e)。最典型的，抗體的平均結(jié)合親和力和/或抗體的平均量反映在信號強(qiáng)度中，因此信號強(qiáng)度可以用作抗體的平均結(jié)合親和力和/或平均量的替代標(biāo)記物。其他方面中，優(yōu)選的免疫優(yōu)勢抗原特征還在于，與對照信號強(qiáng)度相比，免疫優(yōu)勢抗原處理組中的反應(yīng)被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)意義的顯著性，其中顯著性水平P優(yōu)選等于或小于0.1，更優(yōu)選等于或小于0.05，最優(yōu)選等于或小于0.01。發(fā)明主題的一個方面，免疫優(yōu)勢抗原是對先前接觸過病原體的血清群進(jìn)行蛋白組篩選鑒定到的。更優(yōu)選地，將血清群細(xì)分為若干個子群體以反映疾病的各種參數(shù)(如活動性疾病、疾病的細(xì)菌性負(fù)擔(dān)、潛伏性感染、合并感染HIV、沒有感染等)，然后可以與對鑒定到的抗原的抗體反應(yīng)建立聯(lián)系。進(jìn)一步優(yōu)選的，篩選還提供了關(guān)于抗原與群體/亞群血清的相對反應(yīng)性的數(shù)據(jù)。通常優(yōu)選獲得病原體的至少部分基因組，通過電腦模擬確定所有潛在的開放閱讀框及其部分。潛在基因一經(jīng)鑒定，確定合適的引物來提供整個開放閱讀框(ORF)的擴(kuò)增子或者不太優(yōu)選部分ORF的擴(kuò)增子，其中引物優(yōu)選設(shè)計(jì)成便于向表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行亞克隆。最優(yōu)選亞克隆以未純化的PCR混合物進(jìn)行基于重組酶的亞克隆，以避免克隆過程的偏向性，將這樣獲得的重組質(zhì)粒經(jīng)多克隆擴(kuò)增，即可保證擴(kuò)增子無偏向性的被表現(xiàn)。還有特別優(yōu)選的是然后將質(zhì)粒提取物進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄/翻譯反應(yīng)，從而提供重組ORF肽，然后將肽點(diǎn)樣到或以其他方式固定到合適的可尋址載體(例如膜、珠子等)上。應(yīng)當(dāng)意識到，這樣制備的蛋白質(zhì)組即可與血清進(jìn)行接觸，所述血清來自對照個體群和/或已知當(dāng)前或以前曾暴露于制備ORF的上述病原體的個體群。然后使用眾所周知的方法(例如，使用二抗)檢測與一或多個ORF結(jié)合的血清抗體。通過這種方式，可以快速評估病原體的整個蛋白質(zhì)組的免疫原性以及與血清中的抗體的潛在結(jié)合。國際專利公開WO06/088492中公開了各種優(yōu)選的方面、組合物、和蛋白質(zhì)組的制備方法，該申請通過引用并入本文。因此，除了各種其他優(yōu)勢，應(yīng)特別認(rèn)識到本文提出的組合物和方法使得能夠制備包含復(fù)數(shù)種抗原的疫苗和診斷組合物，所述抗原對病原體靶ORF具有已知的和預(yù)先確定的親和力。因?yàn)橐阎獋€體免疫系統(tǒng)在抗原識別方面表現(xiàn)出顯著的差別，本文考慮的方法和組合物能夠進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)支持的抗原鑒定從而確定患者群體中的免疫優(yōu)勢抗原。因此，多個目標(biāo)可用于引發(fā)免疫反應(yīng)和/或檢測以前的接觸，即使這些目標(biāo)中的一或多個對于檢測是模糊的或只給出微弱的反應(yīng)。對于本文鑒定到的免疫優(yōu)勢序列，還應(yīng)理解序列不必是完整的0RF，合適的序列也可以是包含至少部分抗原表位的部分序列(例如合成的、重組的或者分離的)。例如，設(shè)想的DNA序列包括那些與序列表中列出的相應(yīng)序列在嚴(yán)緊雜交條件下雜交的序列。因此，本文考慮的序列可能鑒定為編碼抗原肽(部分或完整0RF)的DNA序列，或者鑒定為肽序列(或同源序列)。類似地，化學(xué)修飾抗原，和/或本文提出的多肽的直系同源物也被認(rèn)為適用于本文。特別值得一提的是，雖然蛋白質(zhì)組篩選將提供復(fù)數(shù)種抗原作為可能用于診斷、疫苗接種、和/或治療的有用分子，這種方法只提供(多種)個體反應(yīng)的大概結(jié)果(rawcut)。因此，由于大多數(shù)個體對同一病原體的免疫反應(yīng)(例如，根據(jù)疾病的階段、以往的接觸，和/或個體間的差異)引發(fā)顯著不同的抗體譜，這種篩選得到的結(jié)果通常是不純一的。這樣必須考慮到個體免疫反應(yīng)的差異和陣列中重組蛋白量的差異來獲得有意義的結(jié)果。因此應(yīng)當(dāng)理解，對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾將產(chǎn)生抗原集合，所述抗原對感染了病原體的群體的血清有已量化并已知的相對反應(yīng)性。而且，應(yīng)該指出因?yàn)樾盘柨赡茉诟腥具^程中是特定階段特異性的，相對反應(yīng)性可能指示感染的時間進(jìn)程，和/或相對反應(yīng)性可能代表特定抗原免疫原性的強(qiáng)度差別(或篩選檢測中存在的抗原量)。此外，應(yīng)特別認(rèn)識到，根據(jù)對特定患者群體的選擇，測試血清將反映由一個或多個疾病參數(shù)表征的群體免疫狀況。例如，可能觀察到被感染或未被感染的群體、長期接觸或慢性感染的群體、自然恢復(fù)的群體、代表對特定藥物治療有反應(yīng)(或無反應(yīng))的群體、或?qū)Σ≡w有至少部分免疫力的群體。再有的考慮方面，免疫優(yōu)勢抗原是通過(優(yōu)選在明確界定的亞群中)挑選下述抗原鑒定的(a)在群體的至少40-50%中產(chǎn)生可測量的信號，和(b)有整體平均信號強(qiáng)度的至少40%的信號強(qiáng)度。然而，更優(yōu)選信號強(qiáng)度是至少高于整體平均信號強(qiáng)度，還要更優(yōu)選的是信號強(qiáng)度位于檢測中信號強(qiáng)度的上三分位數(shù)(四分位數(shù)或者甚至五分位數(shù))。因此，從另一個角度來看，免疫優(yōu)勢抗原最好是通過至少兩個系列的測試進(jìn)行比較挑選到的，其中一個系列的測試通常是亞群(例如，原發(fā)感染、活動性疾病、潛伏感染、恢復(fù)、以前患病、慢性等)，另一系列的測試是對照組(例如，其他亞群或?qū)φ战M)。還有，通常優(yōu)選系列測試還包括潛在免疫優(yōu)勢抗原與之進(jìn)行比較的陰性對照。因此，特別是對于本文提出的病原體，應(yīng)當(dāng)理解可以制備包含一或多種所選免疫優(yōu)勢抗原的組合物，所述組合物有統(tǒng)計(jì)學(xué)高概率能夠在較大患者群中引發(fā)或已經(jīng)引發(fā)免疫反應(yīng)。此外，對于抗原是從選定的亞群體(如活動性疾病、疾病的嚴(yán)重程度、潛伏感染、以前患病的患者、原發(fā)感染等)中確定的情況，抗原還與疾病參數(shù)有已知的關(guān)聯(lián)，從而能夠?qū)膊》制诤?或預(yù)測療效。而且，因?yàn)楸疚奶岢龅目乖敲庖邇?yōu)勢抗原，應(yīng)當(dāng)指出可以制備的疫苗組合物將有已知或者可預(yù)見的免疫原性。更具體地說，由SEQIDNO:1至SEQIDNO:586的核酸所編碼的來自結(jié)核分枝桿菌的抗原被鑒定為免疫優(yōu)勢抗原(見以下實(shí)施例)。對于SEQIDNO:1至SEQIDNO:586中每個序列的閱讀框，應(yīng)該指出的是，序列的第一個堿基或者是起始密碼子的第一個堿基，或者是通過本文提供的方法和組合物鑒定到的多肽的第一密碼子的第一個堿基。最典型的是，最后三個堿基代表終止密碼子，或者通過本文提供的方法和組合物鑒定的多肽的最后一個密碼子的最后一個堿基。在這些例子中，對每個抗原，尤其針對它們對病原體的個體和相對反應(yīng)性進(jìn)行了表征。最典型的，反應(yīng)性以免疫原性的強(qiáng)度來測量(例如，抗體的平均結(jié)合親和力和/或平均數(shù)量產(chǎn)生預(yù)先確定的信號強(qiáng)度(例如，位于上半部分、上三分位數(shù)、甚至上四分位數(shù)))。從不同角度來說，在以下描述的檢測中，每一個鑒定到的抗原相對鑒定到的另一個抗原具有已知的信號強(qiáng)度(反映患者體內(nèi)形成的抗體數(shù)量)。某些蛋白，比如圖5所示的那個蛋白，在TB樣品中表現(xiàn)出更高強(qiáng)度信號的尾分布，而非TB樣品中沒有。這兩個小提琴圖顯示了log10轉(zhuǎn)換的信號強(qiáng)度的分布，所述信號強(qiáng)度是給來自TB病例的血清vs.來自非TB病例的血清中的代表性蛋白測量的。以下描述的例子中鑒定到具有這種特征性分布的蛋白是通過執(zhí)行據(jù)其可以拒絕零假設(shè)的計(jì)算，即樣品文檔只包含與非TB強(qiáng)度分布一致的反應(yīng)性數(shù)值。此外，每一個鑒定到的抗原還通過與至少一個參數(shù)的關(guān)聯(lián)進(jìn)行了表征。大多數(shù)情況下，疾病參數(shù)是感染后的活動性疾病，進(jìn)一步的情況中，疾病參數(shù)是痰中的結(jié)核桿菌數(shù)量、或者疾病的放射照相學(xué)程度，在再進(jìn)一步的情況中，非患病人群中過去的病史。因此，應(yīng)當(dāng)尤其理解免疫優(yōu)勢抗原的鑒定不僅可以使得鑒定到用于診斷、疫苗開發(fā)和治療的統(tǒng)計(jì)學(xué)有意義的抗原，而且使得能夠開發(fā)疾病階段特異的工具來鑒定候選分子對診斷和/或治療進(jìn)行微調(diào)。例如，合適的診斷裝置尤其包括那些包含一或多種免疫優(yōu)勢抗原、或其片段或類似物的裝置，其中編碼所述抗原、或其片段或類似物的核酸是SEQIDNO:1至SEQIDNO586的序列，優(yōu)選Rv0798c(SEQIDNO121)、Rvl886c(SEQIDNO:270)、Rv2031c(SEQIDNO:284)、Rv3616c(SEQIDNO:509)、Rv3804c(SEQIDNO:534)、Rv3874(SEQIDNO:547)、Rv0302(SEQIDNO:52)、Rv0379(SEQIDNO:65)、Rv0394c(SEQIDNO:66)、Rv0456c(SEQIDNO:74)、Rv0632c(SEQIDNO:103)、Rv0944(SEQIDNO:142)、Rv0984(SEQIDNO:146)、Rvl030(SEQIDNO:153)、RvI196(SEQIDNO:174)、Rvl242(SEQIDNO:180)、Rv1284(SEQIDNO:187)、Rvl387(SEQIDNO:206)、Rvl837c(SEQIDNO:264)、Rvl926c(SEQIDNO:275)、Rvl980c(SEQIDNO:281)、Rv2094c(SEQIDNO:294)、Rv2544(SEQIDNO363),Rv2618(SEQIDNO:375)、Rv2746c(SEQIDNO:391),Rv2870c(SEQIDNO:407)、Rv2873(SEQIDNO:408)、Rv2875(SEQIDNO:409)、Rv3050c(SEQIDNO:434),Rv3248c(SEQIDNO:458)、Rv3376(SEQIDNO:478)、Rv3763(SEQIDNO:527)、Rv3810(SEQIDNO:536)、Rv3864(SEQIDNO:545)、Rv2252(SEQIDNO:323)、Rv2282c(SEQIDNO:569)、Rv0212c(SEQIDNO:557)、Rv3243c(SEQIDNO:456)、Rv3675(SEQIDNO:519)、Rv2984(SEQIDNO:423)、RvI175c(SEQIDNO:169),Rv3326(SEQIDNO:578),Rv3628(SEQIDNO:513)、Rv3775(SEQIDNO:584)、Rv3362c(SEQIDNO:475)、Rv0801(SEQIDNO:122)、Rvl629(SEQIDNO:566)、Rv0272c(SEQIDNO:558)、Rv3762c(SEQIDNO:583)、Rv3319(SEQIDNO:577)、Rv3495c(SEQIDNO:581)、Rv2151c(SEQIDNO:308)、Rv0227c(SEQIDNO:37)、Rv0280(SEQIDNO:50)、Rv0993(SEQIDNO:148)、Rvl306(SEQIDNO:192)、Rvl363c(SEQIDNO:204)、Rv2050(SEQIDNO:288)、Rv2116(SEQIDNO:299)、Rv3417c(SEQIDNO:486)、Rv3653(SEQIDNO:516)、Rvl253(SEQIDNO:182)、Rv3413c(SEQIDNO:485)、Rvl635c(SEQIDNO:232)、Rv3021c(SEQIDNO:432)、RvI193(SEQIDNO:173)、Rv2592c(SEQIDNO:369),Rv3620c(SEQIDNO:510),Rv0929(SEQIDNO139),Rv0959(SEQIDNO:145)、RvI162(SEQIDNO:166)、Rv2389c(SEQIDNO:341)、Rv2984(SEQIDNO:423)、Rv2588c(SEQIDNO:367)、Rv0171(SEQIDNO:26)、Rvl865c(SEQIDNO:267)、Rv2074(SEQIDNO:290)、Rv0543c(SEQIDNO:87)、Rvl677(SEQIDNO:237)、Rvl304(SEQIDNO:191)、Rv2841c(SEQIDNO:400)、Rv3680(SEQIDNO:520)、Rv0831c(SEQIDNO:125)、Rv2032(SEQIDNO:285)、Rv3127(SEQIDNO:446)、Rv3272(SEQIDNO:464)、Rv3323c(SEQIDNO:470)、Rv3508(SEQIDNO:494),Rv3628(SEQIDNO:513)、RvI173(SEQIDNO:167),Rv2623(SEQIDNO:376)、Rv0527(SEQIDNO:85)、Rvl620c(SEQIDNO:229)、Rvl901(SEQIDNO:272)、Rv2151c(SEQIDNO:308)、Rv0362(SEQIDNO:60)、Rv3129(SEQIDNO:447)、Rv3140(SEQIDNO:449)、Rv0340(SEQIDNO:56)、Rv2792c(SEQIDNO:395)、Rv3003c(SEQIDNO:426)、Rv3019c(SEQIDNO:431)、Rv3862c(SEQIDNO544)、Rv0572c(SEQIDNO:91)、Rv2477c(SEQIDNO:356),Rv2659c(SEQIDNO:379)、Rv0311(SEQIDNO:54)、Rv0350(SEQIDNO:57)、Rv2127(SEQIDNO:301)、Rv3875(SEQIDNO:548)、Rv0877(SEQIDNO:134)、Rvl916(SEQIDNO:274)、Rv2138(SEQIDNO:303)、Rv2847c(SEQIDNO:403)、Rv3118(SEQIDNO:444)、Rv2495c(SEQIDNO:358)、Rv3669(SEQIDNO:517)、Rv0281(SEQIDNO:51)、Rv2711(SEQIDNO:383)、Rv2744c(SEQIDNO:390)、Rv3803c(SEQIDNO:533)、Rvl239c(SEQIDNO:179)、Rv2147c(SEQIDNO:307)、Rv2253(SEQIDNO:324)、Rv0308(SEQIDNO:53)、Rv0587(SEQIDNO:95)、Rvl564c(SEQIDNO:224)、Rv2185c(SEQIDNO:313)、Rvl805c(SEQIDNO:261)、Rv2729c(SEQIDNO:386)、Rv3386(SEQIDNO:481)、Rv3515c(SEQIDNO:497)、Rv0772(SEQIDNO:116)、Rv2948c(SEQIDNO:420)、Rv0006(SEQIDNO1),Rvl906c(SEQIDNO:273)、Rv2244(SEQIDNO:322)、Rv2468c(SEQIDNO:354)、Rv3701c(SEQIDNO:522)、Rv0054(SEQIDNO:6)、Rvl945(SEQIDNO:277)、Rv3345c(SEQIDNO:472)、Rv0276(SEQIDNO:48)、Rv0709(SEQIDNO:108)、Rvl527c(SEQIDNO:220)、Rv2048c(SEQIDNO:287)、Rv2414c(SEQIDNO345)、Rv3524(SEQIDNO:499)、Rv3556c(SEQIDNO:502)、Rvl322(SEQIDNO:196)、Rv2934(SEQIDNO:417)、Rv0270(SEQIDNO:47)、Rv0612(SEQIDNO:99)、Rvl699(SEQIDNO:242)、Rv2728c(SEQIDNO:385)、Rv3017c(SEQIDNO:430)、Rv3364c(SEQIDNO:476)、Rv3418c(SEQIDNO:487)、Rv3718c(SEQIDNO:525)、Rv0426c(SEQIDNO:70)、RvI181(SEQIDNO:171)、Rvl725c(SEQIDNO:250)、Rv0256c(SEQIDNO:44)、Rv0605(SEQIDNO:98)、Rv0737(SEQIDNO:114)、Rv0834c(SEQIDNO126),Rvl255c(SEQIDNO:184)、Rv2224c(SEQIDNO:320)、RvI843c(SEQIDNO:265)、Rv2333c(SEQIDNO334)、Rv2490c(SEQIDNO:357)、Rv3183(SEQIDNO:454)、Rv0668(SEQIDNO:106)、Rvl556(SEQIDNO:223)、Rvl673c(SEQIDNO:236)、Rv3513c(SEQIDNO:496)、Rv3675(SEQIDNO:519)、Rv3870(SEQIDNO:546)、Rv3891c(SEQIDNO:552)、Rv0163(SEQIDNO:24)、Rv0710(SEQIDNO:109)、Rvl297(SEQIDNO:189)、Rvl745c(SEQIDNO:255)、Rv0600c(SEQIDNO:97)、Rvl536(SEQIDNO:222)、Rvl738(SEQIDNO:254)、Rv2524c(SEQIDNO:359),Rv3086(SEQIDNO:440)、Rv3367(SEQIDNO:477)、Rv0135c(SEQIDNO:20)、Rv0627(SEQIDNO:101)、Rvl448c(SEQIDNO:213)、Rv3224a(SEQIDNO:455)、Rv0029(SEQIDNO:2)、Rv0846c(SEQIDNO:129)、RvI159(SEQIDNO:165)、RvI186c(SEQIDNO:172)、Rvl705c(SEQIDNO:243)、Rvl713(SEQIDNO:248)、Rv2476c(SEQIDNO:355)、Rv3402c(SEQIDNO:483)、Rv2615c(SEQIDNO:374),Rv2995c(SEQIDNO:425)、Rv3788(SEQIDNO:585)、Rv0140(SEQIDNO:555)、Rv0203(SEQIDNO:33)、Rvl531(SEQIDNO:565)、Rvl693(SEQIDNO:241)、Rvl882c(SEQIDNO:269)、Rv2143(SEQIDNO:568)、Rv2367c(SEQIDNO:570)、Rv0584(SEQIDNO:94)、Rvl651c(SEQIDNO:567)、Rv3197a(SEQIDNO:576)、Rv3369(SEQIDNO:579)、Rv3825c(SEQIDNO:586),RvOlOl(SEQIDN0:15)、Rv0808(SEQIDNO:123)、Rv0814c(SEQIDNO:560)、Rv2153c(SEQIDNO:309)、Rv2933(SEQIDNO:416)、Rv0071(SEQIDNO:9)、Rv2471(SEQIDNO:571),Rv2979c(SEQIDNO:575)、Rv0155(SEQIDNO:556)、Rv0581(SEQIDNO:559)、Rv2631(SEQIDNO:377)，Rv3455c(SEQIDNO:489)、Rv3601c(SEQIDNO:505)、Rv0896(SEQIDNO:562)、Rvl641(SEQIDNO234),Rv3005c(SEQIDNO:427)、Rv3759c(SEQIDNO:582)、Rv3800c(SEQIDNO:532)、Rv0187(SEQIDNO:30)、Rv2379c(SEQIDNO:338)、Rv2434c(SEQIDNO:352)、Rv2940c(SEQIDNO:574)、Rv3477(SEQIDNO:580)、Rv0435c(SEQIDNO:72)、Rv0844c(SEQIDNO128)、Rv0856(SEQIDNO:561)、RvI191(SEQIDNO:564)、Rv2803(SEQIDNO:397)、Rv0783c(SEQIDNO:118)、Rvl054(SEQIDNO:563)、Rvl689(SEQIDNO:240)、Rv2539c(SEQIDNO:572),Rv2859c(SEQIDNO:573)、Rv3777(SEQIDNO:528)根據(jù)具體的裝置形式，所述裝置抗原可以只含有可用于以自動化方式或通過視覺觀察而檢測來自血液、血漿或血清或其他含有抗體的體液中的抗體的結(jié)合的單一免疫優(yōu)勢抗原、片段或類似物。例如，在采用單一免疫優(yōu)勢抗原的情況中，合適的裝置可能處于試紙條或競爭性ELISA的形式。另一方面，采用多種免疫優(yōu)勢抗原的情況中，合適的裝置可能處于可以通過自動化設(shè)備(例如，通過掃描儀)或者目測方式(例如，形成染料的比色反應(yīng))來讀取的陣列的形式。最典型的，在這類裝置中，復(fù)數(shù)個抗原以空間可尋址方式布置(例如，x_y矩陣或與顏色關(guān)聯(lián)的柱子或者微量滴定板)。此外，應(yīng)當(dāng)指出的是本文考慮的診斷裝置可能基于許多已知的檢測方式，包括ELISA(夾心或不夾心的)、競爭性ELISA、抗獨(dú)特型抗體等，其中所有已知的色度和光度(例如，熒光、發(fā)光等)或放射反應(yīng)被認(rèn)為是適合使用的。在最典型的裝置中，單一(或多個)病原體和/或血清型的復(fù)數(shù)種免疫優(yōu)勢抗原被布置在固體表面上或者可尋址的固相上，與血液、血清、血漿或其他含有抗體的體液進(jìn)行接觸。因此，這樣制備的組合物可以應(yīng)用在識別和/或表征個體對選定抗原的免疫反應(yīng)，并且任選用于評估免疫反應(yīng)類型(例如，識別潛伏感染或慢性感染)以及疾病的進(jìn)展、治療療效等。最典型的，復(fù)數(shù)個抗原包括5至10個抗原，但也考慮明顯更高數(shù)量的抗原，包括病原體蛋白組的至少25%、通常至少50%、更典型的至少75%、最典型的至少90%。類似地，少于5個抗原(1-4)也被認(rèn)為是合適的。在發(fā)明主題的其他典型方面，考慮的陣列最優(yōu)選在微流體設(shè)備中處理。例如，這類裝置中抗原陣列被點(diǎn)在膜或其它材料(如不到1平方厘米的覆蓋硝酸纖維的載體)上，然后被放置在帶有樣品/試劑進(jìn)口和出口的微流體設(shè)備中。根據(jù)具體的配置，可以使用光學(xué)方法(例如CCD微陣列、平板掃描儀等)、電子方法(例如，伏安法或安培法)或其他本領(lǐng)域已知方法來獲取信號。替代地，目測或使用1200dpi分辨率的常規(guī)平板掃描儀和/或熒光檢測也被認(rèn)為是合適的。另一個例子中，符合發(fā)明主題的免疫優(yōu)勢抗原也可用于制備抗體制品，制品可以作為被動免疫接種用于結(jié)核病的治療。在優(yōu)選實(shí)施方案中，這種疫苗是亞基疫苗或減毒活重組疫苗。例如，本文提出的免疫優(yōu)勢抗原可應(yīng)用于制造疫苗，所述疫苗包含至少一個，更典型的是至少兩個由SEQIDNO:1至SEQIDNO:586的核酸編碼的免疫優(yōu)勢抗原。但是更優(yōu)選的設(shè)想疫苗包含二至五個，或至少六個，甚至更多抗原，其中至少有一個抗原是免疫優(yōu)勢抗原。這種疫苗組合物可用于引發(fā)對單個或多個亞型的免疫，因此可能包含不同的優(yōu)選來自多個不同亞型的免疫優(yōu)勢抗原。此外，應(yīng)該理解，可能生產(chǎn)主要甚至完全包含單一參數(shù)的免疫優(yōu)勢抗原。例如，疫苗可能包含潛伏性感染群體所特有的免疫優(yōu)勢抗原。不太優(yōu)選的方面，SEQIDNO:1至SEQIDNO:586的序列也可以作為DNA疫苗，或者作為體內(nèi)表達(dá)系統(tǒng)的一部分來觸發(fā)對體內(nèi)產(chǎn)生的重組抗原或其片段的免疫反應(yīng)。此外，考慮了本文鑒定的抗原也可能用于產(chǎn)生(單克隆或多克隆)抗體或其片段(例如，F(xiàn)ab、scFv等)，而所述抗體或其片段則可以用于直接檢測患者血液、血液衍生物或其他體液中存在處于患者循環(huán)系統(tǒng)的抗原的診斷檢驗(yàn)。當(dāng)然，應(yīng)當(dāng)理解，抗原可能與病原體聯(lián)系在一起、與病原體成分聯(lián)系在一起、游離形式、或者與患者的分子或細(xì)胞結(jié)合地循環(huán)。最優(yōu)選地，抗原是如本文描述的免疫優(yōu)勢和/或血清診斷抗原。例如，合適的測試包括那些利用一或多種標(biāo)記抗體來檢測體液中存在抗原的測試，其中抗原可以被(特異地或與其他蛋白一起)留在表面上。本領(lǐng)域已知有許多抗原檢測方法，所有這些已知形式均被認(rèn)為適用于本文。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的診斷工具涉及在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中確定從淋巴細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子(比如干擾素Y)從而識別本文描述的免疫優(yōu)勢抗原，所述淋巴細(xì)胞取自當(dāng)前或以前感染了毒性分枝桿菌的受試對象。對于疫苗的合適配制方法，應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到所有已知的生產(chǎn)這類疫苗的方式都被認(rèn)為適合用于本文，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠很容易地生產(chǎn)此種疫苗，而無需過多試驗(yàn)(參見例如，“VaccineAdjuvantsandDeliverySystems"byManmohanSingh；Wiley-Interscience(June29，2007)，ISBN:0471739073；或者‘’VaccineProtocols"(MethodsinMolecularMedicine)byAndrewRobinson,MartinP.Cranage,andMichaelJ.Hudson；HumanaPress；2edition(August27,2003)；ISBN:1588291405)。因此，合適的疫苗可以配制成注射液、或懸浮液、鼻內(nèi)制劑、透皮或口服制劑。本文描述的組合物、疫苗、診斷測試等等可以用于人用和獸用。實(shí)施例結(jié)核分枝桿菌蛋白質(zhì)組微陣列的微陣列制造和探測方法蛋白質(zhì)組微陣列按照以前的描述(ProcNatlAcadSciUSA102(3):547-552；Proteomics7(10):1678-1686；Proteomics7(13):2172-2183)經(jīng)過改動而制作。這和本文討論的所有其他外在材料通過引用全文并入本文。凡所述并入?yún)⒖嘉墨I(xiàn)中的定義或名詞的用法與本文提供的該名詞的定義不一致或相沖突的情況，適用本文提供的名詞定義，而參考文獻(xiàn)中的名詞定義不適用。結(jié)核分枝桿菌ORFeome的高通量構(gòu)建使用現(xiàn)有的結(jié)核分枝桿菌序列數(shù)據(jù)為在基因組中編碼的所有ORF設(shè)計(jì)引物對。使用PCR產(chǎn)物的凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)量控制。經(jīng)過3輪PCR，最后結(jié)果(finaltally)是97.3%被成功擴(kuò)增。為了克隆，將PCR產(chǎn)物與線性的基于PXT7的表達(dá)載體如前面所述進(jìn)行混合，并轉(zhuǎn)化至高感受態(tài)的DH5α細(xì)胞中。轉(zhuǎn)化細(xì)胞在37°C劇烈通氣進(jìn)行培養(yǎng)，第二天檢查渾濁度。過夜培養(yǎng)物不先經(jīng)菌落挑選，用購自Qiagen的QIApr印96TurboMinipr印試劑盒從中純化DNA純化。在3998個被成功擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物中，3858個被克隆到pXi載體(96.5%的成功率)中。對隨機(jī)抽樣的1064個克隆經(jīng)“QC-PCR”測試，其中再次使用序列特異性引物來驗(yàn)證被克隆的插入片段是預(yù)期大小。利用該技術(shù)證實(shí)了其中的1007個(94.6%)0更具體地說，設(shè)計(jì)了4109個引物對來擴(kuò)增結(jié)核分枝桿菌基因組(Tuberculist(http://genolist.pasteur.fr/TubercuList/)中有注釋)中的每一個0RF(H37Rv株)。包含20bp基因特異性序列與33bp“接頭”序列的定制PCR引物用于PCR，以基因組DNA作為模板。對于>3KB的基因，設(shè)計(jì)額外的引物對來擴(kuò)增每3KB的重疊片段。用于這項(xiàng)工作的所有引物公布在UCIInstituteforGenomicsandBioinformatics(IGB)WN^http://contactl4.ics.uciedu/virus/tuber_index.php。端的接頭序列與線性T7表達(dá)載體pXT7的克隆位點(diǎn)同源，使得PCR產(chǎn)物能夠在感受態(tài)DH5α細(xì)胞中通過體內(nèi)同源重組被克隆。由此產(chǎn)生的蛋白質(zhì)結(jié)合了ATG翻譯起始密碼子、5'多聚組氨酸表位、3'流感血凝素抗原表位和Τ7終止子。陣列的制作抗每個蛋白中經(jīng)工程化帶有的N-末端多聚His和C-末端HA標(biāo)簽的抗體用于監(jiān)測每個點(diǎn)上的表達(dá)。每個陣列中建立陽性和陰性對照，陣列上剩余的點(diǎn)是體外轉(zhuǎn)錄/翻譯反應(yīng)，這些反應(yīng)表達(dá)代表全部克隆ORFeome的4109個不同結(jié)核分枝桿菌克隆。待RTS反應(yīng)被點(diǎn)到硝酸纖維素上并干燥后，在保干器中于18°C儲存6個月后未觀察到可察覺的降解(數(shù)據(jù)未顯示)。但是，在5小時體外蛋白表達(dá)結(jié)束后，觀察到了與點(diǎn)樣延遲相關(guān)聯(lián)的信號下降和信噪比降低。為了使這種下降最小化，體外表達(dá)反應(yīng)交替通過點(diǎn)樣步驟.因此，通常優(yōu)選反應(yīng)在點(diǎn)樣前不超過5小時、更優(yōu)選不超過3小時、最優(yōu)選不超過1小時舊。用陽性和陰性對照如下所述將信號的其余方差歸一化。微陣列以50-100個雙板塊基片(即，100-200個陣列)成批制作。高于陰性對照強(qiáng)度平均值兩個標(biāo)準(zhǔn)差作為標(biāo)簽檢測的分界點(diǎn)。總體上，3邪4個(96.4%)表達(dá)蛋白對HIS標(biāo)簽是陽性的，3730個(93.3%)對HA標(biāo)簽是陽性的，3538個(91%)對兩個標(biāo)簽都是陽性，只有56個(1.4%)對兩個標(biāo)簽都是陰性，這意味著98.6%的表達(dá)蛋白對至少一個標(biāo)簽是陽性的。更詳細(xì)地說，4109個(3998個全長ORFs加上111個>3kb的ORF區(qū)段)克隆的純化小份DNA抽提在購自Roche的基于大腸桿菌的體外轉(zhuǎn)錄/翻譯表達(dá)系統(tǒng)(RTS-100)中進(jìn)行表達(dá)。在封閉的384孔板中準(zhǔn)備10μ1的體外反應(yīng)，于30°C在平臺微型振蕩器中300RPM溫育5小時。然后加入終濃度0.05%的Tween-20和蛋白酶抑制劑混合液(Complete，Roche)的混合物。為了減少蛋白表達(dá)后點(diǎn)樣延遲時間，交替開始RTS反應(yīng)。RTS反應(yīng)不經(jīng)純化用OmniGridlOO微陣列點(diǎn)樣儀(GenomicSolutions)以單樣品按虹4亞陣列的形式點(diǎn)樣在雙板塊包被硝酸纖維素的FASTslides(Whatman)上，每個亞陣列包含17x17個點(diǎn)。每個亞陣列包括6個陰性對照點(diǎn)，即含有缺少DNA模板的模擬RTS反應(yīng)。每個亞陣列包括小鼠、大鼠和人完整IgG的5個梯度稀釋作為陽性對照點(diǎn)。這些陽性和陰性對照一起用于給來自不同陣列的數(shù)據(jù)歸一化(見下文)。還包括的是純化重組Epstein-Ban·病毒核抗原-I(EBNA-I)的4個梯度稀釋，該抗原被大多數(shù)人識別，可以作為血清質(zhì)量的有用指示。還點(diǎn)樣的是三個重組結(jié)核分枝桿菌蛋白38KDa(Rv0934)、CFP-10(Rv3874(SEQIDNO:547))和ESAT-6(Rv3875(SEQIDNO:548))。此外，購自Invitrogen(CarlsbadCA)的重組血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的6個梯度稀釋點(diǎn)樣，通過在某些血清樣品中“偷偷加入”單克隆抗VEGF和抗TNF-α抗體，上述點(diǎn)樣可作為雜交對照。為了用血清進(jìn)行檢測，將血清在LowCrossDilutionBuffer(CandorBioscience)中1/200稀釋，所述稀釋緩沖液含有終濃度4_5mg/ml蛋白質(zhì)的大腸桿菌裂解物。稀釋液于室溫保溫30分鐘并不斷混勻以阻止抗大腸桿菌的抗體。陣列在封閉緩沖液(CandorBioscience)中重新水合30分鐘，用預(yù)先處理過的血清于4°C不斷攪拌地過夜探測。然后將基片在含有0.05%(v/v)Tween20，(T-TBS)的三羥甲基氨基甲烷(Tris)-緩沖鹽中洗5次，溫育在用稀釋緩沖液1/400稀釋過的生物素化抗人Fc(JacksonImmunoResearch)中。在T-TBS中將每個基片清洗3次后，通過與偶聯(lián)鏈霉親和素的SureLightP-3(ColumbiaBiosciences)溫育使結(jié)合的抗體可見。然后將基片各在T-TBS中然后在TBS中洗3次，在經(jīng)短暫離心干燥前插入蒸餾水。通過以單克隆抗多聚組氨酸(cloneHis-1,Sigma)和抗血凝素(clone3F10,Roche)進(jìn)行探測，分別使用生物素化的抗小鼠和抗大鼠二抗，然后是偶聯(lián)鏈霉親和素的SureLightP-3，從而監(jiān)測點(diǎn)樣陣列上的蛋白表達(dá)。人血清血清獲得自全球幾個TB流行區(qū)的臨床點(diǎn)的927名患者，使用類似群體設(shè)計(jì)(cohortsdesign)包括了有提示TB的呼吸系統(tǒng)癥狀的個體(TB懷疑者)?；顒有訲B的診斷是根據(jù)患者痰中有結(jié)核分枝桿菌生長作出的(培養(yǎng)物證實(shí)的活動性TB)(n=403)。非TB疾病的診斷是根據(jù)完整微生物學(xué)和X光胸透研究作出的(n=418)。包括在非TB病例中的是未根據(jù)經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行TB治療的那些和接受了足夠的通過癥狀篩選(有時包括CXR)進(jìn)行的后續(xù)檢查來排除TB的那些患者。有時不清楚BCG接種狀態(tài)，但群體都來自出生時全民接種BCG的國家。對于數(shù)據(jù)分析，活動性TB病例劃分為涂片陽性TB(痰中存在結(jié)核分枝桿菌)和涂片陰性活動性TB。TB和非TB疾病組的病例還根據(jù)HIV合并癥進(jìn)行了再次劃分。陰性對照血清(n=42)從非流行區(qū)國家(意大利)的健康無癥狀個體獲得，所述個體通過結(jié)核菌素皮試、Quantiferon檢驗(yàn)和結(jié)核病ELISP0T(T-spot)檢驗(yàn)證實(shí)是潛伏TB感染(LTBI)陰性的。后一組供體的BCG接種狀態(tài)未知，但一般來說流行區(qū)國家的個體接種，而非流行區(qū)國家的個體不接種。數(shù)據(jù)獲取用GenePixAutoloader4200AL微陣列共聚焦激光掃描儀(MolecularDevices)對基片進(jìn)行掃描。利用GenePixPro6.0軟件(MolecularDevices)由被探測陣列的掃描tiff圖像文件量化樣品點(diǎn)的像素強(qiáng)度中值。通過蛋白組學(xué)特征和功能對免疫反應(yīng)性抗原進(jìn)行分類按照TubercuList上注釋的功能分類代碼將抗原分類，還利用SignalPCJMoIBiol340(4):783-795)和PSORTb(Bioinformatics21(5):617-623)(http://db.psort.org)講行了計(jì)算預(yù)測來分別預(yù)計(jì)信號肽的存在概率和細(xì)胞定位。篩選蛋白組中的血清診斷抗原用每組血清探測過的代表性陣列如圖IA和IB所示。圖板(A)顯示培養(yǎng)物證實(shí)的TB陽性個體，圖板(B)顯示潛伏性TB感染的陰性對照個體。每個陣列都含有陽性和陰性對照點(diǎn)。IgG對照點(diǎn)(用于二抗的對照)在兩個陣列中都是陽性的。兩組個體都不對陰性(無DNA)對照反應(yīng)發(fā)生反應(yīng)。兩組個體都對EBNA-I有反應(yīng)，表明以前接觸過EBV，急性感染的個體組對多個結(jié)核分枝桿菌抗原有強(qiáng)烈的抗體反應(yīng)。對陣列的一個評估是通過計(jì)算高于對照(無DNA)信號的平均+2SD(“沒有DNA”)的臨界值進(jìn)行的。按這個標(biāo)準(zhǔn)，可以注意到來自TB陽性和對照個體的血清均對陣列上的抗原有反應(yīng)。然而，即使通過目測也很明顯，TB證實(shí)患者比對照對抗原的反應(yīng)更為激烈并且抗更多抗原。為了確認(rèn)看到的結(jié)核分枝桿菌抗原信號是否是未能成功封閉的大腸桿菌的特異性抗體，大腸桿菌裂解物的濃度。但是，這對信號沒有影響(數(shù)據(jù)未顯示)。還包括了由結(jié)核分枝桿菌制備的裂解物，結(jié)果完全消除了陣列上的所有信號(數(shù)據(jù)未顯示)，這表明陣列上看到的信號是由于血清中的結(jié)核分枝桿菌特異性抗體。蛋白微陣列數(shù)據(jù)分析微陣列數(shù)據(jù)通過四種方法進(jìn)行了分析，總結(jié)如下。Log10轉(zhuǎn)換的數(shù)據(jù)用于前三種方法，VSN-歸一化的數(shù)據(jù)用于第四種方法。圖4A顯示TB病例(n=400)和非TB病例(η=418)之間的比較中，三種分析方法(隨機(jī)森林、CERNO和CERNO預(yù)過濾數(shù)據(jù)的隨機(jī)森林)的至少一種方法中蛋白排名<10。每個方法中蛋白的相對排名(最大排名-4000)如圖示。Ν/Α(不存在)，表明蛋白被CERNO預(yù)過濾(過濾的ρ值>0.005)。圖4Β顯示圖4Α相同的內(nèi)容，但是僅有HIV陰性人員中的TB病例(n=255)與非TB病例(n=307)的比較。1.TB和非TB樣品通過隨機(jī)森林，一種基于多個分類樹的分類方法來進(jìn)行分類。隨機(jī)森林查詢(TB對非TB病例的比較)是對從來自流行區(qū)國家的血清收集到的數(shù)據(jù)，和根據(jù)HIV狀態(tài)和TB患者的涂片狀態(tài)分層的數(shù)據(jù)進(jìn)行的。根據(jù)具體查詢的精確性輸出的平均下降將抗原從最能提供信息到最不能提供信息排名(最高的精確性平均下降對應(yīng)最高排名)。用CERNO統(tǒng)計(jì)計(jì)算經(jīng)過或者不經(jīng)過預(yù)過濾步驟進(jìn)行隨機(jī)森林分析。2.CERNOρ值提供了高相對強(qiáng)度與活動性結(jié)核病診斷之間的關(guān)聯(lián)?？乖凑罩饾u下降的P值排名。3.還通過以下順序計(jì)算，對數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析以便鑒定相對非TB疾病樣品，在TB樣品中顯示出異常高的結(jié)合的抗原(i)來自流行病區(qū)的非TB樣品中的每個抗原的平均值和方差；(ii)一個比較(來自流行病國家的TBvs非TB疾病)中每個樣品的每個抗原的Z得分(非TB疾病類別中的抗原與均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差數(shù))；(iii)Z得分對應(yīng)的ρ值(該值以上的預(yù)期正態(tài)分布尾區(qū))；(iv)每個文檔調(diào)整后的P-值(BenjaminiHochberg)；(ν)在0.01的P調(diào)整水平(百分之一的假發(fā)現(xiàn)率)的反應(yīng)性vs無反應(yīng)性?？乖凑誘B組中反應(yīng)性調(diào)用的數(shù)量排名。4.為了穩(wěn)定原始數(shù)據(jù)的方差，使用了變種的log轉(zhuǎn)換(asinh)(Bioinformatics20(5):660-667)，利用Bioconductorsuite(http//Bioconductor.org/)中R的“VSN”軟件包，陰性和陽性對照點(diǎn)(分別是“無DNA”和IgG點(diǎn))被用來對數(shù)據(jù)歸一化。利用由Cyber-T改進(jìn)的用于蛋白組陣列的Bayes調(diào)節(jié)性t-檢驗(yàn)(Bioinformatics17(6):509-519JBiolChem276(23):19937-19944；Bioinformatics22(14):1760-1766；Bioinformatics23(13):1508-518)，通過比較證實(shí)的TB陽性組和LTBI-陰性對照組的信號，得到歸一化后數(shù)據(jù)的P值。為了判斷多重檢驗(yàn)條件，計(jì)算了BenjaminiHochbergρ值調(diào)整。分別具有BenjaminiHochberg校正ρ值<0.05或>0.05，并且平均信號強(qiáng)度超過涂片陽性樣品上陰性對照點(diǎn)(無DNA)均值2個標(biāo)準(zhǔn)差的反應(yīng)性抗原被定義為血清診斷的或交叉反應(yīng)的。利用SupportVectorMachines(SVMs)建立了多個抗原分類器。R中的〃el071〃和〃R0CR"包分別被用于訓(xùn)練SVMs，和生成接受器操作特性(receiveroperatingcharacteristic,ROC)曲線。對于其他圖示，比如熱圖和直方圖，歸一化數(shù)據(jù)被重新轉(zhuǎn)換為大概的原始數(shù)值。利用上述方法，通過結(jié)合對所有TB和非TB疾病患者、所有HIV陰性TB和非TB疾病患者進(jìn)行的查詢的隨機(jī)森林(RF)和CERNO中前50排名，加上對HIV陽性TB和非TB疾病查詢的前10排名，加上TB類別中反應(yīng)性調(diào)用>3，加上BenjaminiHochberg調(diào)整的CyberTρ值<0.05，總共挑選到250個抗原。根據(jù)這些方法的協(xié)議，將7組抗原評定優(yōu)先級，其中第一組的抗原最優(yōu)選。最優(yōu)選的抗原編碼序列通過RF或CERN0(p<0.005)加上反應(yīng)性調(diào)用，RF(<10)和CERNO(ρ<0.005)，以及BenjaminiHochberg調(diào)整的CyberTρ值<0.05表征Rv0798c(SEQIDNO121)、Rvl886c(SEQIDNO:270)、Rv2031c(SEQIDNO284),Rv3616c(SEQIDNO:509)、Rv3804c(SEQIDNO:534)、Rv3874(SEQIDNO:547)。以下抗原產(chǎn)生序列被確定為第二最優(yōu)選，通過RF或CERNO(ρ<0.005)加上反應(yīng)性調(diào)用，RF(<10)和CERNO(ρ<0.005)表征Rv0302(SEQIDNO:52)、Rv0379(SEQIDNO65)、Rv0394c(SEQIDNO:66)、Rv0456c(SEQIDNO:74)、Rv0632c(SEQIDNO:103)、Rv0944(SEQIDNO:142)、Rv0984(SEQIDNO:146)、Rvl030(SEQIDNO:153),RvI196(SEQIDNO:174)、Rvl242(SEQIDNO:180),Rvl284(SEQIDNO:187)、Rvl387(SEQIDNO:206)、RvI837c(SEQIDNO:264),Rvl926c(SEQIDNO:275)、Rvl980c(SEQIDNO:281)、Rv2094c(SEQIDNO:294)、Rv2544(SEQIDNO:363)、Rv2618(SEQIDNO:375)、Rv2746c(SEQIDNO:391)、Rv2870c(SEQIDNO:407)、Rv2873(SEQIDNO:408)、Rv2875(SEQIDNO:409)、Rv3050c(SEQIDNO:434)、Rv3248c(SEQIDNO:458)、Rv3376(SEQIDNO:478)、Rv3763(SEQIDNO:527)、Rv3810(SEQIDNO:536)、Rv3864(SEQIDNO:545)。以下抗原產(chǎn)生序列被確定為第三最優(yōu)選的，通過BenjaminiHochberg調(diào)整的CyberTρ值<0.05表征Rv2252(SEQIDNO:323)、Rv2282c(SEQIDNO:569)、Rv0212c(SEQIDNO:557)、Rv3243c(SEQIDNO:456)、Rv3675(SEQIDNO:519)、Rv2984(SEQIDNO:423)、RvI175c(SEQIDNO:169)、Rv3326(SEQIDNO:578)、Rv3628(SEQIDNO:513)、Rv3775(SEQIDNO:584)、Rv3362c(SEQIDNO:475)、Rv0801(SEQIDNO:122)、Rvl629(SEQIDNO:566)、Rv0272c(SEQIDNO:558)、Rv3762c(SEQIDNO:583)、Rv3319(SEQIDNO:577)、Rv3495c(SEQIDNO:581)、Rv2151c(SEQIDNO:308)。以下抗原產(chǎn)生序列被確定為第四最優(yōu)選的，通過反應(yīng)性調(diào)用表征Rv0227c(SEQIDNO37)、Rv0280(SEQIDNO:50)、Rv0993(SEQIDNO:148)、Rvl306(SEQIDNO:192)、Rvl363c(SEQIDNO:204)、Rv2050(SEQIDNO:288)、Rv2116(SEQIDNO:299)、Rv3417c(SEQIDNO:486)、Rv3653(SEQIDNO:516)。以下抗原產(chǎn)生序列被確定為第五最優(yōu)選的，通過CERNO或RF排名<10表征Rvl253(SEQIDNO182)、Rv3413c(SEQIDNO:485)、Rvl635c(SEQIDNO:232)、Rv3021c(SEQIDNO:432)、RvI193(SEQIDNO:173)、Rv2592c(SEQIDNO:369)、Rv3620c(SEQIDNO:510)、Rv0929(SEQIDNO:139)、Rv0959(SEQIDNO:145),RvI162(SEQIDNO:166)、Rv2389c(SEQIDNO:341)、Rv2984(SEQIDNO:423)、Rv2588c(SEQIDNO367)、Rv0171(SEQIDNO:26)、RvI865c(SEQIDNO:267)、Rv2074(SEQIDNO:290)。以下抗原產(chǎn)生序列被確定為第六最優(yōu)選的，通過CERNO或RF排名<25表征Rv0543c(SEQIDNO:87)、Rvl677(SEQIDNO:237)、Rvl304(SEQIDNO:191)、Rv2841c(SEQIDNO:400),Rv3680(SEQIDNO:520)、Rv0831c(SEQIDNO:125)、Rv2032(SEQIDNO:285)、Rv3127(SEQIDNO:446)，Rv3272(SEQIDNO:464)、Rv3323c(SEQIDNO:470)、Rv3508(SEQIDNO:494),Rv3628(SEQIDNO:513)，RvI173(SEQIDNO:167),Rv2623(SEQIDNO:376)、Rv0527(SEQIDNO:85)、Rvl620c(SEQIDNO:229)，Rvl901(SEQIDNO:272)、Rv2151c(SEQIDNO:308)、Rv0362(SEQIDNO:60)、Rv3129(SEQIDNO:447)，Rv3140(SEQIDNO:449)、Rv0340(SEQIDNO:56)、Rv2792c(SEQIDNO:395)、Rv3003c(SEQIDNO:426)、Rv3019c(SEQIDNO:431)、Rv3862c(SEQIDNO:544)、Rv0572c(SEQIDNO:91)、Rv2477c(SEQIDNO:356),Rv2659c(SEQIDNO:379)、Rv0311(SEQIDNO:54)、Rv0350(SEQIDNO:57)、Rv2127(SEQIDNO:301)、Rv3875(SEQIDNO:548)、Rv0877(SEQIDNO:134)、Rvl916(SEQIDNO:274)、Rv2138(SEQIDNO:303)、Rv2847c(SEQIDNO:403)、Rv3118(SEQIDNO:444)、Rv2495c(SEQIDNO:358)、Rv3669(SEQIDNO:517)、Rv0281(SEQIDNO51)、Rv2711(SEQIDNO:383)、Rv2744c(SEQIDNO:390)、Rv3803c(SEQIDNO:533)、Rvl239c(SEQIDNO:179)、Rv2147c(SEQIDNO:307)、Rv2253(SEQIDNO:324)、Rv0308(SEQIDNO:53)、Rv0587(SEQIDNO:95)、Rvl564c(SEQIDNO:224)、Rv2185c(SEQIDNO:313)。以下抗原產(chǎn)生序列被確定為第七最優(yōu)選的，通過CERNO或RF排名在沈到50之間表征RvI805c(SEQIDNO261)、Rv2729c(SEQIDNO:386)、Rv3386(SEQIDNO481)、Rv3515c(SEQIDNO:497)、Rv0772(SEQIDNO:116),Rv2948c(SEQIDNO:420)、Rv0006(SEQIDNO:1)、Rvl906c(SEQIDNO:273)、Rv2244(SEQIDNO:322)、Rv2468c(SEQIDNO:354)、Rv3701c(SEQIDNO:522)、Rv0054(SEQIDNO:6)、Rvl945(SEQIDNO:277)、Rv3345c(SEQIDNO:472)、Rv0276(SEQIDNO:48)、Rv0709(SEQIDNO:108)、Rvl527c(SEQIDNO:220)、Rv2048c(SEQIDNO:287)、Rv2414c(SEQIDNO:345)、Rv3524(SEQIDNO499)、Rv3556c(SEQIDNO:502)、Rvl322(SEQIDNO:196)、Rv2934(SEQIDNO:417)、Rv0270(SEQIDNO:47)、Rv0612(SEQIDNO:99)、Rvl699(SEQIDNO:242)、Rv2728c(SEQIDNO:385)、Rv3017c(SEQIDNO:430)、Rv3364c(SEQIDNO:476)、Rv3418c(SEQIDNO487)、Rv3718c(SEQIDNO:525)、Rv0426c(SEQIDNO:70)、RvI181(SEQIDNO:171)、Rvl725c(SEQIDNO:250)、Rv0256c(SEQIDNO:44)、Rv0605(SEQIDNO:98)、Rv0737(SEQIDNO:114)、Rv0834c(SEQIDNO:126)、Rvl255c(SEQIDNO:184)、Rv2224c(SEQIDNO:320)、RvI843c(SEQIDNO:265)、Rv2333c(SEQIDNO:334)、Rv2490c(SEQIDNO:357)、Rv3183(SEQIDNO:454)、Rv0668(SEQIDNO:106)、Rvl556(SEQIDNO:223)、Rvl673c(SEQIDNO:236)、Rv3513c(SEQIDNO:496)、Rv3675(SEQIDNO:519)、Rv3870(SEQIDNO:546)、Rv3891c(SEQIDNO:552)、Rv0163(SEQIDNO:24)、Rv0710(SEQIDNO:109)、Rvl297(SEQIDNO:189)、Rvl745c(SEQIDNO:255)、Rv0600c(SEQIDNO:97)、Rvl536(SEQIDNO:222)、Rvl738(SEQIDNO:254)、Rv2524c(SEQIDNO:359)、Rv3086(SEQIDNO:440)、Rv3367(SEQIDNO:477)、Rv0135c(SEQIDNO:20)、Rv0627(SEQIDNO:101)、Rvl448c(SEQIDNO:213)、Rv3224a(SEQIDNO:455)、Rv0029(SEQIDNO:2)、Rv0846c(SEQIDNO:129),RvI159(SEQIDNO:165)、RvI186c(SEQIDNO:172)、Rvl705c(SEQIDNO:243)、Rvl713(SEQIDNO:248)、Rv2476c(SEQIDNO:355)、Rv3402c(SEQIDNO:483)、Rv2615c(SEQIDNO:374)、Rv2995c(SEQIDNO:425)、Rv3788(SEQIDNO:585)、RvO140(SEQIDNO:555)、Rv0203(SEQIDNO:33)、Rvl531(SEQIDNO:565)、Rvl693(SEQIDNO:241)、Rvl882c(SEQIDNO:269)、Rv2143(SEQIDNO:568)、Rv2367c(SEQIDNO:570)、Rv0584(SEQIDNO:94)、Rvl651c(SEQIDNO:567)、Rv3197a(SEQIDNO:576)、Rv3369(SEQIDNO:579)、Rv3825c(SEQIDNO:586)、RvOlOl(SEQIDNO:15)、Rv0808(SEQIDNO:123)、Rv0814c(SEQIDNO:560)、Rv2153c(SEQIDNO:309)、Rv2933(SEQIDNO:416)、Rv0071(SEQIDNO:9)、Rv2471(SEQIDNO:571)、Rv2979c(SEQIDNO:575)、Rv0155(SEQIDNO:556)、Rv0581(SEQIDNO:559)、Rv2631(SEQIDNO:377)、Rv3455c(SEQIDNO:489)、Rv3601c(SEQIDNO:505)、Rv0896(SEQIDNO:562)、Rvl641(SEQIDNO:234),Rv3005c(SEQIDNO:427)、Rv3759c(SEQIDNO:582)、Rv3800c(SEQIDNO:532)、Rv0187(SEQIDNO30)、Rv2379c(SEQIDNO:338)、Rv2434c(SEQIDNO:352),Rv2940c(SEQIDNO:574)、Rv3477(SEQIDNO:580)、Rv0435c(SEQIDNO:72)、Rv0844c(SEQIDNO:128),Rv0856(SEQIDNO:561)、RvI191(SEQIDNO:564)、Rv2803(SEQIDNO:397)、Rv0783c(SEQIDNO:118)、Rvl054(SEQIDNO:563)、Rvl689(SEQIDNO:240)、Rv2539c(SEQIDNO:572)、Rv2859c(SEQIDNO:573)、Rv3777(SEQIDNO:528)在其他方法中，為了鑒定血清診斷抗原，給每個反應(yīng)性抗原進(jìn)行了t-檢驗(yàn)對TB病例與對照的歸一化信號強(qiáng)度進(jìn)行比較，示范性結(jié)果如圖2A所示。這里CyberT-檢驗(yàn)揭示23個抗原的信號在涂片陽性TB病例(n=13)和LTBI陰性對照(n=69)之間是顯著不同的。這些抗原根據(jù)它們在兩個患者組的歸一化信號強(qiáng)度平均值顯示在直方圖中，并且根據(jù)在涂片陽性組中信號逐漸下降的順序排名。還顯示了每個抗原的P-值(頂端)，排列成較重要的抗原產(chǎn)生向下的尖端。基于來自48個LTBI陰性受試對象和50個TB培養(yǎng)物陽性受試對象的探測血清，總共發(fā)現(xiàn)了31種抗原來區(qū)分這些組，如圖2Β所示被認(rèn)為是血清診斷性的。還發(fā)現(xiàn)多種抗原的聯(lián)用產(chǎn)生特異性和靈敏度提高的測試。最佳的2種區(qū)分抗原的AUC>0.88，分類器中再加入3種抗原使AUC評分提高到>0.90。使用10種抗原產(chǎn)生>0.93的AUC評分。奇特的是，再加入抗原不會提高分類器的AUC評分。對于這項(xiàng)研究中的血清，最佳的10種區(qū)分抗原產(chǎn)生>80%的鑒定真陰性的靈敏度，和>90%的鑒定真陽性的靈敏度。這些結(jié)果清楚地支持了利用ORFeomes(采用無酶重組克隆產(chǎn)生的)的全蛋白質(zhì)組微陣列和利用基于大腸桿菌的無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的蛋白質(zhì)組作為發(fā)現(xiàn)血清診斷抗原的有利工具的能力。這些分類器將得益于對特性已知的血清樣品更大量更廣泛的研究。發(fā)明人然后利用接受器操作特性(ROC)曲線研究了不同數(shù)量ORF的診斷能力。ROC曲線是分類器中隨著區(qū)分閾值變化，假陽性率(1-特異性)vs真陽性率(靈敏度)的參數(shù)圖。曲線下的面積(AUC)總結(jié)了結(jié)果。根據(jù)Truchon和BaylyCJChemInfModel47(2)488-508)的方法推斷，AUC為1.O表示完美的分類器，而AUC為0.51(95%置信區(qū)間，0.43到0.59)是對數(shù)據(jù)組隨機(jī)發(fā)揮作用的分類器的預(yù)期值。對于多種抗原，使用了Kernel方法禾口支持向量機(jī)(supportvectormachines)(Bioinformatics:theMachineLearningApproach,SecondEditionedn.=MITPress)來建立線性和非線性分類器。根據(jù)P值或單一抗原AUC的排名最高的1、2、5、10和30個ORF被用做分類器的輸入，結(jié)果經(jīng)10輪3倍交叉驗(yàn)證證實(shí)。結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)顯示將抗原數(shù)量從1增加到5，和從5增加到10產(chǎn)生了分類模式的漸進(jìn)式提高。增加數(shù)量超過這個范圍不能提高算法區(qū)分兩個群體的能力。根據(jù)這些數(shù)據(jù)建立的列聯(lián)表(Contingencytables)顯示在最佳閾值使用10種抗原對于真陽性給出94%的準(zhǔn)確度，真陰性的準(zhǔn)確度78%。替代地，還如下進(jìn)行了抗原選擇原始數(shù)據(jù)被分布到兩個查詢組，在對照點(diǎn)上利用vsn將子集歸一化。對歸一化后的數(shù)據(jù)進(jìn)行CyberT檢驗(yàn)，用前幾位抗原子集建立SVM分類器。去掉重復(fù)。每個樣品包含了元數(shù)據(jù)用于建立10個查詢中的每一個，每個組是原始數(shù)據(jù)的不相交子集，每個查詢只有兩個組。數(shù)據(jù)用ArsinhNormalization(Bioinformatics,18Suppl1,2002)進(jìn)行歸一化，以補(bǔ)償方差對均值的依賴性。對每個樣品進(jìn)行affine-線性轉(zhuǎn)換(scale所有數(shù)值+add數(shù)值)來補(bǔ)償樣品間的位移，從而可以對歸一化后的數(shù)據(jù)進(jìn)行t-檢驗(yàn)。CyberT檢驗(yàn)用于利用相鄰點(diǎn)來估計(jì)某點(diǎn)的方差(Bioinformatics，17(6)509-519,2001)，給出對于特定抗原兩組之間均值的差別的統(tǒng)計(jì)度量。對ρ值取子集根據(jù)P值的限制性給抗原取子集。使用了多重檢驗(yàn)校正，多數(shù)情況中根據(jù)Bonferroni或Benjamini-Hochbergρ值(<.05)給抗原取子集。建立(SVM)分類器利用多個排名靠前的抗原建立分類器從而提供對每個查詢所能達(dá)到的分類準(zhǔn)確度的估計(jì)。這使得能夠確定最終的分類器中包括的最佳抗原數(shù)量。使用3倍交叉檢驗(yàn)，產(chǎn)生ROC曲線來顯現(xiàn)結(jié)果。圖2C顯示的血清診斷性抗原列表中提供了利用這項(xiàng)分析獲得的示范性結(jié)果。富集分析為了確定免疫優(yōu)勢抗原集中富集的蛋白的特性，將蛋白根據(jù)TubercuList基因組數(shù)據(jù)庫(http//Renolist.pasteur.fr/TubercuList/)分到11個功能類別之一中。確定免疫優(yōu)勢抗原集每個類別的“命中”數(shù)量。7個免疫優(yōu)勢抗原被認(rèn)為是血清診斷性的，其中4個(57.1%)是含有脯氨酸-谷氨酸(PE/PPE)基元的蛋白質(zhì)。因?yàn)檎麄€蛋白質(zhì)組含有168個2%)PE/PPE基元蛋白質(zhì)，這代表了相對整個蛋白質(zhì)組顯著的13.6倍的富集。重要的是，167個“交叉反應(yīng)性”免疫優(yōu)勢抗原對任何功能類別都沒有顯著富集。如果不考慮免疫優(yōu)勢性對所有抗原進(jìn)行評估，血清診斷性抗原的數(shù)量可以增加到31。這其中6個(19.4%)是毒性因子，10個(32.2%)是PE/PPE基元蛋白質(zhì)，代表相對整個蛋白質(zhì)組兩種都是顯著的7.7倍富集。有趣的是，參與中間代謝的分子相對整個蛋白質(zhì)組在血清診斷集中顯著未被充分代表(0.1倍富集)。還進(jìn)行了幾項(xiàng)技術(shù)預(yù)測來給抗原分類。脂蛋白和細(xì)胞壁蛋白未在血清診斷抗原集中富集，而擁有信號序列或PSORTb分類的胞外蛋白被富集。高卷曲含量、高甘氨酸和高脯氨酸都是富集特征。描述為具有100-200個氨基酸長的高度保守脯氨酸富集基元且在N末端有高卷曲含量的PE/PPE分子是顯著的富集特征。血清診斷抗原集的31個分子中的沈個帶有負(fù)電荷，等電點(diǎn)<6.7。同樣這些預(yù)測的特征在交叉反應(yīng)抗原集中都沒有富集。結(jié)合抗體的熒光和比色檢測的比較對于熒光掃描儀不現(xiàn)實(shí)或者最好能使用較小的裝置的情況，比如高危實(shí)驗(yàn)室或者常規(guī)診斷實(shí)驗(yàn)室，能夠用比色方法學(xué)替代熒光檢測將促進(jìn)陣列的更廣泛應(yīng)用。但是，不知道與熒光相比，比色讀數(shù)是否靈敏度或動態(tài)范圍較低。為了這個目的，用合適的偶聯(lián)堿性磷酸酶的二抗使HIS和HA標(biāo)簽特異性單克隆抗體顯現(xiàn)，并用nitro-TBdeveloper將陣列顯影。利用常規(guī)的桌面文件掃描儀獲得灰度MOOdpi分辨率的TIFF圖像，4608個數(shù)據(jù)點(diǎn)的散點(diǎn)圖與熒光檢測進(jìn)行了比較。HIS和HA標(biāo)簽的信號相關(guān)性很高(r2分別=0.8186和0.9259)?；跓晒獾臋z測對多聚His標(biāo)簽的檢測、HA標(biāo)簽的檢測、兩種標(biāo)簽的檢測和沒有檢測到標(biāo)簽分別是99.2%,97.0%、96.6%和0.4%?；诒壬臋z測對多聚His標(biāo)簽的檢測、HA標(biāo)簽的檢測、兩種標(biāo)簽的檢測和沒有檢測到標(biāo)簽分別是93.7%、88.6(%、84.8(%和2.5(%。雖然基于熒光的檢測似乎更靈敏(因?yàn)椤半p陰性”較少)，基于堿性磷酸酶的檢測方法是質(zhì)量相當(dāng)?shù)奶娲椒?，只需基本儀器即可進(jìn)行。圖3顯示了用(A)HIS的抗體和(B)HA標(biāo)簽抗體來探測、并通過熒光和比色手段顯現(xiàn)的陣列代表性掃描；散點(diǎn)圖是比色相對于(vs.)熒光數(shù)據(jù)。其他示范性的方法和方案在專利申請PCT/US07/23299(以W02008/140478公開)中有提供，該申請通過引用并入本文。綜上所述，我們公開了與結(jié)核分枝桿菌抗原相關(guān)的組合物和方法的具體實(shí)施方案和應(yīng)用。但對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，很顯然除了已經(jīng)描述的，在不背離本文的發(fā)明理念的情況下還有許多改進(jìn)都是可能的。因此除了隨附權(quán)利要求的精神以外，發(fā)明主題不應(yīng)受到限制。并且，在解釋說明書和權(quán)利要求時，所有的名詞都應(yīng)當(dāng)按照與上下文語境一致的盡可能寬泛的方式來解釋。尤其是名詞“包含”("comprises"和"comprising")應(yīng)當(dāng)解釋為是指非排除性的元件、成分或步驟，表明提及的元件、成分或步驟可能與其他沒有明確提出的元件、成分或步驟一起存在、或使用或組合。此外，凡所述并入?yún)⒖嘉墨I(xiàn)中的定義或名詞的用法與本文提供的該名詞的定義不一致或相沖突的情況，適用本文提供的名詞定義，而參考文獻(xiàn)中的名詞定義不適用。權(quán)利要求1.抗原組合物，所述組合物包含與載體相連的復(fù)數(shù)種結(jié)核分枝桿菌抗原；其中至少兩種抗原對感染了結(jié)核分枝桿菌的群體的血清具有已量化且已知的相對反應(yīng)性；其中至少兩種抗原具有與疾病參數(shù)的已知相關(guān)性；并且其中所述復(fù)數(shù)種抗原是由選自SEQIDNO1至SEQIDNO:586的核酸或其片段所編碼的。2.權(quán)利要求1所述的抗原組合物，其中所述復(fù)數(shù)種抗原是由選自下述的核酸編碼的Rv0798c(SEQIDNO121)、Rvl886c(SEQIDNO:270)、Rv2031c(SEQIDNO:284)、Rv3616c(SEQIDNO:509)、Rv3804c(SEQIDNO:534),Rv3874(SEQIDNO:547)、Rv0302(SEQIDNO52)、Rv0379(SEQIDNO:65)、Rv0394c(SEQIDNO:66)、Rv0456c(SEQIDNO:74)、Rv0632c(SEQIDNO:103)、Rv0944(SEQIDNO:142)、Rv0984(SEQIDNO:146)、Rvl030(SEQIDNO:153)、RVI196(SEQIDNO:174)、Rvl242(SEQIDNO:180)、Rvl284(SEQIDNO:187)、Rvl387(SEQIDNO:206)、Rvl837c(SEQIDNO:264),Rvl926c(SEQIDNO:275)、Rvl980c(SEQIDNO:281)、Rv2094c(SEQIDNO:294)、Rv2544(SEQIDNO:363)、Rv2618(SEQIDNO:375)、Rv2746c(SEQIDNO:391)、Rv2870c(SEQIDNO:407)、Rv2873(SEQIDNO408),Rv2875(SEQIDNO:409)、Rv3050c(SEQIDNO:434)、Rv3248c(SEQIDNO:458)、Rv3376(SEQIDNO:478)、Rv3763(SEQIDNO:527)、Rv3810(SEQIDNO:536)、Rv3864(SEQIDNO:545)、Rv2252(SEQIDNO:323)、Rv2282c(SEQIDNO:569)、Rv0212c(SEQIDNO557)、Rv3243c(SEQIDNO:456)、Rv3675(SEQIDNO:519)、Rv2984(SEQIDNO:423)、RVI175c(SEQIDNO:169),Rv3326(SEQIDNO:578),Rv3628(SEQIDNO:513)、Rv3775(SEQIDNO:584)、Rv3362c(SEQIDNO:475)、Rv0801(SEQIDNO:122),Rvl629(SEQIDNO:566)、Rv0272c(SEQIDNO:558)、Rv3762c(SEQIDNO:583)、Rv3319(SEQIDNO:577)、Rv3495c(SEQIDNO:581)、Rv2151c(SEQIDNO:308)、Rv0227c(SEQIDNO:37)、Rv0280(SEQIDNO:50)、Rv0993(SEQIDNO:148)、Rvl306(SEQIDNO:192)、Rvl363c(SEQIDNO:204)、Rv2050(SEQIDNO:288)、Rv2116(SEQIDNO:299)、Rv3417c(SEQIDNO:486)、Rv3653(SEQIDNO:516)、Rvl253(SEQIDNO:182)、Rv3413c(SEQIDNO:485)、Rvl635c(SEQIDNO:232)、Rv3021c(SEQIDNO:432)、RvI193(SEQIDNO:173)、Rv2592c(SEQIDNO:369)、Rv3620c(SEQIDNO:510),Rv0929(SEQIDNO:139)、Rv0959(SEQIDNO:145)、RvI162(SEQIDNO:166)、Rv2389c(SEQIDNO:341)、Rv2984(SEQIDNO:423)、Rv2588c(SEQIDNO367)、Rv0171(SEQIDNO:26)、Rvl865c(SEQIDNO:267)、Rv2074(SEQIDNO:290)、Rv0543c(SEQIDNO:87)、Rvl677(SEQIDNO:237)、Rvl304(SEQIDNO:191)、Rv2841c(SEQIDNO:400)、Rv3680(SEQIDNO:520)、Rv0831c(SEQIDNO:125)、Rv2032(SEQIDNO:285)、Rv3127(SEQIDNO:446)、Rv3272(SEQIDNO:464)、Rv3323c(SEQIDNO:470)、Rv3508(SEQIDNO:494),Rv3628(SEQIDNO:513)、RvI173(SEQIDNO167),Rv2623(SEQIDNO:376)、Rv0527(SEQIDNO:85)、Rvl620c(SEQIDNO:229)、Rvl901(SEQIDNO:272)、Rv2151c(SEQIDNO:308)、Rv0362(SEQIDNO:60)、Rv3129(SEQIDNO:447)、Rv3140(SEQIDNO:449)、Rv0340(SEQIDNO:56)、Rv2792c(SEQIDNO:395)、Rv3003c(SEQIDNO:426)、Rv3019c(SEQIDNO:431)、Rv3862c(SEQIdno:544)、Rv0572c(SEQIDNO:91)、Rv2477c(SEQIDNO:356),Rv2659c(SEQIDNO:379)、Rv0311(SEQIDNO:54)、Rv0350(SEQIdno:57)、Rv2127(SEQIDNO:301)、Rv3875(SEQIDNO:548)、Rv0877(SEQIDNO:134)、Rvl916(SEQIDNO:274)、Rv2138(SEQIDNO:303)、Rv2847c(SEQIDNO:403)、Rv3118(SEQIDNO:444)、Rv2495c(SEQIDNO:358)、Rv3669(SEQIDNO:517)、Rv0281(SEQIDNO:51)、Rv2711(SEQIDNO:383)、Rv2744c(SEQIDNO:390)、Rv3803c(SEQIDNO:533)、Rvl239c(SEQIDNO:179)、Rv2147c(SEQIDNO:307)、Rv2253(SEQIDNO:324)、Rv0308(SEQIDNO:53)、Rv0587(SEQIDNO:95)、Rvl564c(SEQIDNO:224)、Rv2185c(SEQIDNO:313)、Rvl805c(SEQIDNO:261)、Rv2729c(SEQIDNO:386)、Rv3386(SEQIDNO:481)、Rv3515c(SEQIDNO:497)、Rv0772(SEQIDNO:116),Rv2948c(SEQIDNO:420)、Rv0006(SEQIDNO:1)、Rvl906c(SEQIDNO:273)、Rv2244(SEQIDNO:322)、Rv2468c(SEQIDNO:354)、Rv3701c(SEQIDNO:522)、Rv0054(SEQIDNO:6)、Rvl945(SEQIDNO:277)、Rv3345c(SEQIDNO:472)、Rv0276(SEQIDNO:48)、Rv0709(SEQIDNO:108)、Rvl527c(SEQIDNO:220)、Rv2048c(SEQIDNO:287)、Rv2414c(SEQIDNO:345)、Rv3524(SEQIDNO499)、Rv3556c(SEQIDNO:502)、Rvl322(SEQIDNO:196)、Rv2934(SEQIDNO:417)、Rv0270(SEQIDNO:47)、Rv0612(SEQIDNO:99)、Rvl699(SEQIDNO:242)、Rv2728c(SEQIDNO:385)、Rv3017c(SEQIDNO:430)、Rv3364c(SEQIDNO:476)、Rv3418c(SEQIDNO487)、Rv3718c(SEQIDNO:525)、Rv0426c(SEQIDNO:70)、RvI181(SEQIDNO:171)、Rvl725c(SEQIDNO:250)、Rv0256c(SEQIDNO:44)、Rv0605(SEQIDNO:98)、Rv0737(SEQIDNO:114)、Rv0834c(SEQIDNO:126)、Rvl255c(SEQIDNO:184)，Rv2224c(SEQIDNO:320),RvI843c(SEQIDNO:265)、Rv2333c(SEQIDNO:334)、Rv2490c(SEQIDNO:357)，Rv3183(SEQIDNO:454),Rv0668(SEQIDNO:106)、Rvl556(SEQIDNO:223)、Rvl673c(SEQIDNO:236),Rv3513c(SEQIDNO:496)、Rv3675(SEQIDNO:519)、Rv3870(SEQIDNO:546)、Rv3891c(SEQIDNO:552)、Rv0163(SEQIDNO:24)、Rv0710(SEQIDNO:109)、Rvl297(SEQIDNO:189)、Rvl745c(SEQIDNO:255)、Rv0600c(SEQIDNO:97)、Rvl536(SEQIDNO:222)、Rvl738(SEQIDNO:254)、Rv2524c(SEQIDNO:359)、Rv3086(SEQIDNO:440)、Rv3367(SEQIDNO:477)、Rv0135c(SEQIDNO:20)、Rv0627(SEQIDNO:101)、Rvl448c(SEQIDNO:213)、Rv3224a(SEQIDNO:455)、Rv0029(SEQIDNO:2)、Rv0846c(SEQIDNO:129),RvI159(SEQIDNO:165)、RvI186c(SEQIDNO:172)、Rvl705c(SEQIDNO:243)、Rvl713(SEQIDNO:248)、Rv2476c(SEQIDNO:355)、Rv3402c(SEQIDNO:483)、Rv2615c(SEQIDNO:374)、Rv2995c(SEQIDNO:425)、Rv3788(SEQIDNO:585)、RvO140(SEQIDNO:555)、Rv0203(SEQIDNO:33)、Rvl531(SEQIDNO:565)、Rvl693(SEQIDNO:241)、Rvl882c(SEQIDNO:269)、Rv2143(SEQIDNO:568)、Rv2367c(SEQIDNO:570)、Rv0584(SEQIDNO:94)、Rvl651c(SEQIDNO:567)、Rv3197a(SEQIDNO:576)、Rv3369(SEQIDNO:579)、Rv3825c(SEQIDNO:586)、RvOlOl(SEQIDNO:15)、Rv0808(SEQIDNO:123)、Rv0814c(SEQIDNO:560)、Rv2153c(SEQIDNO:309)、Rv2933(SEQIDNO:416)、Rv0071(SEQIDNO:9)、Rv2471(SEQIDNO:571)、Rv2979c(SEQIDNO:575)、Rv0155(SEQIDNO:556)、Rv0581(SEQIDNO:559)、Rv2631(SEQIDNO:377)、Rv3455c(SEQIDNO:489)、Rv3601c(SEQIDNO:505)、Rv0896(SEQIDNO:562)、Rvl641(SEQIDNO:234),Rv3005c(SEQIDNO:427)、Rv3759c(SEQIDNO:582)、Rv3800c(SEQIDNO:532)、Rv0187(SEQIDNO30)、Rv2379c(SEQIDNO:338)、Rv2434c(SEQIDNO:352),Rv2940c(SEQIDNO:574)，Rv3477(SEQIDNO:580)、Rv0435c(SEQIDNO:72)、Rv0844c(SEQIDNO:128),Rv0856(SEQIDNO:561)、RvI191(SEQIDNO:564)、Rv2803(SEQIDNO:397)、Rv0783c(SEQIDNO:118)、Rvl054(SEQIDNO:563)、Rvl689(SEQIDNO:240)、Rv2539c(SEQIDNO:572)、Rv2859c(SEQIDNO:573)、Rv3777(SEQIDNO:528)3.權(quán)利要求2所述的抗原組合物，其中所述復(fù)數(shù)種抗原是由選自Rv0798c(SEQIDNO121)、Rvl886c(SEQIDNO:270)、Rv2031c(SEQIDNO:284)、Rv3616c(SEQIDNO:509)、Rv3804c(SEQIDNO534)和Rv3874(SEQIDNO547)的核酸編碼的。4.權(quán)利要求1所述的抗原組合物，其中所述已知反應(yīng)性是由免疫原性強(qiáng)度表征的。5.權(quán)利要求1所述的抗原組合物，其中所述已知反應(yīng)性是由疾病活動性狀況表征的。6.權(quán)利要求1所述的抗原組合物，其中所述參數(shù)選自以前與該病原體的接觸、與該病原體的接觸時間、慢性感染、無感染、對感染的至少部分免疫力、過去的疾病和治療后的結(jié)ο7.權(quán)利要求1所述的抗原組合物，其中所述至少兩種抗原可見于與該至少兩種抗原接觸的群體的至少20%，并任選其中患者產(chǎn)生的抗所述至少兩種抗原的抗體的平均結(jié)合親和力和平均抗體量有至少一個處于患者中產(chǎn)生的抗體的結(jié)合親和力和抗體量的上三分位數(shù)。8.權(quán)利要求1所述的抗原組合物，其中所述至少兩種抗原可見于與該至少兩種抗原接觸的群體的至少40%，任選其中患者產(chǎn)生的抗所述至少兩種抗原的抗體的平均結(jié)合親和力和平均抗體量有至少一個處于患者產(chǎn)生的抗體的結(jié)合親和力和抗體量的上四分位數(shù)。9.權(quán)利要求1所述的抗原組合物，其中所述載體是醫(yī)藥可接受的載體，所述組合物被配制成疫苗。10.權(quán)利要求9所述的抗原組合物，其中所述疫苗包含至少兩種抗原。11.權(quán)利要求10所述的抗原組合物，其中所述抗原的至少一種由選自Rv0798c(SEQIDNO:121)、Rvl886c(SEQIDNO:270)、Rv2031c(SEQIDNO:284)、Rv3616c(SEQIDNO:509)、Rv3804c(SEQIDNO:534)和Rv3874(SEQIDNO547)的序列或者其片段編碼。12.權(quán)利要求9所述的抗原組合物，其中所述抗原或其片段是重組的，并且任選是至少部分純化的。13.權(quán)利要求1所述的抗原組合物，其中所述載體是固體載體，并且所述復(fù)數(shù)種抗原布置在載體上的陣列中。14.權(quán)利要求13所述的抗原組合物，其中所述抗原每種的純度都高于60%。15.權(quán)利要求13所述的抗原組合物，其中所述抗原或其片段是重組的。16.權(quán)利要求13所述的抗原組合物，其中所述抗原或其片段是至少部分純化的。17.在含有抗體的體液樣品中檢測抗結(jié)核分枝桿菌抗原的抗體的方法，所述方法包括將樣品與結(jié)核分枝桿菌抗原進(jìn)行接觸，其中所述抗原的至少兩種由選自SEQIDNO:1至SEQIDNO586的核酸或其片段編碼；以及檢測樣品中與抗原結(jié)合的抗體。18.權(quán)利要求17所述的方法，其中所述抗原由選自下述的序列或其片段編碼Rv0798c(SEQIDNO121)、Rvl886c(SEQIDNO:270)、Rv2031c(SEQIDNO:284)，Rv3616c(SEQIDNO:509),Rv3804c(SEQIDNO:534),Rv3874(SEQIDNO:547)、Rv0302(SEQIDNO52)，Rv0379(SEQIDNO:65)，Rv0394c(SEQIDNO:66)、Rv0456c(SEQIDNO:74)、Rv0632c(SEQIDNO:103)，Rv0944(SEQIDNO:142)、Rv0984(SEQIDNO:146)、Rvl030(SEQIDNO:153)、RVI196(SEQIDNO:174)，Rvl242(SEQIDNO:180)、Rvl284(SEQIDNO:187)、Rvl387(SEQIDNO:206)、Rvl837c(SEQIDNO264),Rvl926c(SEQIDNO:275)、Rvl980c(SEQIDNO:281)、Rv2094c(SEQIDNO:294)、Rv2544(SEQIDNO:363)、Rv2618(SEQIDNO:375)、Rv2746c(SEQIDNO:391)、Rv2870c(SEQIDNO:407)、Rv2873(SEQIDNO408),Rv2875(SEQIDNO:409)、Rv3050c(SEQIDNO:434)、Rv3248c(SEQIDNO:458)、Rv3376(SEQIDNO:478)、Rv3763(SEQIDNO:527)、Rv3810(SEQIDNO:536)、Rv3864(SEQIDNO:545)、Rv2252(SEQIDNO:323)、Rv2282c(SEQIDNO:569)、Rv0212c(SEQIDNO557)、Rv3243c(SEQIDNO:456)、Rv3675(SEQIDNO:519)、Rv2984(SEQIDNO:423)、RvI175c(SEQIDNO:169),Rv3326(SEQIDNO:578),Rv3628(SEQIDNO:513)、Rv3775(SEQIDNO:584)、Rv3362c(SEQIDNO:475)、Rv0801(SEQIDNO:122),Rvl629(SEQIDNO:566)、Rv0272c(SEQIDNO:558)、Rv3762c(SEQIDNO:583)、Rv3319(SEQIDNO:577)、Rv3495c(SEQIDNO:581)、Rv2151c(SEQIDNO:308)、Rv0227c(SEQIDNO，37)、Rv0280(SEQIDNO:50)、Rv0993(SEQIDNO:148)、Rvl306(SEQIDNO:192)、Rvl363c(SEQIDNO:204)、Rv2050(SEQIDNO:288)、Rv2116(SEQIDNO:299)、Rv3417c(SEQIDNO:486)、Rv3653(SEQIDNO:516)、Rvl253(SEQIDNO:182)、Rv3413c(SEQIDNO:485)、Rvl635c(SEQIDNO:232)、Rv3021c(SEQIDNO:432)、RvI193(SEQIDNO:173)、Rv2592c(SEQIDNO:369)、Rv3620c(SEQIDNO:510),Rv0929(SEQIDNO:139)、Rv0959(SEQIDNO:145)、RvI162(SEQIDNO:166)、Rv2389c(SEQIDNO:341)、Rv2984(SEQIDNO:423)、Rv2588c(SEQIDNO367)、Rv0171(SEQIDNO:26)、Rvl865c(SEQIDNO:267)、Rv2074(SEQIDNO:290)、Rv0543c(SEQIDNO:87)、Rvl677(SEQIDNO:237)、Rvl304(SEQIDNO:191)、Rv2841c(SEQIDNO:400)、Rv3680(SEQIDNO:520)，Rv0831c(SEQIDNO:125)、Rv2032(SEQIDNO:285)、Rv3127(SEQIDNO:446)、Rv3272(SEQIDNO:464)、Rv3323c(SEQIDNO:470)、Rv3508(SEQIDNO:494),Rv3628(SEQIDNO:513)、RvI173(SEQIDNO167),Rv2623(SEQIDNO:376)、Rv0527(SEQIDNO:85)、Rvl620c(SEQIDNO:229)、Rvl901(SEQIDNO:272)，Rv2151c(SEQIDNO:308)、Rv0362(SEQIDNO:60)、Rv3129(SEQIDNO:447)、Rv3140(SEQIDNO:449)、Rv0340(SEQIDNO:56)、Rv2792c(SEQIDNO:395)、Rv3003c(SEQIDNO:426)、Rv3019c(SEQIDNO:431)、Rv3862c(SEQIDNO:544)、Rv0572c(SEQIDNO:91)、Rv2477c(SEQIDNO:356),Rv2659c(SEQIDNO:379)、Rv0311(SEQIDNO:54)、Rv0350(SEQIDNO:57)、Rv2127(SEQIDNO:301)、Rv3875(SEQIDNO:548)、Rv0877(SEQIDNO:134)、Rvl916(SEQIDNO:274)、Rv2138(SEQIDNO:303)、Rv2847c(SEQIDNO:403)、Rv3118(SEQIDNO:444)、Rv2495c(SEQIDNO:358)、Rv3669(SEQIDNO:517)、Rv0281(SEQIDNO:51)、Rv2711(seq_idNO:383)、Rv2744c(SEQIDNO:390)、Rv3803c(SEQIDNO:533)、Rvl239c(IDNOSEQ:179)、Rv2147c(SEQIDNO:307)、Rv2253(SEQIDNO:324)、Rv0308(SEQIDNO:53)、Rv0587(SEQIDNO:95)、Rvl564c(SEQIDNO:224)、Rv2185c(IDNOSEQ:313)、Rvl805c(SEQIDNO:261)、Rv2729c(SEQIDNO:386)、Rv3386(SEQIDNO481)、Rv3515c(SEQIDNO:497)、Rv0772(SEQIDNO:116),Rv2948c(SEQIDNO:420)、Rv0006(SEQIDNO:1)、Rvl906c(SEQIDNO:273)、Rv2244(SEQIDNO:322)、Rv2468c(SEQIDNO:354)、Rv3701c(SEQIDNO:522)、Rv0054(SEQIDNO:6)、Rvl945(SEQIDNO:277)、Rv3345c(SEQIDNO:472)、Rv0276(SEQIDNO:48)、Rv0709(SEQIDNO:108)、Rvl527c(SEQIDNO:220)、Rv2048c(SEQIDNO:287)、Rv2414c(SEQIDNO:345)、Rv3524(SEQIDNO499)、Rv3556c(SEQIDNO:502)、Rvl322(SEQIDNO196)、Rv2934(SEQIDNO:417)、Rv0270(SEQIDNO:47)、Rv0612(SEQIDNO:99)、Rvl699(SEQIDNO:242)、Rv2728c(SEQIDNO:385)、Rv3017c(SEQIDNO:430)、Rv3364c(SEQIDNO:476)、Rv3418c(SEQIDNO487)、Rv3718c(SEQIDNO:525)、Rv0426c(SEQIDNO:70)、RvI181(SEQIDNO:171)、Rvl725c(SEQIDNO:250)、Rv0256c(SEQIDNO:44)、Rv0605(SEQIDNO:98)、Rv0737(SEQIDNO:114)、Rv0834c(SEQIDNO:126)、Rvl255c(SEQIDNO:184)，Rv2224c(SEQIDNO:320),RvI843c(SEQIDNO:265)、Rv2333c(SEQIDNO:334)、Rv2490c(SEQIDNO:357)，Rv3183(SEQIDNO:454),Rv0668(SEQIDNO:106)、Rvl556(SEQIDNO:223)、Rvl673c(SEQIDNO:236),Rv3513c(SEQIDNO:496)、Rv3675(SEQIDNO:519)、Rv3870(SEQIDNO:546)、Rv3891c(SEQIDNO:552)、Rv0163(SEQIDNO:24)、Rv0710(SEQIDNO:109)、Rvl297(SEQIDNO:189)、Rvl745c(SEQIDNO:255)、Rv0600c(SEQIDNO:97)、Rvl536(SEQIDNO:222)、Rvl738(SEQIDNO:254)、Rv2524c(SEQIDNO:359)、Rv3086(SEQIDNO:440)、Rv3367(SEQIDNO:477)、Rv0135c(SEQIDNO:20)、Rv0627(SEQIDNO:101)、Rvl448c(SEQIDNO:213)、Rv3224a(SEQIDNO:455)、Rv0029(SEQIDNO:2)、Rv0846c(SEQIDNO:129),RvI159(SEQIDNO:165)、RvI186c(SEQIDNO:172)、Rvl705c(SEQIDNO:243)、Rvl713(SEQIDNO:248)、Rv2476c(SEQIDNO:355)、Rv3402c(SEQIDNO:483)、Rv2615c(SEQIDNO:374)、Rv2995c(SEQIDNO:425)、Rv3788(SEQIDNO:585)、RvO140(SEQIDNO:555)、Rv0203(SEQIDNO:33)、Rvl531(SEQIDNO:565)、Rvl693(SEQIDNO:241)、Rvl882c(SEQIDNO:269)、Rv2143(SEQIDNO:568)、Rv2367c(SEQIDNO:570)、Rv0584(SEQIDNO:94)、Rvl651c(SEQIDNO:567)、Rv3197a(SEQIDNO:576)、Rv3369(SEQIDNO:579)、Rv3825c(SEQIDNO:586)、RvOlOl(SEQIDNO:15)、Rv0808(SEQIDNO:123)、Rv0814c(SEQIDNO:560)、Rv2153c(SEQIDNO:309),Rv2933(SEQIDNO:416)、Rv0071(SEQIDNO:9)、Rv2471(SEQIDNO:571)、Rv2979c(SEQIDNO:575)、Rv0155(SEQIDNO:556)、Rv0581(SEQIDNO:559)、Rv2631(SEQIDNO:377)、Rv3455c(SEQIDNO:489)、Rv3601c(SEQIDNO:505)、Rv0896(SEQIDNO:562)、Rvl641(SEQIDNO:234),Rv3005c(SEQIDNO:427)、Rv3759c(SEQIDNO:582)、Rv3800c(SEQIDNO:532)、Rv0187(SEQIDNO30)、Rv2379c(SEQIDNO:338)、Rv2434c(SEQIDNO:352),Rv2940c(SEQIDNO:574)，Rv3477(SEQIDNO:580)、Rv0435c(SEQIDNO:72)、Rv0844c(SEQIDNO:128),Rv0856(SEQIDNO:561)、RvI191(SEQIDNO:564)、Rv2803(SEQIDNO:397)、Rv0783c(SEQIDNO:118)、Rvl054(SEQIDNO:563)、Rvl689(SEQIDNO:240)、Rv2539c(SEQIDNO:572)、Rv2859c(SEQIDNO:573)、Rv3777(SEQIDNO:528)19.權(quán)利要求18所述的方法，其中所述抗原由選自Rv0798c(SEQIDNO:121)、Rvl886c(SEQIDNO:270)、Rv2031c(SEQIDNO:284)、Rv3616c(SEQIDNO:509)、Rv3804c(SEQIDNO:534)和Rv3874(SEQIDNO547)的序列或其片段所編碼。20.權(quán)利要求18所述的方法，其中所述檢測還包括與抗體結(jié)合時能夠激發(fā)信號的抗原。21.權(quán)利要求18所述的方法，其中抗體與抗原的結(jié)合親和力指示結(jié)核病的活動性狀況。22.用于結(jié)核病診斷的抗體檢測方法的試劑盒，所述試劑盒包含由選自SEQIDNO1至SEQIDNO586的核酸或其片段編碼的至少一種抗原。23.權(quán)利要求22所述的試劑盒，其中所述試劑盒包含一種以上抗原，并且每種抗原被固定在表面上的不同位置。24.權(quán)利要求22所述的試劑盒，其中所述至少一種抗原適用于區(qū)分活動性結(jié)核病與非活動性結(jié)核病。25.抗原組合物，所述組合物包含復(fù)數(shù)種由選自SEQIDNO:1至SEQIDNO:586的核酸或其片段編碼的結(jié)核分枝桿菌抗原，其中所述抗原的至少兩種能夠引發(fā)免疫反應(yīng)，其中所述免疫反應(yīng)能夠檢測活動性結(jié)核分枝桿菌感染。26.檢測受試對象中結(jié)核分枝桿菌感染的方法，所述方法包括向外周血樣品加入至少兩種由選自SEQIDNO1toSEQIDNO:586的核酸或其片段編碼的抗原，和檢測至少一種細(xì)胞因子的產(chǎn)生的增加。全文摘要來自病原體結(jié)核分枝桿菌的多種抗原的組合物、裝置和方法，以及它們在疫苗、治療劑和各種診斷測試中的用途。在尤其優(yōu)選的方面，所述抗原是免疫優(yōu)勢抗原并且對感染了病原體的群體的血清具有已量化且已知的相對反應(yīng)性，和/或具有與疾病參數(shù)的已知相關(guān)性。文檔編號C12Q1/68GK102573896SQ200980160460公開日2012年7月11日申請日期2009年5月13日優(yōu)先權(quán)日2009年5月13日發(fā)明者M(jìn).L.金納羅,P.菲爾格納申請人:因波特醫(yī)療股份有限公司,梁小武