專利名稱：真菌內(nèi)切葡聚糖酶、它們的生產(chǎn)和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的真菌內(nèi)切葡聚糖酶、它們的生產(chǎn)以及用于生產(chǎn)它們的手段。本發(fā)明還涉及包含至少一種新的內(nèi)切葡聚糖酶的酶制劑，以及用其處理纖維素材料的方法。此外，本發(fā)明還涉及包含內(nèi)切葡聚糖酶的去污劑組合物和動物飼料。
背景技術(shù)：
纖維素酶是在工業(yè)中最廣泛使用的酶之一。它們一般應(yīng)用于紡織工業(yè)、去污劑工業(yè)、紙漿和造紙工業(yè)、飼料和食品工業(yè)包括烘焙，以及水解木質(zhì)纖維素材料用于例如生物乙醇生產(chǎn)等中。纖維素酶的實(shí)際用途受到纖維素酶組合物的性質(zhì)的阻礙，所述組合物經(jīng)常是具有各種不同活性和底物特異性的酶的混合物。為此，已進(jìn)行嘗試以獲得只具有所需活性的纖維素酶。每種纖維素酶的獨(dú)特性質(zhì)使得一些酶與其他酶相比更適合于某些目的。在織物處理中，纖維素酶攻擊形成棉纖維的纖維素分子鏈，從而影響織物的特性。近年來，在紡織工業(yè)中，“石洗的”或磨蝕的外觀已成為牛仔布生產(chǎn)商的興趣所在。 傳統(tǒng)的浮石石洗降低織物強(qiáng)度并需要負(fù)擔(dān)洗衣設(shè)備。趨勢已朝向酶法牛仔布精整方法，并且纖維素酶已代替浮石或正與浮石一起使用，為織物提供其所需的“磨損”外觀。受控的酶處理引起對衣物和機(jī)器的較少損傷，并消除了對處置石頭的需要。此外，紡織工業(yè)在生物整理中使用纖維素酶，即用于產(chǎn)生永久改進(jìn)的去起球性以及用于改進(jìn)抗起球性、通過減少細(xì)毛獲得清潔的表面結(jié)構(gòu)、改進(jìn)織物手感例如柔軟性、光滑性和更絲般感受、提高織物的懸垂性和色彩增艷以及增加吸水性。纖維素酶包含表現(xiàn)出纖維素酶活性的催化結(jié)構(gòu)域/核心(CD)。除了催化結(jié)構(gòu)域之外，纖維素酶分子還可以包含一個(gè)或多個(gè)纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)、也稱為糖類結(jié)合結(jié)構(gòu)域 /模塊(CBD/CBM)，其可以位于催化結(jié)構(gòu)域的N-或C-端。CBD具有糖類結(jié)合活性，并且它們促進(jìn)固體底物上的酶作用。催化核心和CBD典型地通過柔性和高度糖基化的接頭區(qū)相連。主要在纖維表面上進(jìn)行攻擊的纖維素酶在用靛藍(lán)染料染色的牛仔布的石洗中特別有用，因?yàn)樵撊玖衔挥诶w維表面上。應(yīng)用于牛仔布處理的纖維素酶通常分為兩大類酸性和中性纖維素酶。酸性纖維素酶典型地在PH 4. 5-5. 5下起作用，而中性纖維素酶在pH 6-8的范圍內(nèi)。當(dāng)用于處理棉織物時(shí)，酸性纖維素酶一般需要比中性纖維素酶更短的洗滌時(shí)間。酸性纖維素酶在生物整理(去起球)以及牛仔布處理(生物石磨)中特別有用。在生物石磨中使用的酸性纖維素酶主要源自于里氏木霉(Trichoderma reesei)(有性型為紅褐肉座菌(Hypocrea jecorina))，中性纖維素酶來自于各種真菌，包括Melanocarpus、腐質(zhì)霉(Humicola)、梭孢殼霉(Thielavia)、毀絲霉(Myceliophthora)、鐮孢霉(Fusarium)、 支頂孢(Acremonium)和金孢(Chrysosporium)屬的真菌(Haakana等，2004)。里氏木霉 (T. reesei)的酶包括例如來自糖苷家族5 (內(nèi)切葡聚糖酶II，EGII)、家族7 (纖維二糖水解酶I，CBHI)和家族12 (內(nèi)切葡聚糖酶III，EGIII ；Ward等，1993)的纖維素酶，中性纖維素酶大多是來自家族45和家族7的內(nèi)切葡聚糖酶(Henrissat，1991 ；Henrissat和Bairoch， 1993)。內(nèi)切葡聚糖酶的廣泛的工業(yè)應(yīng)用范圍已建立起對在所需條件例如pH和溫度范圍下顯示出所需性能的商業(yè)化內(nèi)切葡聚糖酶產(chǎn)品的需求。已經(jīng)描述了被分類為EGII和EGIII 的酸性纖維素酶在尤其是織物處理中的用途。例如，W02007/118935描述了在織物整理中使用Cel5(EGII)酶。EP 586，375B1公開了包含充分表征的木霉菌(Trichoderma spp.) EGIII酶的去污劑組合物，所述酶具有5. 5-6. O的最適pH、7. 2-8. O的pi和23_28kDa的MW。 US2007/0026420描述了獲得與來自里氏木霉的EGIII共有某些保守序列的新酶基因的方法。EGIII樣纖維素酶的性質(zhì)沒有舉例，但是預(yù)計(jì)35°C至65°C范圍內(nèi)的溫度適合于這些酶。大部分工業(yè)用酶在通常約>50°C的升高溫度下工作較好，但是出于節(jié)能原因、更好的色彩牢固度和減少衣物收縮的目的，對在較低溫度水平、即< 50°C例如約30至40°C或甚至20至40°C下具有良好性能的酶存在著需求。這種冷活性酶已在例如細(xì)菌、特別是芽孢桿菌(Bacillus)中描述。然而，對于工業(yè)應(yīng)用來說，生產(chǎn)細(xì)菌酶與生產(chǎn)真菌酶相比復(fù)雜且費(fèi)力。關(guān)于可能的冷活性真菌內(nèi)切葡聚糖酶的了解仍然非常少。因此，對于具有所需性質(zhì)和熱特性的新的、有優(yōu)勢的內(nèi)切葡聚糖酶，存在著持續(xù)不斷的需求。本發(fā)明滿足了這種需求。發(fā)明簡述現(xiàn)在，本發(fā)明提供了具有獨(dú)特的熱和pH特性的新的內(nèi)切葡聚糖酶。獨(dú)特的熱性質(zhì)意味著當(dāng)溫度低于50°C、例如約40°C、約30°C或甚至更低時(shí)，可以觀察到性能沒有顯著降低。內(nèi)切葡聚糖酶可用于不同纖維素酶應(yīng)用中，例如織物處理，特別是牛仔布處理和去起球。與以前描述的典型為酸性纖維素酶的Cel5酶相反，我們發(fā)現(xiàn)了一種在中性pH下具有出色生物石磨效應(yīng)的新的Cel5。這能夠在染色的同時(shí)進(jìn)行生物整理處理，引起相當(dāng)大的節(jié)約。此外，在中性條件下色彩牢固度經(jīng)常更好。本發(fā)明提供了屬于糖基水解酶家族12的新的內(nèi)切葡聚糖酶，即可以源自于木霉屬(Trichoderma)或肉座菌屬(Hypocrea)的EGIII多肽。具體來說，本發(fā)明涉及真菌內(nèi)切葡聚糖酶多肽，其屬于糖基水解酶家族12，并且其包含與SEQ ID NO :62具有至少97%序列同一性、與SEQ ID NO :64具有至少60%序列同一性、與SEQ ID NO :66具有至少85%序列同一性、與SEQ ID NO :68具有至少83%序列同一性或與SEQ ID NO :70具有至少63%序列同一性的氨基酸序列；或其酶活性片段。本發(fā)明還提供了屬于糖基水解酶家族5的內(nèi)切葡聚糖酶，即可以源自于木霉屬 (Trichoderma)或肉座菌屬(Hypocrea)的EGII多肽。具體來說，本發(fā)明涉及真菌內(nèi)切葡聚糖酶多肽，其屬于糖基水解酶家族5，并且其包含與SEQ ID NO :42具有至少77%序列同一性、與SEQ ID NO 44具有至少70%序列同一性、與SEQ ID NO 46具有至少78%序列同一性、與SEQ ID NO 48具有至少70%序列同一性、與SEQ ID NO 50具有至少72%序列同一性、與SEQ ID NO 52具有至少78%序列同一性、與SEQ ID NO 54具有至少94%序列同一性、與SEQ ID NO :56具有至少72%序列同一性、與SEQ ID NO :58具有至少82%序列同一性或與SEQ ID NO :60具有至少73%序列同一性的氨基酸序列，或其酶活性片段。本發(fā)明還提供了屬于糖基水解酶家族5的內(nèi)切葡聚糖酶，即可以源自于木霉屬 (Trichoderma)或肉座菌屬(Hypocrea)之外的其他真菌例如青霉屬(Penicillium)、鐮孢霉屬(Fusarium)或地絲霉屬(Geomyces)的EGII多肽。具體來說，本發(fā)明涉及真菌內(nèi)切葡聚糖酶多肽，其屬于糖基水解酶家族5，并且其包含與SEQ ID NO :72具有至少70%序列同一性、與SEQ ID NO 74具有至少72%序列同一性、與SEQ ID NO 76具有至少72%序列同一性、與SEQ ID NO :78具有至少91%序列同一性、與SEQ ID NO :80具有至少61 %序列同一性或與SEQ ID NO :82具有至少62%序列同一性的氨基酸序列，或其酶活性片段。此外，本發(fā)明涉及包含所述內(nèi)切葡聚糖酶的酶制劑以及包含所述酶或酶制劑的去污劑組合物和動物飼料。本發(fā)明還涉及分離的多核苷酸，其選自a)具有 SEQ ID NO :41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、 75、77、79或81的核苷酸序列，或編碼上述的內(nèi)切葡聚糖酶多肽的序列，b)a)的互補(bǔ)鏈，或c)由于遺傳密碼而與a)或b)的任一序列簡并的序列。本發(fā)明還涉及包含所述多核苷酸的表達(dá)載體、包含所述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞、和帶有所述多核苷酸并具有下列登記號的大腸埃希氏桿菌(E. coli)菌株DSM 19418、DSM 18639、DSM 18638、DSM 19963、DSM 18642、DSM 19419、DSM 19894、DSM 19895、DSM 21129、 DSM 19898、DSM 18640、DSM 18643、DSM 19420、DSM 19899、DSM 19896、DSM 19960、DSM 19961、DSM 18505、DSM 19172、DSM 18914 或 DSM 19962。本發(fā)明還提供了生產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶多肽的方法，所述方法包含下列步驟用編碼所述多肽的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，和在能使所述多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞， 以及任選地回收和純化所述多肽。最后，本發(fā)明提供了用于處理纖維素材料的方法，其中所述方法包含將纖維素材料與本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶多肽或酶制劑相接觸。這種方法的實(shí)例是木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的水解，用于例如生物乙醇生產(chǎn)。在附屬權(quán)利要求書中提出了本發(fā)明的具體實(shí)施方案。從下面的圖、詳細(xì)描述和實(shí)施例，本發(fā)明的其他目的、細(xì)節(jié)和優(yōu)點(diǎn)將變得明顯。然而，應(yīng)該理解，在描述、附圖和實(shí)施例中給出的實(shí)施方案僅僅是出于說明的目的，在權(quán)利要求書的范圍內(nèi)進(jìn)行各種改變和修改是可能的。附圖簡述

圖1是在里氏木霉(Trichoderma reesei)原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化中使用的、用于過量生產(chǎn)重組Cel5或Cel 12蛋白的表達(dá)盒的示意圖。圖 2A)顯示了來自木霉(Trichoderma)或肉座菌(Hypocrea)的重組 Cel5A/EGII 蛋白制劑的最適pH，B)顯示了來自木霉CTrichoderma)的重組Cell2A/EGIII蛋白制劑的最適pH，C)顯示了來自木霉(Trichoderma)之外真菌的重組Cel5A/EGII蛋白制劑的最適 pH，D)顯示了來自木霉(Trichoderma)或肉座菌(Hypocrea)的重組Cel5A/EGII蛋白制劑的熱穩(wěn)定性，E)顯示了來自木霉(Trichoderma)的重組Cell2A/EGIII蛋白制劑的熱穩(wěn)定性，F(xiàn))顯示了來自木霉(Trichoderma)之外真菌的重組EGII/Cel5A蛋白制劑的熱穩(wěn)定性。圖3-5顯示了來自木霉(Trichoderma)的重組Cell2A/EGIII蛋白制劑在牛仔布處理中的溫度輪廓圖。圖6顯示了來自鐮孢霉(Fusarium)的重組Cel5A/EGII蛋白制劑在牛仔布處理中的PH輪廓圖。圖7顯示了重組Cell2制劑(Ts_RF6193_Cell2)與不含酶的對照樣品相比，在 40°C下生物整理(去起毛)處理中的性能。
發(fā)明詳述本發(fā)明是基于在真菌培養(yǎng)物保藏物中篩選低溫纖維素水解活性的研究。使用各種生產(chǎn)培養(yǎng)基將真菌菌株在20°C下培養(yǎng)3-7日?；厥丈锨逡翰⒃?0°C和50°C的溫度下測試對羧甲基纖維素(CMC)和羥乙基纖維素(HEC)的纖維素水解活性，以篩選低溫特性。將最有利的菌株在20°C下培養(yǎng)4-7日后，在小規(guī)模生物石磨應(yīng)用中進(jìn)一步測試。在初步篩選后， 選擇13株菌株進(jìn)行基因組文庫構(gòu)建，并在文庫中進(jìn)一步篩選cel5和cell2。將陽性噬菌體克隆亞克隆到細(xì)菌載體中并通過測序進(jìn)行驗(yàn)證，然后保藏在DSMZ。為了生產(chǎn)Cel5或Cell2 酶，將編碼所需活性的基因融合到里氏木霉(Trichoderma reesei)的cbhl/cel7A啟動子中。通過里氏木霉的cbhl/cel7A終止子確保轉(zhuǎn)錄終止，并使用amdS標(biāo)志物篩選陽性克隆。 從載體骨架分離線性表達(dá)盒，并轉(zhuǎn)化到缺失主要纖維素酶的里氏木霉原生質(zhì)體中。將純化的轉(zhuǎn)化體在纖維素酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)7日，并測試培養(yǎng)上清液的內(nèi)切葡聚糖酶活性。也測試了熱和PH性質(zhì)。用于大規(guī)模應(yīng)用的材料通過實(shí)驗(yàn)室生物反應(yīng)器培養(yǎng)獲得，培養(yǎng)在觀V 下持續(xù)3-4日，然后在需要時(shí)進(jìn)行過濾和濃縮。在洗衣機(jī)中，在不同溫度下的牛仔布處理中對培養(yǎng)上清液進(jìn)行測試，使用一種 Cel5和一種Cell2商業(yè)化制劑作為參比。使用顏色反射率測量來評估得到的生物石磨效應(yīng)。在牛仔布應(yīng)用中，大多數(shù)酶在低溫下也顯示出出色的性能。還發(fā)現(xiàn)酶具有出色或良好的去起球效應(yīng)。意外的是，發(fā)現(xiàn)Cel5酶是中性纖維素酶，這與該纖維素酶家族以前描述的酶相反，已知那些酶是酸性纖維素酶。本發(fā)明提供了在低溫下具有顯著性能的新的真菌Cell2內(nèi)切葡聚糖酶多肽。本發(fā)明還提供了在中性PH下具有出色性能的新的真菌Cel5內(nèi)切葡聚糖酶多肽。當(dāng)在本文中使用時(shí)，“多肽”和“蛋白”是同義詞。在本文中，“真菌的”是指內(nèi)切葡聚糖酶或編碼它的多核苷酸可以源自于真菌、特別是絲狀真菌，例如木霉屬(Trichoderma)、肉座菌屬(Hypocrea)、青霉屬 (Penicillium)、地絲霉屬(Geomyces)或鐮孢霉屬(Fusarium)。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，內(nèi)切葡聚糖酶源自于蓋姆斯木霉(T. gamsii)、紅棕肉座菌/綠色木霉(H.rUfa/ Τ. viridae)、H. atroviridis、哈茨木霉(Τ. harzianum)、可育木霉(Τ. fertile)、擬康寧木霉(H. koningiopsis)、小朿Ij 青霉(P. spinulosum)、灰黃青霉(P. griseofulvum)、 氈狀地絲霉(G.parmorum)或木賊鏈孢霉(F. cf equiseti)。最優(yōu)選，多核苷酸或多肽源自于木霉菌(Thchoderma sp.) RF6193 (CBS 1213 )、蓋姆斯木霉(Trichoderma gamsii) RF6208 (CBS 119563)、紅棕肉座菌 / 綠色木霉(Hypocrea rufa/Trichoderma viride)RF6310(CBS 118970)、Hypocrea atroviridis RF6323 (CBS 119561)、哈茨木霉 (Trichoderma harzianum) RF6482 (CBS 119562)、哈茨木霉 RF6541 (CBS 119957)、可育木霉(Trichoderma fertile) RF6601 (CBS 121357)、擬康寧木霉(Hypocrea koningiopsis) RF6604 (CBS 119960)、小刺青霉(Penicillium spinulosum) RF6286 (CBS 121355)、灰黃青霉(Penicillium griseofulvum) Dierckx RF6288 (CBS 119565)、氈狀地絲霉(Geomyces pannorum) RF6293 (CBS 119567)、氈狀地絲霉 RF6547 (CBS 121356)或木賊鏈孢霉 (Fusarium cf.equiseti)RF6318(CBS 119568)。術(shù)語“源自于”結(jié)合微生物源使用時(shí)，是指多肽可以由所述特定微生物源天然產(chǎn)生，或編碼多肽的多核苷酸可以從所述微生物源分離，并任選地在已導(dǎo)入來自所述微生物源的編碼多肽的多核苷酸的宿主細(xì)胞中表達(dá)。然而，它不排除由例如一個(gè)或幾個(gè)氨基酸/ 核苷酸的取代、缺失和/或插入造成的序列的少量修飾，只要被編碼和分泌的蛋白的酶活性得以保留即可。在本發(fā)明中，“內(nèi)切葡聚糖酶” (“EG”)是指被分類為E. C. 3. 2. 1. 4.的酶。它們是1，4- β -D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶，并催化葡萄糖聚合物例如纖維素中1，4- β -D-糖苷鍵的內(nèi)切水解。一些內(nèi)切葡聚糖酶也可以水解例如還包含1，3-鍵的β-D-葡聚糖中的1， 4-鍵。因此它們也可以被分類為內(nèi)切_1，30)-β-葡聚糖酶(E.C.3.2. 1.6)。因此，酶可以催化幾種底物上的反應(yīng)，并可屬于多個(gè)類別。本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶可以任選包含信號序列以及與催化結(jié)構(gòu)域/核心(CD)相連的一個(gè)或多個(gè)纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)?！疤腔饷讣易?”和“糖基水解酶家族12”是指由Henrissat 1991以及 Henrissat和Bairoch 1993、1996所定義的糖基水解酶家族，所述文獻(xiàn)在此引為參考。編碼屬于糖基水解酶家族5的內(nèi)切葡聚糖酶的基因被稱為cel5或egl2，所編碼的內(nèi)切葡聚糖酶被稱為Cel5或內(nèi)切葡聚糖酶II (EGII)。相應(yīng)地，編碼屬于糖基水解酶家族12的內(nèi)切葡聚糖酶的基因被稱為cell2或egl3，所編碼的內(nèi)切葡聚糖酶被稱為Cell2或內(nèi)切葡聚糖酶 III(EGIII)。一些內(nèi)切葡聚糖酶在低溫下顯示出顯著性能。在本文中，“顯著性能”是指酶當(dāng)應(yīng)用于至少一種類型的纖維素酶應(yīng)用過程例如紡織品的生物石磨和/或生物整理或在洗滌中時(shí)，顯示出出色的性能。本文中使用的“冷活性”或“低溫”是指溫度為=50°C、特別是= 45°〇、優(yōu)選為=40°C并包括=30°C。
序列同序列同序列同序列同序列同序列同序列同序列同序列同序列同序列同
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，內(nèi)切葡聚糖酶包含與SEQ ID N0:42具有至少77%
性、與SEQ ID NO :44具有至少70%序列同-性、與SEQ ID NO 48具有至少70%序列同-性、與SEQ ID NO 52具有至少78%序列同-性、與SEQ ID NO 56具有至少72%序列同-性、與SEQ ID NO 60具有至少73%序列同-性、與SEQ ID NO 64具有至少60%序列同-性、與SEQ ID NO :68具有至少83%序列同-性、與SEQ ID NO :72具有至少70%序列同-性、與SEQ ID NO :76具有至少72%序列同-
性、與SEQ ID NO 46具有至少78% 性、與SEQ ID NO 50具有至少72% 性、與SEQ ID NO 54具有至少94% 性、與SEQ ID NO 58具有至少82% 性、與SEQ ID NO 62具有至少97% 性、與SEQ ID NO 66具有至少85% 性、與SEQ ID NO 70具有至少63% 性、與SEQ ID NO 74具有至少72% 性、與SEQ ID NO 78具有至少91% 性或與SEQ ID N0:82具有至少62%
性、與SEQ ID NO :80具有至少61%序列同-
性的氨基酸序列，或其酶活性片段。優(yōu)選，內(nèi)切葡聚糖酶包含與SEQ ID NO :42,44, 46、48、50、52、56、58、60、64、66、68、70、72、74、76、80 或 82 具有至少 90%、優(yōu)選至少 95%、最優(yōu)選至少98%或99%序列同一性的氨基酸序列、或其酶活性片段；或與SEQ ID NO 54或 78具有至少95%序列同一性、或與SEQ ID NO :54、62或78具有至少98或99%序列同一性的氨基酸序列，或其酶活性片段。 當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語“同一性”是指兩個(gè)互相比較的氨基酸序列之間從相應(yīng)基因編碼的第一個(gè)氨基酸到最后一個(gè)氨基酸的總體同一性。出于本發(fā)明的目的，同一性優(yōu)選利用使用標(biāo)準(zhǔn)算法的已知計(jì)算機(jī)程序來確定。這種程序的實(shí)例是Clone Manager Suite, 該程序包括程序部分 Align Part，并由 Scientific & Educational Software, Durham,
7NC, USA銷售。根據(jù)本發(fā)明，包含了 “兩序列比較/總體/DNA序列比較”(Compare Two Sequences/Global/Compare DNA sequences)功能的禾呈序版本"Clone Manager 7Align Plus 5”對于確定同一性程度來說特別有用。在這種情況下，使用可以從下列來源獲得的算法Hirsctiberg，D. S. (1975)用于計(jì)算最長共同子序列的線性空間算法(A linear space algorithm for computing longest common subsequences), Commun. Assoc. Comput. Mach. 18 :341-343 ；Myers, E. W.和 W. Miller. (1988)線性空間中的最優(yōu)比對(Optimal alignments in linear space)，CABIOS 4:1，11—17 ;Chao，K_M，W. R. Pearson 禾口 W. Miller. (1992)在指定斜角帶內(nèi)比對兩個(gè)序列(Aligning two sequences within a specified diagonal band)，CA-BIOS 8:5，481_487。本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員認(rèn)識到下述事實(shí)，即只有當(dāng)比對序列的相應(yīng)結(jié)構(gòu)域時(shí)，結(jié)果才是可比的。因此，對例如包含CBD或信號序列的纖維素酶序列與缺乏這些元件的序列的比較，由于沒有意義而被排除。“酶活性片段”是指特定氨基酸序列的長得足以具有所需酶活性的部分。換句話說，片段可以只是例如多肽的成熟部分或甚至是成熟部分的子序列。它可以包含或可以不含接頭和CBD結(jié)構(gòu)域。更具體來說，酶活性是指具有水解纖維素或其衍生物的催化能力的纖維素酶活性，例如內(nèi)切葡聚糖酶或β-葡聚糖酶活性。除了內(nèi)切葡聚糖酶和/或β-葡聚糖酶活性之外，一些纖維素酶還可以具有半纖維素酶和/或木聚糖酶活性。酶活性可以如實(shí)施例1中所述來測定。本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA或RNA。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，內(nèi)切葡聚糖酶由具有SEQ ID NO :41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79或 81的多核苷酸或其長得足以編碼酶活性內(nèi)切葡聚糖酶的片段編碼。優(yōu)選，內(nèi)切葡聚糖酶由與大腸埃希氏桿菌(E. coli)DSM 19418,DSM 18639,DSM 18638,DSM 19963,DSM 18642,DSM 19419、DSM 19894、DSM 19895、DSM 21129、DSM 19898、DSM 18640、DSM 18643、DSM 19420、 DSM 19899、DSM 19896、DSM 19960、DSM 19961、DSM 18505、DSM 19172、DSM 18914 或 DSM 19962所攜帶的類似的多核苷酸編碼。本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶優(yōu)選為重組蛋白。它們通過公知的重組DNA技術(shù)在異源或同源宿主中方便地制備。優(yōu)選，內(nèi)切葡聚糖酶在真菌宿主中過表達(dá)。簡單來說，將編碼內(nèi)切葡聚糖酶的多核苷酸克隆并插入到表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中并表達(dá)?！氨磉_(dá)載體”是在轉(zhuǎn)化到所需宿主中后能夠表達(dá)編碼內(nèi)切葡聚糖酶蛋白的DNA的克隆質(zhì)?；蜉d體。當(dāng)使用真菌宿主時(shí)，目標(biāo)基因優(yōu)選作為整合到真菌染色體中或允許目標(biāo)基因整合到宿主染色體中的克隆或表達(dá)載體的一部分提供給真菌宿主。在整合過程中，其他序列作為克隆載體或表達(dá)載體的一部分也可以與所述DNA—起整合。此外，在真菌中，表達(dá)載體或其部分可以定向到預(yù)定的基因座中?；蛘?，所需基因可以作為自主復(fù)制質(zhì)粒提供。編碼內(nèi)切葡聚糖酶蛋白的DNA優(yōu)選置于載體提供的某些控制序列、例如啟動子序列的控制之下(即與其可操作連接)。在轉(zhuǎn)化后，這些控制序列與目標(biāo)序列一起整合到宿主基因組中?；蛘?，控制序列可以是整合位點(diǎn)處的控制序列。表達(dá)載體的表達(dá)控制序列將隨著載體被設(shè)計(jì)用于在原核還是真核宿主中表達(dá)某個(gè)基因而變。表達(dá)控制序列可以含有轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件例如啟動子、增強(qiáng)子元件和轉(zhuǎn)錄終止序列，和/或翻譯調(diào)控元件例如翻譯起始和終止位點(diǎn)。多核苷酸分子例如DNA，如果其包含表達(dá)控制序列，所述序列含有轉(zhuǎn)錄調(diào)控信息并且這些序列與編碼多肽的核苷酸序列可操作連接，則被稱為能夠表達(dá)多肽?？刹僮鬟B接是指這樣的連接，其中一個(gè)序列與調(diào)控序列(或多個(gè)序列)連接的方式是將序列的表達(dá)置于調(diào)控序列的影響或控制之下。兩個(gè)DNA序列(例如啟動子區(qū)序列與蛋白編碼序列的5’末端相連)，如果啟動子的功能引起轉(zhuǎn)錄，則被稱為是可操作連接的。本發(fā)明的載體還可以包含其他可操作連接的調(diào)控元件，例如增強(qiáng)子序列。在優(yōu)選實(shí)施方案中，構(gòu)建了遺傳穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體，其中通過用載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化將編碼蛋白的DNA整合到宿主染色體中，所述載體可以帶有促進(jìn)所述載體整合到染色體中的序列。已在其染色體中穩(wěn)定地整合了編碼內(nèi)切葡聚糖酶蛋白的DNA的細(xì)胞，可以通過例如被導(dǎo)入的同源或異源標(biāo)志物進(jìn)行篩選，所述標(biāo)志物允許篩選在染色體中含有表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，例如標(biāo)志物可以提供殺生物劑抗性，例如對抗生素或重金屬例如銅的抗性，或者標(biāo)志物與宿主染色體中的營養(yǎng)缺陷突變互補(bǔ)等。選擇性標(biāo)志物可以是例如與待表達(dá)的DNA 基因序列直接相連的選擇性基因，或通過共轉(zhuǎn)化導(dǎo)入到相同細(xì)胞中。也可以使用其他篩選系統(tǒng)。在制備了含有內(nèi)切葡聚糖酶編碼DNA的表達(dá)載體后，通過各種適合手段中的任一種，包括本技術(shù)領(lǐng)域已知的轉(zhuǎn)化，將其導(dǎo)入到適合的宿主細(xì)胞中。在轉(zhuǎn)化后，通常將受體細(xì)胞生長在對轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長進(jìn)行選擇的適合的選擇培養(yǎng)基中。適合的表達(dá)和生產(chǎn)宿主系統(tǒng)是例如為真菌宿主木霉(Trichoderma) (EP 244234) 或曲霉(Aspergillus)例如米曲霉(A. oryzae)或黑曲霉(A. niger) (W0 97/08325 和 WO 95/33386，美國專利No. 5，843，745，美國專利No. 5，770，418)開發(fā)的生產(chǎn)系統(tǒng)，或?yàn)殒滄呙?Fusarium)例如尖鏈孢霉(F. oxysporum) (Malardier等，1989)或白腐金孢霉 (Chrysosporium luckowense)開發(fā)的生產(chǎn)系統(tǒng)。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，可以使用部分纖維素酶和/或半纖維素酶和/或蛋白酶缺陷的宿主菌株。為細(xì)菌開發(fā)的適合的生產(chǎn)系統(tǒng)包括為芽孢桿菌(Bacillus)例如枯草芽孢桿菌(B. subtilis)、地衣芽胞桿菌 (B. Iicheniformis)和解淀粉芽孢桿菌(B. amyloliquefaciens)、或?yàn)榇竽c埃希氏桿菌 (E. coli)或?yàn)榉啪€菌鏈霉菌(Sti^ptomyces)開發(fā)的生產(chǎn)系統(tǒng)。為酵母開發(fā)的適合的生產(chǎn)系統(tǒng)是為酵母菌(Saccharomyces)、裂殖酵母(Siizosaccharomyces)、巴斯德畢赤酵母 (Pichia pastoris)或漢遜酵母(Hansenula)開發(fā)的系統(tǒng)。其他微生物包括用于生物乙醇生產(chǎn)的聯(lián)合發(fā)酵微生物、或哺乳動物細(xì)胞或植物中的生產(chǎn)系統(tǒng)，也是可能的。被克隆的基因序列的表達(dá)引起所需蛋白的生產(chǎn)，或該蛋白的片段的生產(chǎn)。在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中發(fā)生這種表達(dá)可以是連續(xù)方式或受控方式。為了獲得本發(fā)明的酶制劑，將具有所需性質(zhì)的宿主(即能夠表達(dá)經(jīng)濟(jì)可行量的內(nèi)切葡聚糖酶蛋白的宿主)在適合條件下培養(yǎng)，并且所需的酶優(yōu)選從宿主分泌到培養(yǎng)基中， 并任選通過本技術(shù)領(lǐng)域已知的方法從所述培養(yǎng)基回收。優(yōu)選，用于這種生產(chǎn)的宿主是絲狀真菌，例如木霉或曲霉，特別是里氏木霉。當(dāng)在本發(fā)明的文本中使用時(shí)，“酶制劑”是指任何酶產(chǎn)品，其包含至少一種本文描述的新的內(nèi)切葡聚糖酶。因此，這樣的酶制劑可以是用過的培養(yǎng)基或?yàn)V液。用過的培養(yǎng)基意味著包含所產(chǎn)生的酶的宿主培養(yǎng)基。優(yōu)選，在生產(chǎn)后將宿主細(xì)胞與所述培養(yǎng)基分離。如果需要，這樣的制劑可以被凍干或者以其它方式對酶活性進(jìn)行濃縮和/或穩(wěn)定化以備儲存。如果需要，可以按照常規(guī)方法例如過濾、提取、沉淀、層析、親和層析、電泳等對所需酶進(jìn)行分離和進(jìn)一步純化。然而，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于含有或不含宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基可以不需進(jìn)一步純化而原樣用作酶制劑，因?yàn)閮?nèi)切葡聚糖酶蛋白可以分泌到培養(yǎng)基中，并且它們在用過的培養(yǎng)基的環(huán)境條件下表現(xiàn)活性。酶制劑的提供和使用非常經(jīng)濟(jì)，因?yàn)椴恍枰獜呐囵B(yǎng)基分離特定的酶。除了一種或多種內(nèi)切葡聚糖酶蛋白之外，酶制劑可以包含一種或多種其他酶，其可以是例如其他纖維素酶、淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶、半纖維素酶、木聚糖酶、果膠酶和/或氧化酶例如漆酶、過氧化物酶和過氧化氫酶?；蛘?，在用內(nèi)切葡聚糖酶蛋白處理之前、期間或之后，可以進(jìn)行另一種酶處理。酶處理可以包含例如一種或多種淀粉酶處理(例如用于牛仔布脫漿)、一種或多種纖維素酶處理和/或一種或多種過氧化物酶和/或漆酶處理。在酶制劑中包含或在酶處理中使用何種其他酶，取決于具體應(yīng)用。除了內(nèi)切葡聚糖酶蛋白之外，酶制劑可以包含添加劑例如穩(wěn)定劑、緩沖劑、防腐劑、表面活性劑和/或培養(yǎng)基組分。優(yōu)選的添加劑是在準(zhǔn)備使用酶制劑的應(yīng)用中，所述酶制劑常用的添加劑。酶制劑可以提供成液體或固體例如干粉或顆粒，特別是未粉化的顆?；蚍€(wěn)定化的液體。設(shè)想了可以將酶制劑進(jìn)一步富集以滿足各種應(yīng)用例如紡織工業(yè)中特定用途的需要。 由宿主分泌的酶活性的混合物在具體的工業(yè)應(yīng)用例如在生物整理和生物石磨中，可能是有利的。內(nèi)切葡聚糖酶蛋白及其制劑可用于例如紡織、飼料和食品例如烘焙應(yīng)用中，用于生物質(zhì)水解例如生物乙醇生產(chǎn)中，以及用于植物油、去污劑和紙漿和造紙工業(yè)中。它們可用于處理任何纖維素材料，例如紡織材料、在食品或動物飼料中使用的植物或植物來源的材料、用于提取油的植物材料或木材來源的機(jī)械或化學(xué)紙漿或次級纖維。它們也可以添加到去污劑中，例如通過抗起球、抗發(fā)灰、色澄清和軟化來改進(jìn)織物護(hù)理性質(zhì)，以及改進(jìn)紡織品清潔效應(yīng)，例如除污垢。去污劑組合物通常還包含助劑，例如表面活性劑(陰離子、非離子、 陽離子和兩性離子表面活性劑)、助潔劑和其他任選的成分，例如抗再沉積和污垢懸浮劑、 熒光增白劑、漂白劑、染料和色素以及水解酶。在本文本中，“纖維素材料”是指任何包含纖維素或其衍生物作為重要組分的材料。將纖維素材料在適合條件例如適合的PH和溫度下與有效量的蛋白相接觸，并允許反應(yīng)持續(xù)足以使酶反應(yīng)發(fā)生的時(shí)間。取決于所使用的具體酶，所述的Cell2內(nèi)切葡聚糖酶優(yōu)選在約20-60°C、更優(yōu)選約30-50°C的溫度范圍內(nèi)使用。有用的溫度可以是=50°C、例如= 45°C或=40°C或甚至=30°C。適合的pH范圍約為2-8，優(yōu)選為約3-6. 5，特別是約4_6。 根據(jù)一個(gè)具體實(shí)施方案，PH為約4. 5-5. 5或約5. 0-5. 5。所述的Cel5內(nèi)切葡聚糖酶在約 30-70°C、優(yōu)選約50-60°C的溫度下和在約2_7、優(yōu)選約4_6、特別是約5_6的pH范圍內(nèi)使用， 源自于鏈孢霉的內(nèi)切葡聚糖酶除外，其優(yōu)選用于PH范圍為約4-10、更優(yōu)選5-8、更加優(yōu)選 6-7、特別是約6. 5并且溫度為50-60°C的應(yīng)用中。內(nèi)切葡聚糖酶在紡織材料例如織物和衣物或紗線的處理中特別有用。紡織材料可以由含天然纖維素的纖維或含人造纖維素的纖維或其混合物、或者合成纖維與含纖維素的纖維的摻合物制成。優(yōu)選，含纖維素的材料是棉、特別是牛仔布。在本發(fā)明中，“牛仔布”是指牛仔布織物，通常是牛仔布衣物，特別是牛仔褲。有利的是，牛仔布是靛藍(lán)染色的牛仔布。牛仔布也可以用靛藍(lán)的衍生物或用靛藍(lán)與一些其他染料一起處理，例如具有底層用硫處理的靛藍(lán)染色的牛仔布。所描述的內(nèi)切葡聚糖酶在紡織工業(yè)、優(yōu)選在生物石磨和生物整理中特別有用。石洗有三個(gè)步驟脫漿、磨蝕和后處理。第一步的脫漿過程通常是牛仔褲的第一次濕法處理，意味著除去通常施加到經(jīng)紗上以防止編織過程中受損的淀粉或其他上漿劑。 α -淀粉酶被用于除去基于淀粉的上漿劑，以改善濕法工藝或使其均勻。在脫漿后，通常將牛仔褲用水漂洗或直接送往磨蝕步驟。第二步磨蝕可以使用酶或浮石或兩者進(jìn)行。在所有情況下都需要機(jī)械作用來除去染料，并且處理通常在洗衣機(jī)例如轉(zhuǎn)筒式洗衣機(jī)中執(zhí)行。術(shù)語“磨蝕的”是指牛仔布織物在被纖維素酶或石頭或兩者處理后的外觀。同義的表述是“石洗外觀”或“磨損外觀”。作為染料移除不均勻的結(jié)果，在有染料區(qū)域與除去染料的區(qū)域之間存在反差。磨蝕后一般進(jìn)行第三步后處理，其包括清洗和漂洗步驟，在此期間可以使用去污劑、熒光增白劑、漂白劑或柔順劑。在酶處理后，應(yīng)該停止反應(yīng)以防止被處理材料的損傷，例如通過溫度和/或PH失活，后者包含充分漂洗和/或去污劑洗除。這確保纖維的機(jī)械強(qiáng)度不受繼續(xù)存在的酶的進(jìn)一步損壞。當(dāng)在本文中使用時(shí)，表述織物或衣物的“生物石磨”是指使用酶代替浮石或與浮石一起處理織物或衣物、特別是牛仔布。正如上面所陳述的，用纖維素酶進(jìn)行的處理能夠完全代替浮石處理。然而，當(dāng)需要產(chǎn)生重度磨蝕的整理時(shí)，也可以將纖維素酶處理與浮石處理相結(jié)合。此外，內(nèi)切葡聚糖酶可用于織物和衣物的生物整理?！吧镎怼?也稱為去起球、 去起毛、去起絨或生物精整)是指在纖維素纖維的受控水解中使用酶來修改織物或紗線表面，以便永久防止起球傾向、改善織物手感例如柔軟度和光滑度、通過減少起毛清潔表面結(jié)構(gòu)以導(dǎo)致顏色澄清，并且還可以改進(jìn)織物的懸垂性、吸水性和可染色性。其他用途包括用于去污劑組合物中，通過抗起球、抗發(fā)灰、顏色澄清和軟化改進(jìn)織物護(hù)理性質(zhì)，以及改進(jìn)織物清潔作用，例如除污垢。酶法去起球可以在織物濕法處理的任何階段執(zhí)行，優(yōu)選在任選的脫漿和/或漂白后執(zhí)行，并可以使用與生物石磨中相似的條件。衣物形式的紡織品也可以進(jìn)行處理。在生物石磨和生物整理二者中，浴比(單位重量的織物的液體體積比率)可以在約3 1至20 1、優(yōu)選5 1至10 1的范圍內(nèi)。處理時(shí)間可以在15分鐘至90分鐘， 優(yōu)選在30分鐘至60分鐘的范圍內(nèi)。應(yīng)該強(qiáng)調(diào)，酶的劑量極大地依賴于織物的類型、機(jī)器、 加工條件(ΡΗ、溫度、浴比、處理時(shí)間、牛仔布載量、加工規(guī)模)和酶制劑的類型等。本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員能夠確定適合的劑量和條件。本發(fā)明的用于處理纖維素材料的方法還涵蓋了木質(zhì)纖維素材料的水解，用于例如生物乙醇生產(chǎn)。在木質(zhì)纖維素材料水解中使用聯(lián)合生物加工(CBP)的一個(gè)實(shí)例由van Zyl 等描述在 Adv Biochem Eng Biotechnol. 2007 ； 108 :205-35 中。通過下面的非限制性實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了進(jìn)一步說明。實(shí)施例1、表現(xiàn)出低溫纖維素水解活性的菌株的篩選對Roal Oy培養(yǎng)物保藏中心(Roal Oy culture collection)的約180株真菌菌株測試了它們產(chǎn)生低溫纖維素水解活性的能力。將真菌菌株在IOOml體積中、在旋轉(zhuǎn)搖床
11(200rpm)上、在20°C的溫度下培養(yǎng)3-7日。測試了含有Solka Floe纖維素作為碳源的幾種生產(chǎn)培養(yǎng)基。在培養(yǎng)后，通過離心收集細(xì)胞和其他固體，并回收上清液。如果不立即使用， 將制備物分成等份，儲存在-20°C下。為了估算在較低溫度下的酶活性，對搖瓶培養(yǎng)制備物在30°C和50°C下進(jìn)行了 1小時(shí)的測定。對所有搖瓶上清液測定了下列活性內(nèi)切葡聚糖酶(CMCase)活性這基本上按照Bailey 和 Nevalainen 1981 ;Haakana 等，2004 所述，使用 3 % (w/ ν)羧甲基纖維素(CMC)作為底物在50mM檸檬酸緩沖液中進(jìn)行測定。還原糖使用DNS試劑測量。測定在PH 5. O和7. O兩種條件下進(jìn)行。內(nèi)切葡聚糖酶(EOT)活性這基本上按照Bailey和Nevalainen 1981所述，使用1 % (w/v)羥乙基纖維素 (HEC)作為底物在50mM檸檬酸緩沖液中進(jìn)行測定。還原糖使用DNS試劑測量。測定在pH 5. 0和7. 0兩種條件下進(jìn)行。將菌株的培養(yǎng)上清液制備物在小規(guī)模生物石洗應(yīng)用中、在LP-2Laimder Ometer中如下所述進(jìn)行測試。將約7. 2g脫漿過的牛仔布樣布(12x12cm)與鋼球一起裝入含有IOOml Mc Ilvaine緩沖液和IOOml培養(yǎng)上清液的1. 2升容器中，并將Launder Ometer在30°CT 運(yùn)行120分鐘。在堿和去污劑洗滌后，將織物樣品用溫水仔細(xì)漂洗并晾干。結(jié)果通過目測和測量顏色作為反射率值(數(shù)據(jù)未顯示)兩者進(jìn)行評估。在初步篩選后，選擇了 13株菌株用于進(jìn)一步的應(yīng)用研究(木霉菌RF6193、蓋姆斯木霉RF6208、紅棕肉座菌/綠色木霉RF6310、Hypocrea atroviridis RF6323、哈茨木霉RF6482和RF6M1、可育木霉RF6601、擬康寧木霉RF6604、小刺青霉RF6^6、灰黃青霉 Dierckx RF6^8、氈狀地絲霉RF6293和RF6M7、以及木賊鏈孢霉RF6318)。為此，將菌株 RF6193在200ml的體積中、在旋轉(zhuǎn)搖床QOOrpm)上、在用5% KH2PO4緩沖的復(fù)雜的基于乳糖的纖維素酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基(Joutsjoki等，199 中、在20°C的溫度下培養(yǎng)7日。將菌株 RF6208、RF6310、RF6547、RF6601 和 RF6604 在 200ml 的體積中、在旋轉(zhuǎn)搖床(200rpm)上、 在20°C的溫度下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)4-7日，所述培養(yǎng)基含有(克/升)Solka Floc纖維素6. 0，小麥麩皮4. 0，來自樺木的木聚糖2. 0，玉米浸出粉1. 0，大豆粉1. 0，刺槐豆膠2. 0， CaCO3 2. 0，(NH4)2HPO4 1. 5，KH2PO4 0. 5，MgSO4 · H2O 0. 5，NaCl 0. 5，微量元素溶液 #1 0. 5， 微量元素溶液#2 0.5，石蠟油0.5 ；將pH調(diào)整至6. 4。微量元素溶液#1 (mg/升)=MnSO4 1. 6，ZnSO4 · H2O 3. 45，CoCl2 · H2O 2. 0 ；微量元素溶液 #2 (mg/ 升)=FeSO4 · H2O 5. 0。將菌株RF6323、RF6482和RF6541在200ml的體積中、在旋轉(zhuǎn)搖床QOOrpm)上、在20°C的溫度下于培養(yǎng)基中培養(yǎng)7日，所述培養(yǎng)基含有(克/升)Solka Floc纖維素10.0，玉米浸出粉 1. 5，大豆粉 0. 5，CaCO3 0. 5，(NH4)2HPO4 1. 5，KH2PO4 2. 0，MgSO4 · H2O 0. 5，NaCl 0. 5，NH4NO3 0. 5, Tween-80 0.5，微量元素溶液#1 0.5，微量元素溶液#2 0. 5，石蠟油0. 5 ；將pH調(diào)整至 6. 4。微量元素溶液 #1 (mg/ 升)=MnSO4 1.6, ZnSO4 · H2O 3. 45，CoCl2 · H2O 2. O ；微量元素溶液 #2 (mg/ 升)=FeSO4 · H2O 5. O。將菌株 RF6288, RF6293 和 RF6318 在 200ml 的體積中、在旋轉(zhuǎn)搖床QOOrpm)上、在20°C的溫度下于培養(yǎng)基中培養(yǎng)4-6日，所述培養(yǎng)基含有(克 / 升)=Solka Floc 纖維素 30. 0，玉米浸出粉 9. 0，大豆粉 1. 5，CaCO3 1. 5，(NH4)2HPO4 4. 5， KH2PO4 6. 0，MgSO4 · H2O 1. 5，NaCl 0. 5，NH4NO3 1. 5，Tween-80 0. 5，微量元素溶液 #1 0. 5，微量元素溶液#2 0.5，石蠟油0.5 ；將pH調(diào)整至6. 4。微量元素溶液#1 (mg/升)=MnSO4 1. 6，ZnSO4 · H2O 3. 45，CoCl2 · H2O 2. 0 ；微量元素溶液 #2 (mg/升)=FeSO4 · H2O 5.0。將菌株 RF6286在200ml的體積中、在旋轉(zhuǎn)搖床QOOrpm)上、在20°C的溫度下于培養(yǎng)基中培養(yǎng)4_6 日，所述培養(yǎng)基含有(克/升)=Solka Floc纖維素18.0，小麥麩皮12.0，來自樺樹的木聚糖 6.0，玉米浸出粉 3.0，大豆粉 3.0，此槐豆膠 6.0，CaC036. O，(NH4)2HPO4 4. 5，KH2PO4 1.5， MgSO4 · H2O 1.5，NaCl 0.5，微量元素溶液#1 0.5，微量元素溶液#2 0. 5，石蠟油0. 5 ；將pH 調(diào)整至 6. 4。微量元素溶液 #1 (mg/ 升)=MnSO4 1. 6，ZnSO4 · H2O 3. 45，CoCl2 · H2O 2. O ；微量元素溶液 #2 (mg/ 升)=FeSO4 · H2O 5. O。實(shí)施例2、從木霉菌RF6193、蓋姆斯木霉RF6208、紅棕肉座菌/綠色木霉RF6310、 Hypocrea atroviridis RF6323、哈茨木霉 RF6482 和 RF6541、可育木霉 RF6601、擬康寧木霉 RF6604、小刺青霉RF6^6、灰黃青霉Dierckx RF6288、氈狀地絲霉RF6293和RF6547、以及木賊鏈孢霉RF6318克隆內(nèi)切葡聚糖酶基因在DNA(質(zhì)粒、DNA片段)的分離和酶處理、在大腸桿菌轉(zhuǎn)化等中使用了標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)方法。使用的基本方法描述在標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)手冊中，例如Sambrook等(1989) 以及 Sambrook 和 Russell (2001)。按照供應(yīng)商的說明書，將木霉菌RF6193、蓋姆斯木霉RF6208、紅棕肉座菌/綠色木霉 RF6310、Hypocrea atroviridis RF6323、哈茨木霉 RF6482 和 RF6M1、可育木霉 RF6601、 擬康寧木霉RF6604、灰黃青霉Dierckx RF6288的基因組文庫制造在Lambda FIX II/Xho I部分填補(bǔ)載體試劑盒Gtratagene，USA)中。將通過Raeder和Broda(1985)的方法分離的染色體DNA用Sau3A部分消化。將消化的DNA按照大小分級，并將所選大小(6-231Λ)的片段填補(bǔ)并連接到》ιοΙ消化的Lambda FIX II載體臂中。使用Gigapack III Gold包裝提取物按照制造商的說明書(StratagenhUSA)對連接混合物進(jìn)行包裝。對于小刺青霉RF6^6、氈狀地絲霉RF6293和RF6M7、以及木賊鏈孢霉RF6318來說，按照供應(yīng)商的說明書使用Lambda DASH II/BamHI載體(Mratagene，USA)來構(gòu)建基因組文庫。將通過Raeder和Broda(1985)的方法分離的染色體DNA用Sau3A部分消化。將消化的DNA按照大小分級，并將所選大小(5-201Λ)的片段連接到BamHI消化的Lambda載體臂中。使用Gigapack III Gold包裝提取物按照制造商的說明書(Stratagene，USA)對連接混合物進(jìn)行包裝。構(gòu)建的基因組文庫的滴度顯示在表1中。表1、構(gòu)建的基因組文庫的滴度
權(quán)利要求
1.一種真菌內(nèi)切葡聚糖酶多肽，其屬于糖基水解酶家族12，并且其包含與SEQ ID NO 64具有至少60%序列同一性、與SEQ ID NO :66具有至少85%序列同一性、與SEQ ID NO: 68具有至少83%序列同一性或與SEQ ID NO 70具有至少63%序列同一性的氨基酸序列， 或其酶活性片段。
2.權(quán)利要求1的內(nèi)切葡聚糖酶多肽，其源自于木霉屬(Trichoderma)或肉座菌屬 (Hypocrea)，優(yōu)選源自于哈茨木霉(T. harzianum)或可育木霉(T. fertile)，最優(yōu)選源自于木霉菌(Trichoderma sp.) RF6193 (CBS1213M)、哈茨木霉 RF6482 (CBS 119562)、哈茨木霉 RF6541 (CBS 119957)或可育木霉 RF6601 (CBS 121357)。
3.權(quán)利要求1的內(nèi)切葡聚糖酶多肽，其與SEQID N0:64、66、68或70具有至少90%、 優(yōu)選至少95%、最優(yōu)選至少98%的序列同一性，或其酶活性片段。
4.權(quán)利要求3的內(nèi)切葡聚糖酶多肽，其具有SEQID NO :64、66、68、70或78的氨基酸序列。
5.一種分離的多核苷酸，其選自a)具有SEQID NO :63、65、67或69的核苷酸序列，或編碼權(quán)利要求1的內(nèi)切葡聚糖酶多肽的序列，b)a)的互補(bǔ)鏈，或c)由于遺傳密碼而與a)或b)的任一序列簡并的序列。
6.權(quán)利要求5的多核苷酸，其與大腸埃希氏桿菌(E.coli) DSM 18643, DSM 19420, DSM 19899或DSM 19896所攜帶的多核苷酸類似。
7.—種表達(dá)載體，其包含權(quán)利要求5的多核苷酸。
8.一種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求7的表達(dá)載體。
9.一種用于生產(chǎn)權(quán)利要求1的內(nèi)切葡聚糖酶多肽的方法，所述方法包含以下步驟用編碼所述多肽的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，和在能使所述多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，以及任選回收和純化所述多肽。
10.一種酶制劑，其包含權(quán)利要求1的內(nèi)切葡聚糖酶多肽。
11.一種用于處理纖維素材料的方法，其中所述方法包含將纖維素材料與權(quán)利要求1 的內(nèi)切葡聚糖酶多肽或權(quán)利要求10的酶制劑相接觸。
12.權(quán)利要求11的方法，其中處理在=50°C、優(yōu)選=40°C的溫度下進(jìn)行。
13.權(quán)利要求12的方法，其在pH約4-6、優(yōu)選pH4.5-5. 5、更優(yōu)選pH5. 0-5. 5下進(jìn)行。
14.權(quán)利要求11的方法，其是生物石磨或生物整理。
15.權(quán)利要求11的方法，其是木質(zhì)纖維素材料的水解或食品應(yīng)用。
16.一種去污劑組合物，其包含權(quán)利要求1的內(nèi)切葡聚糖酶多肽或權(quán)利要求10的酶制劑。
17.一種動物飼料，其包含權(quán)利要求1的內(nèi)切葡聚糖酶多肽或權(quán)利要求10的酶制劑。
18.大腸埃希氏桿菌菌株，其登記號為DSM18643、DSM 19420、DSM 19899或DSM 19896。
全文摘要
本發(fā)明公開了新的真菌內(nèi)切葡聚糖酶Cel5和Cel12。內(nèi)切葡聚糖酶通過重組技術(shù)便利地生產(chǎn)，并描述了用于生產(chǎn)它們的手段。內(nèi)切葡聚糖酶被用于處理纖維素材料，特別是在紡織工業(yè)、例如生物整理或生物石磨中。它們也可用于去污劑、動物飼料和/或紙漿和造紙工業(yè)中，或用于水解木質(zhì)纖維材料以例如生產(chǎn)生物乙醇中。
文檔編號C12N15/56GK102272298SQ200980153611
公開日2011年12月7日 申請日期2009年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月30日
發(fā)明者喬治·紹卡奇, 加里·韋赫曼佩雷, 彭蒂·奧加帕羅, 泰爾?！て绽瓕? 瑪麗卡·阿拉普蘭恩, 莉娜·瓦爾塔卡里 申請人:生化酶股份有限公司