專利名稱：具有誘導(dǎo)癌癥特異性免疫反應(yīng)的能力的樹(shù)突狀細(xì)胞的制備方法,包含該樹(shù)突狀細(xì)胞的用 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提高癌癥特異性免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)能力的成熟樹(shù)突狀細(xì)胞的制備方法，并涉及一種包括基于該方法制備的成熟樹(shù)突狀細(xì)胞的用于預(yù)防或治療癌癥或者抑制癌癥轉(zhuǎn)移的藥物組合物，及包括基于該方法制備的成熟樹(shù)突狀細(xì)胞和免疫輔助劑的藥物試劑盒。
背景技術(shù)：
目前為止公知的癌癥治療方法中，大部分是手術(shù)、抗癌藥劑及放射線療法。但是， 這些治療方法很難根治，并且會(huì)出現(xiàn)很多副作用。特別是在轉(zhuǎn)移癌癥或者復(fù)發(fā)癌癥當(dāng)中，大部分都不能做手術(shù)，并且會(huì)排斥化學(xué)治療劑，因此在治療上受到限制。近來(lái)，積極研發(fā)著利用諸如樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendritic cells)的免疫細(xì)胞的癌癥治療法。樹(shù)突狀細(xì)胞通過(guò)吞噬作用(phagocytosis)或胞飲作用(pinocytosis)而捕獲外部抗原并活化，之后誘導(dǎo)抗原特異性的T細(xì)胞活性，并且在捕獲外部抗原而活化時(shí)，自身的 MHC(major histocompatibility complex 主要組織相容性復(fù)合物)分子或輔助刺激因子 (costimulatory factor)的表達(dá)增加，從而誘導(dǎo)細(xì)胞免疫。樹(shù)突狀細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞免疫的過(guò)程如下。被抗原所致敏(sensitization)的樹(shù)突狀細(xì)胞，i)因大量表達(dá)歸巢受體(homing receptor)而移動(dòng)至下一免疫器官，ii)表達(dá)樹(shù)突狀細(xì)胞特異性C-C趨化因子(DC-CKI)而聚集非活性狀態(tài)的初始T細(xì)胞(naive T cell)，iii)通過(guò)MHC提供的抗原和T細(xì)胞受體 (TCR)的直接相互作用，傳遞抗原信息，iv)從而誘導(dǎo)抗原特異性的T細(xì)胞的活性。另外，肝癌是發(fā)病率居全球第五位且康復(fù)情況并不理想的癌癥。目前所使用的療法主要分為肝切割手術(shù)及肝移植等外科療法及射頻消融術(shù)(Readiofrequency ablation), Ini^ZiIIiiIt^ (percutaneous ethanol injection) Jk^)]W^ff (transarterial chemoembolization)等非外科療法。上述療法是根據(jù)肝癌的患病時(shí)間、肝功能及患者的活動(dòng)情況而選擇。誘發(fā)肝細(xì)胞癌的原因有諸如HBV、HCV的肝炎病菌、諸如黃曲霉毒素的毒素、 乙醇過(guò)量吸取及藥物濫用等，從地區(qū)上來(lái)說(shuō)，在韓國(guó)、中國(guó)、日本等東南亞國(guó)家頻發(fā)。肝癌的進(jìn)行過(guò)程是，經(jīng)過(guò)20-40年在病菌、乙醇等的作用下患慢性肝炎繼而發(fā)生肝硬化，并接著患肝癌。這種肝癌在治療上的問(wèn)題是，局部復(fù)發(fā)、肝內(nèi)復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移。為了解決這些問(wèn)題，開(kāi)發(fā)了全身肝癌治劑，并進(jìn)行免疫治療。近來(lái)，肝癌治劑的開(kāi)發(fā)主要是以標(biāo)靶治劑及人源化抗體治劑為中心，在其他癌癥中得到許可后擴(kuò)大適應(yīng)癥的方式進(jìn)行。就免疫治療來(lái)說(shuō)，根據(jù)國(guó)際指導(dǎo)原則，主要就發(fā)展性肝癌進(jìn)行評(píng)價(jià)。從1990年至今，對(duì)肝細(xì)胞改正的免疫治療臨床研究分為如下戰(zhàn)略(1)。i)通過(guò)基于細(xì)胞因子的臨床試驗(yàn)，誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的非特異性活化， ) 在基于細(xì)胞的臨床試驗(yàn)中，使用自體樹(shù)突狀細(xì)胞、細(xì)胞因子誘導(dǎo)的末梢血液細(xì)胞(cytokine induced PBL)、TIL (腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞，tumor infilterated lymphocyte)等，iii)基于人源化抗體的臨床試驗(yàn)，iv)自體腫瘤細(xì)胞疫苗(autologous tumor cell vaccine), ν)肽疫苗等。通常，從前體細(xì)胞制作出成熟化樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗的過(guò)程分為如下兩大步驟。第一階段的培養(yǎng)，是用分化誘導(dǎo)物質(zhì)(細(xì)胞因子或其他細(xì)胞-分化促進(jìn)劑)誘導(dǎo)各種血液源的細(xì)胞分化為未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞，并且在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)收獲未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞的步驟。第二階段的培養(yǎng)，是對(duì)上述未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞進(jìn)行癌癥或病原菌-特異性抗原處理的培養(yǎng)步驟， 與抗原一同將樹(shù)突狀細(xì)胞成熟化因子添加至培養(yǎng)液中，從而收獲成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞作為獲得抗原特異免疫誘導(dǎo)性的疫苗。所述樹(shù)突狀細(xì)胞成熟化因子通常是根據(jù)臨床研究人員的選擇而定，但基本上多使用具有特定組成的細(xì)胞因子混合物(cytokine cocktail)或非特定組成的單核細(xì)胞條件培養(yǎng)液(MCM :monocyte-conditioned medium, 3)等。除此之外，也可以在無(wú)前體細(xì)胞分離過(guò)程的情況下，通過(guò)經(jīng)抗原敏化的離體處理(ex vivo conditioning) 將樹(shù)突狀細(xì)胞直接從人體分離，作為疫苗使用。在利用樹(shù)突狀細(xì)胞的免疫治療的臨床研究中，為了活化癌癥特異性免疫反應(yīng)，主要將腫瘤裂解物(tumor lysate)或癌癥特異性抗原等用于樹(shù)突狀細(xì)胞的敏化O)。為了利用抗原蛋白質(zhì)實(shí)現(xiàn)更有效的樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟，進(jìn)行了通過(guò)細(xì)胞表面標(biāo)靶化方法或膜轉(zhuǎn)位肽(membrane translocating ρ印tide)的融合來(lái)克服上述問(wèn)題的研究(3)。由此，對(duì) HIV-ITAT 蛋白質(zhì)的 PTD (protein translocating domain (蛋白轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域)， YGRKKRRQRRR)進(jìn)行研究(4)。另外，制作了一系列 CTP (cytoplasmic transduction ρ印tide，胞質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)肽)候選物質(zhì)，所述CTP候選物質(zhì)來(lái)源自PTD且具有膜透過(guò)性，但因其變更的結(jié)構(gòu)而無(wú)法移動(dòng)到細(xì)胞核，并因此殘留在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)(W0 2003-097671,5)。咪喹莫特(1-(2-甲基丙基)-1Η-咪唑并W，5-c]喹啉_4_胺)是作為免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)劑(immune response modifier)使用的化合物。咪喹莫特的作用機(jī)制并未被明確公開(kāi)，但公開(kāi)了咪喹莫特結(jié)合于干涉病原體識(shí)別的細(xì)胞表面受體TLR(toll-like receptor, toll樣受體)_7而活化免疫細(xì)胞(6)。通過(guò)TLR-7被咪喹莫特活化的細(xì)胞分泌干擾素-α (interferon-α )、白細(xì)胞介素(interleukin) _6 及 TNF (tumor necrosis factor，腫瘤壞死因子)_α等細(xì)胞因子(7)。將咪喹莫特用于皮膚時(shí)，可以活化蘭氏細(xì)胞(Langerhans cells)，這些細(xì)胞移動(dòng)至局部淋巴結(jié)，并活化后天性免疫系統(tǒng)。咪喹莫特活化的其他細(xì)胞包括自然殺手細(xì)胞(natural killer cells)、巨噬細(xì)胞(macrophages) 及B-淋巴細(xì)胞(B-lymphocytes) (8)。據(jù)最近的新研究結(jié)果，咪喹莫特的抗增殖作用 (anti-proliferation effect)是由與免疫系統(tǒng)活化完全不同的其他機(jī)制所產(chǎn)生，這種作用可通過(guò)增加0GFr(opioid growth factor rec印tor，阿片樣物質(zhì)生長(zhǎng)因子受體)水平來(lái)產(chǎn)生。當(dāng)以siRNA技術(shù)阻斷OGFr功能時(shí)，則咪喹莫特的抗增殖作用也會(huì)消失(9)。因全身使用時(shí)會(huì)有副作用，咪喹莫特主要以乳劑形式局部給藥使用，以Aldara的商標(biāo)名市售的咪喹莫特5%乳膏于1997年被美國(guó)FDA核準(zhǔn)作為光化性角化病(actinic keratosis)、表淺性基底細(xì)胞癌(superficial basal cell carcinoma)、夕卜生殖器撫(external genital warts)等的治療劑，作為治療用藥品使用。本發(fā)明的說(shuō)明書(shū)參照了多篇論文及專利文獻(xiàn)，并標(biāo)注了其引用部分。引用的論文及專利文獻(xiàn)的公開(kāi)內(nèi)容，全部通過(guò)引用的方式納入本發(fā)明的說(shuō)明書(shū)中，用于明確說(shuō)明本發(fā)明所屬的技術(shù)領(lǐng)域的水平及本發(fā)明內(nèi)容。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明的發(fā)明人努力研發(fā)用于癌癥治療的樹(shù)突狀細(xì)胞治療劑。結(jié)果，確認(rèn)了存在與肽YGRRARRRRRR融合的癌癥特異性抗原蛋白質(zhì)的情況下，將未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞成熟化而制備的成熟樹(shù)突狀細(xì)胞具有良好的誘導(dǎo)癌癥特異性免疫反應(yīng)的能力，具有預(yù)防或治療癌癥及抑制癌癥轉(zhuǎn)移的功效，并且還確認(rèn)了在施用上述成熟樹(shù)突狀細(xì)胞治療劑時(shí)，聯(lián)合使用咪喹莫特(imiquimod)作為免疫輔助劑，則可以大大提高對(duì)癌癥的免疫治療以及預(yù)防或抑制癌癥轉(zhuǎn)移的功效，從而完成了本發(fā)明。由此，本發(fā)明的目的在于，提供一種制備具有良好的癌癥特異免疫反應(yīng)誘導(dǎo)能力的成熟樹(shù)突狀細(xì)胞的方法。本發(fā)明的另一目的在于，提供一種包括具有癌癥特異免疫反應(yīng)誘導(dǎo)能力的成熟樹(shù)突狀細(xì)胞的用于預(yù)防或治療癌癥或者抑制癌癥轉(zhuǎn)移的藥物組合物。本發(fā)明的另一目的在于，提供一種包括具有癌癥特異免疫反應(yīng)誘導(dǎo)能力的成熟樹(shù)突狀細(xì)胞及咪喹莫特的用于預(yù)防或治療癌癥或者抑制癌癥轉(zhuǎn)移的藥物試劑盒。本發(fā)明的另一目的在于，提供一種用于預(yù)防或治療癌癥或者抑制癌癥轉(zhuǎn)移的方法，包括將具有癌癥特異免疫反應(yīng)誘導(dǎo)能力的成熟樹(shù)突狀細(xì)胞給予癌癥受試者的步驟。本發(fā)明的另一目的在于，提供一種用于預(yù)防或治療癌癥或者抑制癌癥轉(zhuǎn)移的方法，包括聯(lián)合使用具有癌癥特異免疫反應(yīng)誘導(dǎo)能力的成熟樹(shù)突狀細(xì)胞及咪喹莫特的步驟。本發(fā)明的目的及優(yōu)點(diǎn)將通過(guò)說(shuō)明書(shū)、權(quán)利要求書(shū)及附圖
進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。技術(shù)性解決方法根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例，提供一種具有癌癥特異免疫反應(yīng)誘導(dǎo)能力的成熟樹(shù)突狀細(xì)胞的制備方法，該制備方法包括(a)將未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞用與肽YGRRARRRRRR融合的癌癥特異抗原蛋白質(zhì)致敏而使其成熟化的步驟；以及(b)分離所述步驟(a)中成熟化的樹(shù)突狀細(xì)胞的步驟。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例，提供一種用于預(yù)防或治療癌癥的藥物組合物，該藥物組合物包括(a)藥學(xué)有效量的以所述成熟樹(shù)突狀細(xì)胞的制備方法制備且具有癌癥特異性免疫反應(yīng)誘導(dǎo)能力的成熟樹(shù)突狀細(xì)胞；以及(b)可藥用載體。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例，提供一種用于抑制癌癥轉(zhuǎn)移的藥物組合物，該藥物組合物包括(a)藥學(xué)有效量的以所述成熟樹(shù)突狀細(xì)胞的制備方法制備且具有癌癥特異性免疫反應(yīng)誘導(dǎo)能力的成熟樹(shù)突狀細(xì)胞；以及(b)可藥用載體。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例，提供一種用于預(yù)防或治療癌癥的藥物試劑盒(KIT)， 該試劑盒包括(a)藥物組合物，包括根據(jù)所述成熟樹(shù)突狀細(xì)胞的制備方法制備且具有癌癥特異性免疫反應(yīng)誘導(dǎo)能力的成熟樹(shù)突狀細(xì)胞；以及(b)包含以下述化學(xué)式1表示的化合物的組合物。[化學(xué)式1]
權(quán)利要求
1.一種具有誘導(dǎo)癌癥特異性免疫反應(yīng)的能力的成熟樹(shù)突狀細(xì)胞的制備方法，其特征在于，包括(a)將未成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞用與肽YGRRARRRRRR融合的癌癥特異性抗原蛋白質(zhì)致敏而使其成熟化的步驟 ’及,(b)分離所述步驟(a)中的成熟化的樹(shù)突狀細(xì)胞的步驟。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有癌癥特異免疫反應(yīng)誘導(dǎo)能力的成熟樹(shù)突狀細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述步驟(a)是在存在作為樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟化誘導(dǎo)細(xì)胞因子的 TNF(Tumor necrosis factor)-α , IFN(Interferon)- γ> IL-I β > IL-6> PGE2 (Prostaglandin Ε2)或其混合物的情況下進(jìn)行。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有癌癥特異性免疫反應(yīng)誘導(dǎo)能力的成熟樹(shù)突狀細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述步驟(a)中的癌癥特異性抗原為肝癌特異性抗原。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的具有癌癥特異性免疫反應(yīng)誘導(dǎo)能力的成熟樹(shù)突狀細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述肝癌特異性抗原為AFP (Alpha-Fetoprotein)、GPC 3(Glypican-3)、MAGE 1(Melanoma Associated Gene Family Al) > NY-ESO-I(cancer/ testis antigen)、Aurora-A (serine/threonine protein kinase involved in centrosome formation during mitosis)或 Gankyrin (liver-specific oncoprotein involved in cell cycle regulation)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的具有癌癥特異性免疫反應(yīng)誘導(dǎo)能力的成熟樹(shù)突狀細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述肝癌特異抗原為AFPaipha-Fetoprotein)、GPC 3(Glypican-3) 或 MAGE 1(Melanoma Associated Gene Family Al)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的具有癌癥特異性免疫反應(yīng)誘導(dǎo)能力的成熟樹(shù)突狀細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述肝癌特異抗原是SEQ ID NO :1的AFP氨基酸序列中20-346序列、 SEQ ID NO 2的GPC3氨基酸序列中33-358序列或SEQ ID NO 3的MAGEl氨基酸序列。
7.一種用于預(yù)防或治療癌癥的藥物組合物，其特征在于，包括(a)藥學(xué)有效量的根據(jù)所述權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述方法制備且具有癌癥特異性免疫反應(yīng)誘導(dǎo)能力的成熟樹(shù)突狀細(xì)胞；及，(b)可藥用載體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用于預(yù)防或治療癌癥的藥物組合物，其特征在于，所述癌癥為肝癌。
9.一種用于抑制癌癥轉(zhuǎn)移的藥物組合物，其特征在于，包括(a)藥學(xué)有效量的根據(jù)所述權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述方法制備且具有癌癥特異性免疫反應(yīng)誘導(dǎo)能力的成熟樹(shù)突狀細(xì)胞；及，(b)可藥用載體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的用于抑制癌癥轉(zhuǎn)移的藥物組合物，其特征在于，所述癌癥轉(zhuǎn)移為肝癌的轉(zhuǎn)移。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的用于抑制癌癥轉(zhuǎn)移的藥物組合物，其特征在于，所述肝癌轉(zhuǎn)移為肝癌的肺轉(zhuǎn)移。
12.一種用于預(yù)防或治療癌癥的藥物試劑盒，其特征在于，包括(a)藥物組合物，包括根據(jù)所述權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述方法制備且具有癌癥特異性免疫反應(yīng)誘導(dǎo)能力的成熟樹(shù)突狀細(xì)胞；以及(b)包含以下述化學(xué)式1表示的化合物的組合物。 [化學(xué)式1]
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的用于預(yù)防或治療癌癥的藥物試劑盒，其特征在于，所述癌癥為肝癌。
14.一種用于抑制癌癥轉(zhuǎn)移的藥物試劑盒，其特征在于，包括(a)藥物組合物，包括根據(jù)所述權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述方法制備且具有癌癥特異性免疫反應(yīng)誘導(dǎo)能力的成熟樹(shù)突狀細(xì)胞；及，(b)包含以下述化學(xué)式1表示的化合物的組合物。 [化學(xué)式1]
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的用于抑制癌癥轉(zhuǎn)移的藥物試劑盒，其特征在于，所述癌癥轉(zhuǎn)移為肝癌轉(zhuǎn)移。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的用于抑制癌癥轉(zhuǎn)移的藥物試劑盒，其特征在于，所述肝癌轉(zhuǎn)移為肝癌的肺轉(zhuǎn)移。
17.一種利用樹(shù)突狀細(xì)胞的治療或預(yù)防癌癥方法，其特征在于，包括(a)將根據(jù)所述權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述方法制備且具有癌癥特異性免疫反應(yīng)誘導(dǎo)能力的成熟樹(shù)突狀細(xì)胞給予患癌受試者的步驟；及，(b)在給予成熟樹(shù)突狀細(xì)胞的部位施用包含以下述化學(xué)式1表示的化合物的組合物的步驟；或，(a’ )在欲給予成熟樹(shù)突狀細(xì)胞的患癌受試者的給予部位施用含有以下化學(xué)式1表示的化合物的組合物的步驟；及，(b’ )將根據(jù)所述權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述方法制備且具有癌癥特異性免疫反應(yīng)誘導(dǎo)能力的成熟樹(shù)突狀細(xì)胞給予患癌受試者的步驟。[化學(xué)式1]
18. 一種利用樹(shù)突狀細(xì)胞的抑制癌癥轉(zhuǎn)移方法，其特征在于，包括(a)將根據(jù)所述權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述方法制備且具有癌癥特異性免疫反應(yīng)誘導(dǎo)能力的成熟樹(shù)突狀細(xì)胞給予患癌受試者的步驟；及，(b)在給予所述成熟樹(shù)突狀細(xì)胞的部位施用包含以下述化學(xué)式1表示的化合物的組合物的步驟；或，(a’ )在待給予成熟樹(shù)突狀細(xì)胞的患癌受試者的給予部位施用含有以下化學(xué)式1表示的化合物的組合物的步驟；及，(b’ )將根據(jù)所述權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述方法制備且具有癌癥特異性免疫反應(yīng)誘導(dǎo)能力的成熟樹(shù)突狀細(xì)胞給予患癌受試者的步驟。 [化學(xué)式1]
19.一種利用樹(shù)突狀細(xì)胞的預(yù)防或治療癌癥方法，其特征在于，其包括將通過(guò)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述方法制備的具有癌癥特異性免疫反應(yīng)誘導(dǎo)能力的成熟樹(shù)突狀細(xì)胞給予患癌受試者的步驟。
20.一種利用樹(shù)突狀細(xì)胞的抑制癌癥轉(zhuǎn)移方法，其特征在于，其包括將通過(guò)權(quán)利要求 1至6中任一項(xiàng)所述方法制備的具有癌癥特異性免疫反應(yīng)誘導(dǎo)能力的成熟樹(shù)突狀細(xì)胞給予患癌受試者的步驟。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種誘導(dǎo)癌癥特異免疫反應(yīng)的能力顯著提高的成熟樹(shù)突狀細(xì)胞的制備方法、包括通過(guò)用上述方法制備的成熟樹(shù)突狀細(xì)胞的用于預(yù)防或治療癌癥或者抑制癌癥轉(zhuǎn)移的藥物組合物，以及包括用上述方法制備的成熟樹(shù)突狀細(xì)胞和咪喹莫特的藥物試劑盒。因此，可以制備出癌癥特異性免疫反應(yīng)誘導(dǎo)能力顯著提高且毒性減弱的安全的成熟樹(shù)突狀細(xì)胞。所述成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞可有效預(yù)防或治療癌癥及抑制癌癥轉(zhuǎn)移。在給予所述癌癥特異性成熟樹(shù)突狀細(xì)胞的同時(shí)，用于制備所述藥物試劑盒的咪喹莫特可以改善癌癥免疫治療、預(yù)防或治療癌癥以及抑制癌癥轉(zhuǎn)移。
文檔編號(hào)C12N5/0784GK102439137SQ200980158517
公開(kāi)日2012年5月2日 申請(qǐng)日期2009年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月31日
發(fā)明者尹仙玉, 張瑱我, 成英林, 裴容洙, 閔美璟 申請(qǐng)人:Jw制藥公司