專(zhuān)利名稱(chēng)：用于生成rna病毒的新方法
用于生成RNA病毒的新方法本發(fā)明提供了一種在輔助病毒存在下使用線性表達(dá)構(gòu)建物生成負(fù)鏈區(qū)段化RNA 病毒的方法。
背景技術(shù)：
負(fù)鏈RNA病毒是一組動(dòng)物病毒，其包含數(shù)種重要人類(lèi)病原體，包括流感、麻疹、腮腺炎、狂犬病、呼吸道合胞、埃博拉(mx)la)和漢坦病毒(hantavirus)。這些RNA病毒的基因組可以是單分子的或區(qū)段化的，而且是單鏈(_)極性的。這些病毒共享兩項(xiàng)關(guān)鍵要求它們的基因組RNA必須有效拷貝成病毒RNA，即可用于摻入后代病毒顆粒的形式及轉(zhuǎn)錄成mRNA，其翻譯成病毒蛋白質(zhì)。真核宿主細(xì)胞通常不含用于復(fù)制RNA 模板或用于自負(fù)鏈RNA模板翻譯多肽的機(jī)制。因此，負(fù)鏈RNA病毒編碼并攜帶RNA依賴(lài)性 RNA聚合酶來(lái)催化新基因組RNA (供裝配成后代病毒)和mRNA (供翻譯成病毒蛋白質(zhì))的合成。為了傳播病毒，基因組病毒RNA必須包裝成病毒顆粒。裝配期間發(fā)生的后代病毒顆粒裝配和蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)相互作用的過(guò)程在RNA病毒內(nèi)是相似的。病毒顆粒的形成確保了 RNA基因組自一個(gè)宿主細(xì)胞高效傳播至同一宿主或不同宿主生物體的另一個(gè)宿主細(xì)胞。含有包膜單鏈RNA及負(fù)鏈基因組的病毒科被分成非區(qū)段化基因組的組(副粘病毒科(Paramyxoviridae)、彈狀病毒科(Rhabdoviridae)、纖絲病毒科(Filoviridae)和波爾那病病毒(Borna Disease Virus)、披蓋病毒科(Togaviridae))和具有區(qū)段化基因組的組(正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、本揚(yáng)病毒科(Bunyaviridae)和沙粒病毒科 (Arenaviridae))。正粘病毒科包括甲型、乙型和丙型流感病毒，以及索哥托(Thogoto)和多理(Dhori)病毒和傳染性鮭魚(yú)貧血病毒。流感病毒體由含有單鏈RNA基因組的內(nèi)部核糖核蛋白核心(螺旋狀核殼)和內(nèi)部以基質(zhì)蛋白(Ml)襯里的外部脂蛋白包膜組成。甲型流感病毒的區(qū)段化基因組由8個(gè)分子的線性、負(fù)極性、單鏈RNA組成，它們編碼11種多肽(有些甲型流感株是10種)，包括RNA依賴(lài)性RNA聚合酶蛋白(PB2、PB1和PA)和形成核殼的核蛋白(NP)；基質(zhì)膜蛋白(M1、M2)；兩種自含脂包膜凸出的表面糖蛋白血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)；非結(jié)構(gòu)蛋白(NSl)和核輸出蛋白(NEP)。大多數(shù)甲型流感株還編碼第11種認(rèn)為具有促凋亡特性的蛋白(PB1-F2)。病毒基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制在核中進(jìn)行，而裝配經(jīng)質(zhì)膜上的出芽來(lái)進(jìn)行。病毒在混合感染期間能重配基因。流感病毒經(jīng)HA吸附至細(xì)胞膜糖蛋白和糖脂中的唾液酰寡糖。在對(duì)病毒體的內(nèi)吞之后，細(xì)胞內(nèi)體內(nèi)發(fā)生HA分子的構(gòu)象變化，這促進(jìn)膜融合，如此觸發(fā)脫殼。 核殼遷移至核，在那里病毒mRNA轉(zhuǎn)錄。病毒mRNA被獨(dú)特機(jī)制轉(zhuǎn)錄，其中病毒內(nèi)切核酸酶自細(xì)胞異源mRNA切割帶帽的5'-末端，然后充當(dāng)病毒轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄病毒RNA模板的引物。轉(zhuǎn)錄物在距它們模板末端15至22個(gè)堿基的位點(diǎn)處終止，其中oligo(U)序列起添加poly(A) 串的信號(hào)的作用。在如此生成的八種病毒RNA分子中，六種是單順?lè)醋有畔?，它們直接翻譯成代表HA、NA、NP和病毒聚合酶蛋白PB2、PB1和PA的蛋白質(zhì)。另兩種轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行剪接，各自產(chǎn)生兩種mRNA，它們翻譯成不同讀碼框以生成M1、M2、NS1和NEP。換言之，八種病毒RNA 區(qū)段編碼十一種蛋白質(zhì)九種結(jié)構(gòu)和兩種非結(jié)構(gòu)(NSl和最近鑒定的PB1-F2)蛋白。
針對(duì)流感病毒(尤其是高致病性禽流感病毒)的現(xiàn)代疫苗的生成依賴(lài)于使用反求遺傳學(xué)，其容許自DNA生成流感病毒。用于構(gòu)建負(fù)鏈RNA流感病毒的第一種反求遺傳學(xué)系統(tǒng)涉及轉(zhuǎn)染與體外重建的核糖核蛋白(RNP)復(fù)合物混合的單一病毒基因及隨后感染流感輔助病毒。RNP復(fù)合物通過(guò)將合成的RNA轉(zhuǎn)錄物與自流感病毒純化的NP和聚合酶蛋白 (PBU PB2和PA) —起溫育來(lái)制備，而且使用輔助病毒作為病毒蛋白質(zhì)和其它vRNA的胞內(nèi)來(lái)源(Luytjes et al.，1989，Cell，59，1107-1113)。Neumann et al.，1994，Virology，202，477-479 實(shí)現(xiàn)了自鼠類(lèi) RNA聚合酶 I 啟動(dòng)子響應(yīng)性質(zhì)粒表達(dá)RNA后在流感感染的細(xì)胞中病毒模型RNA的RNP形成。Pleschka et al., 1996，J. Virol.，4188-4192記載了一種方法，其中自基于質(zhì)粒的表達(dá)載體重建RNP復(fù)合物。 病毒RNA樣轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)是自含有截短型人類(lèi)聚合酶I (poll)啟動(dòng)子和通過(guò)自催化切割生成3'末端的核酶序列的質(zhì)粒實(shí)現(xiàn)的。將poll驅(qū)動(dòng)的質(zhì)粒與表達(dá)病毒PB1、PB2、PA和NP蛋白的polll響應(yīng)性質(zhì)粒一起共轉(zhuǎn)染入人類(lèi)293細(xì)胞中。然而，轉(zhuǎn)染效率非常低，大約10個(gè)轉(zhuǎn)染子病毒顆粒每次轉(zhuǎn)染。另外，這種基于質(zhì)粒的策略依賴(lài)于輔助病毒的幫助。在WO 01/04333中，使用一組12種用于表達(dá)基因組VRNA區(qū)段和RNP蛋白質(zhì)的表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建了區(qū)段化負(fù)鏈RNA病毒。WO 01/04333中記載的載體基于公知的pUC19或pUC18 質(zhì)粒。依照說(shuō)明書(shū)，這種系統(tǒng)需要一組8種表達(dá)流感病毒的所有8種區(qū)段的質(zhì)粒以及另一組4種表達(dá)核蛋白和RNA依賴(lài)性RNA聚合酶亞基(PB1、PB2、PA和NP)的質(zhì)粒。WO 00/60050涵蓋一組至少2種含有啟動(dòng)子，可操作連接流感病毒區(qū)段cDNA(PA、 PBU PB2、HA、ΝΡ、ΝΑ、Μ)和連接轉(zhuǎn)錄終止序列的載體，和至少2種含有啟動(dòng)子，可操作連接流感病毒區(qū)段DNA(PA、PB1、PB2、NP)的載體。這種系統(tǒng)試圖通過(guò)使用如下的質(zhì)粒來(lái)克服使用多種不同載體時(shí)的困難，其中用于病毒RNA合成的八種RNA聚合酶I轉(zhuǎn)錄盒組合在一個(gè)質(zhì)粒上。WO 01/83794披露了包含插入RNA聚合酶II (polll)啟動(dòng)子和聚腺苷酸化信號(hào)之間的RNA聚合酶I (poll)啟動(dòng)子和poll終止信號(hào)的環(huán)狀表達(dá)質(zhì)粒。依照本申請(qǐng)，術(shù)語(yǔ)載體描述為質(zhì)粒一般為能接受別的外來(lái)DNA且能容易導(dǎo)入合適宿主細(xì)胞中的雙鏈DNA的獨(dú)立分子。WO 2009/00891記載了一種線性表達(dá)構(gòu)建物及其用于表達(dá)流感病毒基因區(qū)段的用途。Ozawa M. et al，J. Virol，2007，vol. 81，pp. 9556-9559 記載了一種使用腺病毒載體來(lái)生成甲型流感病毒的反求遺傳學(xué)系統(tǒng)。Hoffmann Ε. et al, Virology, 2000, 267, PP. 310-317披露了一種使用雙向轉(zhuǎn)錄構(gòu)建物自一個(gè)模板生成病毒RNA和mRNA來(lái)創(chuàng)建流感病毒的系統(tǒng)。自八種質(zhì)粒挽救乙型流感病毒也披露于Hoffmann et al.，Proc. Natl. Acad. Sci.,2002,99,pp.11411-11416。由病毒病引起的流行和大流行仍在奪走人類(lèi)生命及影響全球經(jīng)濟(jì)。流感對(duì)全世界數(shù)以百萬(wàn)計(jì)的工作日損失和拜訪醫(yī)生、數(shù)以十萬(wàn)計(jì)的住院治療(Couch 1993,Ann. NY. Acad. Sci 685 ;803)、數(shù)以萬(wàn)計(jì)的過(guò)量死亡(Collins &Lehmann 1953Public Health Monographs 213 1 ；Glezen 1982 Am. J. Public Health 77 :712)和數(shù)以十億歐元計(jì)的健康護(hù)理花費(fèi)(Williams et al. 1988, Ann. Intern. Med. 108 616)負(fù)有責(zé)任。當(dāng)健康成年人獲得免疫時(shí)，當(dāng)前可得的疫苗在70-90%的情況中預(yù)防臨床疾病。此水平在65歲以上人中降低至30-70%并在居住于老人之家的65歲以上人中進(jìn)一步下降(Strategic Perspective 2001 :The Antiviral Market. Datamonitor. p. 59)。病毒頻繁的抗原性變化進(jìn)一步促成大量死亡人數(shù)，因?yàn)榧磿r(shí)每年進(jìn)行疫苗接種也不能保證獲得保護(hù)。因此，美國(guó)的死亡人數(shù)自1976/77年的16，363人上升至1998/99年多達(dá)四倍的死亡(Wall Street Journal, Flu-related deaths in US despite vaccine researches. January 7,2003)。尤其在大流行病毒病爆發(fā)的情況中，在疾病爆發(fā)后立即提供疫苗接種或處理會(huì)是極度重要的。鑒于提供對(duì)病毒病的有效保護(hù)和處理的迫切需要，仍然非常需要開(kāi)發(fā)經(jīng)濟(jì)、快速且有效的表達(dá)系統(tǒng)來(lái)生產(chǎn)病毒，這能克服當(dāng)前表達(dá)技術(shù)的缺點(diǎn)和困難及提供病毒表達(dá)的替代方法。通過(guò)提供本申請(qǐng)的實(shí)施方案，實(shí)現(xiàn)了該目的。發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種備選技術(shù)，其中使用線性表達(dá)構(gòu)建物在輔助病毒存在下表達(dá) RNA病毒。令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，在輔助病毒存在下使用至少一種不含任何擴(kuò)增和/或選擇序列、包含插入RNA聚合酶II(polII)啟動(dòng)子和聚腺苷酸化信號(hào)之間的RNA聚合酶I (poll)啟動(dòng)子和poll終止信號(hào)、包含插入poll啟動(dòng)子和poll終止信號(hào)之間的HA或NA基因區(qū)段的線性表達(dá)構(gòu)建物為快速挽救病毒顆粒提供了一種有效工具。與已知技術(shù)使用的方法不同， 不需要細(xì)菌細(xì)胞中的克隆步驟，而且不需要用病毒基因組的所有區(qū)段轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。具體地，只用一種或兩種區(qū)段即編碼HA和/或NA蛋白的基因轉(zhuǎn)染可足以表達(dá)完整病毒。因此， 轉(zhuǎn)染和表達(dá)足夠量的病毒顆粒所需要的時(shí)間可大大縮短。例如，PCT/EP2008/058182(通過(guò)述及而收入本文)中記載的線性表達(dá)構(gòu)建物可用于在輔助病毒存在下開(kāi)發(fā)包含RNA病毒的疫苗，具體是野生型、突變型或重配株的流感病毒。這為在發(fā)生流感流行或大流行的情況中所需要的快速生成任何病毒疫苗提供了一種工具。另外，本發(fā)明為清除輔助病毒提供了一種改良方法，并為改良的選擇和純化提供了具有改良切割位點(diǎn)的HA區(qū)段。附圖
簡(jiǎn)述圖Ia和Ib是示意圖，圖示了線性雙向表達(dá)構(gòu)建物的生成。圖Ia顯示了通過(guò)PCR 擴(kuò)增分開(kāi)生成的片段F1、F2和F3。圖Ib顯示了使用寡核苷酸P4和P6通過(guò)交疊PCR生成的片段F4。發(fā)明詳述本發(fā)明涵蓋一種用于生成負(fù)鏈區(qū)段化RNA病毒的方法，包括下述步驟a)提供不含任何擴(kuò)增和/或選擇序列的線性表達(dá)構(gòu)建物，該構(gòu)建物包含插入RNA 聚合酶II (POlII)啟動(dòng)子和聚腺苷酸化信號(hào)之間的RNA聚合酶I (poll)啟動(dòng)子和poll終止信號(hào)，該構(gòu)建物進(jìn)一步包含插入poll啟動(dòng)子和poll終止信號(hào)之間的HA和/或NA基因區(qū)段，b)用所述線性表達(dá)構(gòu)建物轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，c)用具有輔助病毒HA和/或NA蛋白的輔助病毒感染所述宿主細(xì)胞，d)培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞以擴(kuò)增病毒顆粒，e)選擇如下的病毒顆粒
(i)含有自所述線性表達(dá)構(gòu)建物衍生的HA和/或NA蛋白，但(ii)不含輔助病毒HA和NA蛋白或其區(qū)段，其中所述選擇是基于HA和/或NA蛋白的表型、基因型或抗原性特性，且任選其中輔助病毒HA和NA蛋白的缺失是通過(guò)分析核酸或氨基酸序列來(lái)確定的。更具體的，用于生產(chǎn)負(fù)鏈、區(qū)段化RNA病毒顆粒的方法可包括下述步驟，提供不含擴(kuò)增序列、選擇序列、或擴(kuò)增序列和選擇序列二者的線性表達(dá)構(gòu)建物，其中所述構(gòu)建物包含 RNA聚合酶I (poll)啟動(dòng)子和poll終止信號(hào)，poll啟動(dòng)子和poll終止信號(hào)插入RNA聚合酶 II(polII)啟動(dòng)子和聚腺苷酸化信號(hào)之間，其中所述線性表達(dá)構(gòu)建物進(jìn)一步包含插入poll 啟動(dòng)子和poll終止信號(hào)之間的HA基因區(qū)段、NA基因區(qū)段、或HA基因區(qū)段和NA基因區(qū)段二者；用所述線性表達(dá)構(gòu)建物轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞；用輔助病毒感染所述宿主細(xì)胞，其中所述輔助病毒包含編碼HA蛋白、NA蛋白、或HA蛋白和NA蛋白二者的基因組RNA ；培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，由此生成后代病毒顆粒，其中至少一些所述后代病毒顆粒包含自所述線性表達(dá)構(gòu)建物衍生的HA蛋白或NA蛋白；并在所述后代病毒顆粒中選擇候選病毒顆粒，其中所述候選病毒顆粒i)包含自所述線性表達(dá)構(gòu)建物衍生的HA蛋白且不含自所述輔助病毒衍生的HA蛋白，如果所述線性表達(dá)構(gòu)建物包含HA基因區(qū)段的話；且ii)包含自所述線性表達(dá)構(gòu)建物衍生的NA蛋白且不含自所述輔助病毒衍生的NA 蛋白，如果所述線性表達(dá)構(gòu)建物包含NA基因區(qū)段的話。依照本發(fā)明，用至少一種包含HA或NA基因區(qū)段的線性表達(dá)構(gòu)建物轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。 優(yōu)選地，用至少兩種線性表達(dá)構(gòu)建物轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，其中一種線性構(gòu)建物包含HA基因區(qū)段而另一種線性構(gòu)建物包含NA基因區(qū)段。選擇候選病毒顆粒的步驟可進(jìn)一步包括分析候選病毒顆粒的氨基酸序列以確定候選病毒顆粒不包含輔助病毒的HA氨基酸序列或NA氨基酸序列或分析候選病毒顆粒的核酸分子以確定候選病毒顆粒不包含輔助病毒的HA核苷酸序列或NA核苷酸序列?！熬€性表達(dá)構(gòu)建物”依照本發(fā)明定義為不含任何擴(kuò)增和/或選擇序列，而且包含插入RNA聚合酶II(polII)啟動(dòng)子和聚腺苷酸化信號(hào)之間的RNA聚合酶I(poll)啟動(dòng)子和 poll終止信號(hào)且包含插入poll啟動(dòng)子和poll終止信號(hào)之間的基因區(qū)段。優(yōu)選地，線性表達(dá)構(gòu)建物不含在細(xì)菌細(xì)胞中擴(kuò)增質(zhì)粒所需要的任何選擇或擴(kuò)增序列。不需要含有起點(diǎn)(復(fù)制起點(diǎn))序列或抗生素抗性基因或任何其它選擇標(biāo)志。如果需要的話，可使用短接頭序列來(lái)環(huán)化線性表達(dá)構(gòu)建物。依照本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案，線性表達(dá)構(gòu)建物可包含DNA分子以外的分子， 諸如構(gòu)建物N和/或C端處別的保護(hù)序列。例如，這些保護(hù)序列可以是肽核酸序列(PNA)， 如TO 00/56914中記載的。這些PNA為核酸類(lèi)似物，其中整個(gè)脫氧核糖-磷酸酯骨架用化學(xué)上完全不同但結(jié)構(gòu)上同源的含有2-氨基乙基甘氨酸單元的聚酰胺(肽)骨架置換。PNA “鉗”也顯示出提高穩(wěn)定性，其中通過(guò)含有三個(gè)8-氨基-3，6-二氧心酸單元的柔性發(fā)卡接頭連接兩個(gè)相同的PNA序列。當(dāng)PNA與互補(bǔ)的高嘌呤(homopurine)或高嘧啶 (homopyrimidine) DNA靶序列混合時(shí)，可形成極度穩(wěn)定的PNA-DNA-PNA三元雜合物(Bentin et al. ,1996, Biochemistry,35,8863—8869, Egholm et al. ,1995, Nucleic Acids Res., 23,217-222,Nielsen et al. , Science,1991,254,1497-1500,Demidov et al. ,Proc. Natl.Acad. Sci. , 1995,92, 2637-2641) 它們顯示出對(duì)核酸酶和蛋白酶消化有抗性(Demidov et al.，Biochem. Pharm.，1994，48，1010-1013)。病毒基因區(qū)段可以是所述區(qū)段的cDNA拷貝或 RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。具體地，本發(fā)明提供了一種用于表達(dá)和生產(chǎn)RNA病毒的方法，包括下述步驟a)用包含HA基因區(qū)段的線性表達(dá)構(gòu)建物和/或包含NA基因區(qū)段的線性表達(dá)構(gòu)建物和任選地包含選自PB1、PB2、PA、NS、M、NP的別的基因區(qū)段或至少其部分的線性表達(dá)構(gòu)建物轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，b)用輔助病毒感染所述宿主細(xì)胞，c)培養(yǎng)所述經(jīng)過(guò)感染的宿主細(xì)胞以擴(kuò)增病毒，d)選擇至少含有自所述線性表達(dá)構(gòu)建物衍生的HA和/或NA蛋白的病毒顆粒。所述選擇可基于非輔助病毒起源的HA或NA蛋白的基因型、表型或抗原性特性來(lái)實(shí)施。可使用任何已知區(qū)分包含不同序列、不同表型特征或不同抗原性特征的蛋白質(zhì)的選擇方法。具體地，可使用本發(fā)明中描述的選擇標(biāo)準(zhǔn)。來(lái)自輔助病毒起源和非輔助病毒起源的HA和NA蛋白區(qū)別在于核苷酸和氨基酸序列，因此可使用本領(lǐng)域公知的序列比較方法來(lái)鑒定包含自線性表達(dá)構(gòu)建物衍生的HA或NA序列的病毒。“衍生自”表達(dá)構(gòu)建物或病毒的核酸分子為那些包含表達(dá)構(gòu)建物或病毒的核苷酸序列或互補(bǔ)序列的，而且一般因用于生產(chǎn)該分子的細(xì)胞培養(yǎng)或其它培養(yǎng)基中存在表達(dá)構(gòu)建物或病毒而生成?！把苌浴北磉_(dá)構(gòu)建物或病毒的蛋白質(zhì)為那些自表達(dá)構(gòu)建物或病毒的核苷酸序列或互補(bǔ)序列翻譯的，而且一般因用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的細(xì)胞培養(yǎng)或其它培養(yǎng)基中存在表達(dá)構(gòu)建物或病毒而生成。在使用至少一種線性表達(dá)構(gòu)建物之外，本領(lǐng)域已知的用于實(shí)施反求遺傳學(xué)技術(shù)的質(zhì)?？捎糜诒磉_(dá)病毒蛋白和/或病毒基因組的別的區(qū)段。這些質(zhì)粒記載于例如Hoffmann et al.，Vaccine 2002，2(^25- )，3165-3170，通過(guò)述及而收入本文。具體地，這些表達(dá)質(zhì)粒包含編碼PB1、PB2、PA、NS、ΝΑ、HA、M或NP的區(qū)段或其部分。術(shù)語(yǔ)“HA蛋白和NA蛋白”依照本發(fā)明分別定義為HA或NA蛋白的完整氨基酸序列或所述序列的一部分，其中所述部分足以誘導(dǎo)與野生型HA或NA蛋白產(chǎn)生的應(yīng)答相似或相等的針對(duì)所述HA或NA蛋白的免疫應(yīng)答。優(yōu)選地，HA或NA蛋白包含完整蛋白質(zhì)的HA或NA 氨基酸序的至少70%，優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選至少95%。免疫原性方面的功能性等同物可例如在動(dòng)物模型中測(cè)試(Lu et al.，J. Virol.，1999，5903-5911 或 Boyd M. R. and Beeson Μ. F. , J. Antimicrobial Chemotherapy,1975. 43-47)。輔助病毒為在生成沒(méi)有能力自己復(fù)制的輔助病毒依賴(lài)性病毒載體的拷貝時(shí)使用的病毒。輔助病毒用于與病毒載體一起共感染細(xì)胞并提供復(fù)制病毒載體的基因組所必需的酶。術(shù)語(yǔ)“輔助病毒”定義為任何包含至少一種與要生成的病毒相同的基因區(qū)段且通過(guò)提供生成完整病毒顆粒所需要的至少一種病毒區(qū)段和/或至少一種病毒蛋白質(zhì)能支持病毒生成的病毒。在本發(fā)明的方法中一般在用線性表達(dá)構(gòu)建物轉(zhuǎn)染之后將輔助病毒添加至宿主細(xì)胞，但依照一種備選方法，可在用包含HA和/或NA基因區(qū)段的表達(dá)構(gòu)建物轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞之前為了感染將輔助病毒添加至宿主細(xì)胞?？赏ㄟ^(guò)所述方法來(lái)表達(dá)的RNA病毒可以是任何包含在功能上等同于這些結(jié)構(gòu)的HA和/或NA基因區(qū)段或結(jié)構(gòu)的RNA病毒。術(shù)語(yǔ)“在功能上等同的結(jié)構(gòu)”意指具有受體結(jié)合和融合活性的病毒蛋白質(zhì)。RNA病毒可選自下組流感病毒(具體是甲型、乙型或丙型流感病毒)，冠狀病毒， 呼吸道合胞病毒，新城病病毒。在依照本發(fā)明的方法中可用于培養(yǎng)病毒的細(xì)胞可以是任何期望類(lèi)型的，可以培養(yǎng)且可以被包膜病毒(具體是流感病毒)感染的細(xì)胞。具體地，它可以是BSC-I細(xì)胞、LLC-MK 細(xì)胞、CV-I細(xì)胞、CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞、鼠類(lèi)細(xì)胞、人類(lèi)細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、293細(xì)胞、VERO細(xì)胞、 CEK (雞胚腎)CEF (雞胚成纖維細(xì)胞)、MDBK細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、MDOK細(xì)胞、CRFK細(xì)胞、RAF細(xì)胞、TCMK細(xì)胞、LLC-PK細(xì)胞、PK15細(xì)胞、W1-38細(xì)胞、MRC-5細(xì)胞、T-FLY細(xì)胞、BHK細(xì)胞、 SP2/0細(xì)胞、NS0, PerC6 (人類(lèi)視網(wǎng)膜細(xì)胞)。依照本發(fā)明的方法，可通過(guò)已知方法來(lái)轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，例如通過(guò)電穿孔?？稍诒绢I(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞培養(yǎng)以復(fù)制病毒，特別是直至能檢測(cè)到最大細(xì)胞致病效應(yīng)或最大量的病毒抗原。或者，可在培養(yǎng)期間的任何時(shí)間點(diǎn)收獲。用于培養(yǎng)宿主細(xì)胞的pH可以例如介于6. 5和7. 5之間。用于培養(yǎng)的pH取決于用于培養(yǎng)的宿主細(xì)胞的PH穩(wěn)定性。這可通過(guò)在不同pH條件下測(cè)試宿主細(xì)胞的存活力來(lái)確定。本領(lǐng)域公知，世界衛(wèi)生組織(WHO)每年推薦為針對(duì)流感流行進(jìn)行的一年一度的疫苗接種制備疫苗株中使用的野生型病毒。然后可以將這些株用于生產(chǎn)重配疫苗株，它們一般組合野生型病毒的NA和/或HA基因與自具有某些期望特征的供體病毒(常常稱(chēng)作主供體病毒或MDV)衍生的其余基因區(qū)段。例如，MDV株可以是冷適應(yīng)的和/或溫度敏感的和/ 或減毒的和/或具有高生長(zhǎng)速率。依照本發(fā)明，病毒顆粒優(yōu)選包含為季節(jié)性疫苗接種目的推薦的病毒株或顯示出具有高免疫原性的病毒株(在大流行病毒的情況中)的HA和/或 NA蛋白。對(duì)包含所述表面蛋白的病毒的選擇可基于使所述蛋白質(zhì)有別于輔助病毒起源的 HA和NA蛋白的表型、基因型或抗原性特性。輔助病毒起源的HA和NA蛋白使所述蛋白質(zhì)有別于非輔助病毒起源(像選定病毒)的HA和NA蛋白的表型特性包含例如HA活化的切割位點(diǎn)的差異，或者對(duì)低pH的穩(wěn)定性不同。輔助病毒HA可含有依賴(lài)于與活化疫苗病毒的HA的蛋白酶不同的蛋白酶的蛋白水解活化的切割位點(diǎn)。輔助病毒還可展現(xiàn)比疫苗病毒要低的對(duì)低PH的穩(wěn)定性。對(duì)含有疫苗病毒的HA和NA的病毒的選擇還可基于抗原性特性。通過(guò)使用與疫苗病毒(例如H1N1)不同亞型的輔助病毒(例如H3N2)，可通過(guò)對(duì)輔助病毒亞型(例如H3N2)特異性的抗血清來(lái)遏制輔助病毒的生長(zhǎng)。可用于選擇的基因型特征包括輔助病毒起源的HA和/或NA區(qū)段與非輔助病毒起源的HA和NA蛋白之間的核酸或氨基酸序列差異。用于進(jìn)行序列分析的方法是本領(lǐng)域公知的?；诤塑账嵝蛄胁町?，可以設(shè)計(jì)對(duì)輔助病毒的HA和/或NA特異性的例如 siRNA或反義寡核苷酸。通過(guò)轉(zhuǎn)染這些siRNA或反義寡核苷酸可遏制輔助病毒生長(zhǎng)。一個(gè)選項(xiàng)可以是通過(guò)用不切割輔助病毒起源的HA蛋白但切割并由此活化重配病毒的HA蛋白的蛋白酶處理將包含輔助病毒起源的HA蛋白的病毒顆粒與候選病毒顆粒分開(kāi)。例如，蛋白酶可選自下組胰蛋白酶，彈性蛋白酶，糜蛋白酶，木瓜蛋白酶或嗜熱菌蛋白酶。例如，輔助病毒的HA蛋白可修飾成例如通過(guò)被蛋白酶切割來(lái)活化，其中所述蛋白酶不是胰蛋白酶，而最終的疫苗病毒的HA蛋白被胰蛋白酶切割。由此，提供了一種簡(jiǎn)單且可行的選擇系統(tǒng)。這可通過(guò)修飾切割位點(diǎn)來(lái)實(shí)施?？赏ㄟ^(guò)誘變諸如PCR-誘變來(lái)改變可用作輔助病毒的病毒株的HA區(qū)段以含有受到彈性蛋白酶而非胰蛋白酶蛋白水解活化的切割位點(diǎn)。例如，切割位點(diǎn)周?chē)陌被嵝蛄锌梢允荘SIQPI/GLFGA(切割位點(diǎn)以/指示)。為了使不想要的回復(fù)事件最小化，如下選擇密碼子，即優(yōu)選必須有至少兩處核苷酸變化每個(gè)密碼子以引起回到初始氨基酸的回復(fù)?；蛘?，可通過(guò)提供低pH條件來(lái)將包含輔助病毒起源的HA和NA蛋白的病毒顆粒與包含自線性構(gòu)建物表達(dá)的NA或HA蛋白的候選病毒顆粒分開(kāi)。由于HA蛋白內(nèi)的修飾，在細(xì)胞培養(yǎng)中(具體地在Vero細(xì)胞培養(yǎng)中)培養(yǎng)數(shù)代的病毒顆粒顯示與來(lái)自臨床隔離群的包含野生型HA和/或NA蛋白的株相比降低的對(duì)低pH的穩(wěn)定性。如此，在低pH條件(即介于5. 2和6. 2之間的pH)下處理輔助病毒導(dǎo)致輔助病毒的擴(kuò)增速率降低，并因此導(dǎo)致對(duì)包含未修飾HA和/或NA蛋白的候選病毒顆粒的選擇。作為本發(fā)明的又一個(gè)備選實(shí)施方案，通過(guò)用含有中和或結(jié)合輔助病毒起源的HA 和/或NA蛋白的抗體的抗血清處理，將包含所述輔助病毒起源的HA和/或NA蛋白的病毒顆粒與候選病毒顆粒分開(kāi)。還可依照本發(fā)明實(shí)施不同方法的組合來(lái)清除不想要的HA和NA蛋白。依照本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案，輔助病毒顆?？砂c野生型病毒的NA蛋白相比活性降低的NA蛋白。在這個(gè)實(shí)施方案中，輔助病毒可缺少功能性NA蛋白，即使病毒能自宿主細(xì)胞釋放的NA蛋白，或者可完全缺少NA蛋白。依照又一個(gè)備選實(shí)施方案，輔助病毒包含丙型流感病毒起源的HEF蛋白。丙型流感病毒只有一種主要表面糖蛋白，即HEF (血凝素酯酶融合物)，其在功能上等同于HA蛋白。HEF蛋白可例如用胰蛋白酶或TPCK胰蛋白酶來(lái)活化(Gao et al. , J.Virol. ,2008, 6419-6426，通過(guò)述及而收入本文)?；蛘撸景l(fā)明具體要求保護(hù)如下的經(jīng)過(guò)修飾的流感病毒，其包含可通過(guò)引入外來(lái)蛋白酶切割位點(diǎn)(例如彈性蛋白酶切割位點(diǎn))來(lái)修飾的病毒糖蛋白。作為本發(fā)明的另一種備選實(shí)施方案，通過(guò)用中和或結(jié)合輔助病毒起源的HEF蛋白的抗體處理來(lái)清除包含所述HEF蛋白的病毒顆粒。作為另一種備選，輔助病毒可包含冠狀病毒的HA蛋白。在生產(chǎn)甲型流感病毒的情況中，或者，可使用來(lái)自B型流感起源的HA和/或NA蛋白。用于疫苗生產(chǎn)的病毒以及輔助病毒可具體是流感病毒起源的，更具體地，它可以是減毒型流感病毒。依照一個(gè)具體的實(shí)施方案，流感病毒是減毒型流感病毒。具體地，流感病毒在抑制宿主細(xì)胞的先天性免疫應(yīng)答的病原性因子內(nèi)包含刪除或修飾。例如，減毒可衍生自冷適應(yīng)病毒株或由于NSl基因內(nèi)的刪除或修飾(ANSI病毒)，如W099/64571和W099/64068中記載的，通過(guò)述及而完整收入本文?！靶揎棥鄙婕芭c野生型NSl序列相比替代或刪除一個(gè)或多個(gè)核酸。NS基因內(nèi)的修飾可產(chǎn)生在干擾素勝任(competent)細(xì)胞中生長(zhǎng)缺陷的病毒顆粒。 生長(zhǎng)缺陷意味著這些病毒復(fù)制缺陷，因?yàn)樗鼈冊(cè)趧?dòng)物的呼吸道中進(jìn)行中斷的復(fù)制?；蛘?，病毒可包含PB1-F2基因的刪除或修飾。依照本發(fā)明的方法可具體用于生成包含功能性NSl 蛋白的刪除的流感病毒。
依照本發(fā)明，輔助病毒可含有至少4種、優(yōu)選至少5種、優(yōu)選6種與待生成的病毒相同的區(qū)段。具體地，這些區(qū)段是？81、？82、？々、呢、] 、賂。輔助病毒可通過(guò)已知的反求遺傳學(xué)技術(shù)或通過(guò)替代技術(shù)像病毒重配來(lái)生成。術(shù)語(yǔ)“重配株(reassortant) ”在提及病毒時(shí)指示病毒包括自超過(guò)一種親本病毒株或來(lái)源衍生的遺傳和/或多肽成分。例如，7 1重配株包括7種自第一親本病毒衍生的病毒基因組區(qū)段(或基因區(qū)段)和1種來(lái)自第二親本病毒的補(bǔ)充性病毒基因組區(qū)段，例如編碼血凝素或神經(jīng)氨酸酶。6 2重配株包括6種來(lái)自第一親本病毒的基因組區(qū)段(最常見(jiàn)的是6種內(nèi)部基因)和2種來(lái)自不同親本病毒的補(bǔ)充性區(qū)段(例如血凝素和神經(jīng)氨酸酶)。Egorov et al.，1998 J. Virol. 1998 Aug ；72 (8) :6437-41 ；Egorov et al. , Vopr. Virusol. ,39 :201-205記載了一種用于生成包含NSl刪除的輔助病毒的方法。由此，使用在NS基因內(nèi)包含溫度敏感性突變Hl甲型流感病毒作為基礎(chǔ)病毒，進(jìn)一步修飾以產(chǎn)生只能在干擾素缺陷細(xì)胞中生長(zhǎng)的完全刪除的NS基因。本發(fā)明還涵蓋包含序列PSIQPIGLFGA(SEQ ID NO. 7)的HA多肽。本發(fā)明還涵蓋包含下述序列的HA核苷酸序列或其片段AGCAAAAGCAGGGGAAAATAAAAACAACCAAAATGAAAGCAAAACTACTGGTCCTGTTATGTACATTTA CAGCTACATATGCAGACACAATATGTATAGGCTACCATGCCAACAACTCAACCGACACTGTTGACACAGTACTTGAG AAGAATGTGACAGTGACACACTCTGTCAACCTACTTGAGGACAGTCACAATGGAAAACTATGTCTACTAAAAGGAAT AGCCCCACTACAATTGGGTAATTGCAGCGTTGCCGGATGGATCTTAGGAAACCCAGAATGCGAATTACTGATTTCCA AGGAATCATGGTCCTACATTGTAGAAACACCAAATCCTGAGAATGGAACATGTTACCCAGGGTATTTCGCCGACTAT GAGGAACTGAGGGAGCAATTGAGTTCAGTATCTTCATTTGAGAGATTCGAAATATTCCCCAAAGAAAGCTCATGGCC CAACCACACCGTAACCGGAGTATCAGCATCATGCTCCCATAATGGGAAAAGCAGTTTTTACAGAAATTTGCTATGGC TGACGGGGAAGAATGGTTTGTACCCAAACCTGAGCAAGTCCTATGTAAACAACAAAGAGAAAGAAGTCCTTGTACTA TGGGGTGTTCATCACCCGCCTAACATAGGGAACCAAAGGGCCCTCTATCATACAGAAAATGCTTATGTCTCTGTAGT GTCTTCACATTATAGCAGAAGATTCACCCCAGAAATAGCCAAAAGACCCAAAGTAAGAGATCAGGAAGGAAGAATCA ACTACTACTGGACTCTGCTGGAACCTGGGGATACAATAATATTTGAGGCAAATGGAAATCTAATAGCGCCATGGTAT GCTTTTGCACTGAGTAGAGGCTTTGGATCAGGAATCATCACCTCAAATGCACCAATGGATGAATGTGATGCGAAGTG TCAAACACCTCAGGGAGCTATAAACAGCAGTCTTCCTTTCCAGAATGTACACCCAGTCACAATAGGAGAGTGTCCAA AGTATGTCAGGAGTGCAAAATTAAGGATGGTTACAGGACTAAGGAACATCCCATCCATTCAACCCATTGGTTTGTTT GGAGCCATTGCCGGTTTCATTGAAGGGGGGTGGACTGGAATGGTAGATGGGTGGTATGGTTATCATCATCAGAATGA GCAAGGATCTGGCTATGCTGCAGATCAAAAAAGTACACAAAATGCCATTAACGGGATTACAAACAAGGTGAATTCTG TAATTGAGAAAATGAACACTCAATTCACAGCTGTGGGCAAAGAATTCAACAAATTGGAAAGAAGGATGGAAAACTTA AATAAAAAAGTTGATGATGGGTTTCTAGACATTTGGACATATAATGCAGAATTGTTGGTTCTACTGGAAAATGAAAG GACTTTGGATTTCCATGACTTCAATGTGAAGAATCTGTATGAGAAAGTAAAAAGCCAATTAAAGAATAATGCCAAAG AAATAGGAAACGGGTGTTTTGAATTCTATCACAAGTGTAACAATGAATGCATGGAGAGTGTGAAAAATGGAACTTAT GACTATCCAAAATATTCCGAAGAATCAAAGTTAAACAGGGAGAAAATTGATGGAGTGAAATTGGAATCAATGGGAGT CTATCAGATTCTGGCGATCTACTCAACTGTCGCCAGTTCCCTGGTTCTTTTGGTCTCCCTGGGGGCAATCAGCTTCT GGATGTGTTCCAATGGGTCTTTGCAGTGTAGAATATGCATCTGAGACCAGAATTTCAGAAATATAAGAAAAAACACC CTTGTTTCTACT(SEQ ID NO. 8) 特別地，本發(fā)明包括包含下述序列的HA核苷酸序列5' -CCATCCATTCAACCCATTGGTTTGTTTGGAGCC-3 ‘ (SEQ ID NO. 9) 實(shí)施例實(shí)施例1 生成線性H3N2HA表達(dá)構(gòu)建物使用寡核苷酸Pl和P2PCR擴(kuò)增Vero細(xì)胞培養(yǎng)物衍生的甲型流感H3N2病毒的HA 區(qū)段(圖Ia中的F1)。隨后，通過(guò)交疊PCR將兩種自pHW2000 (Hoffmann et al. 2000,Proc Natl Acad Sci U S Α. 97 :6108-13)衍生的 DNA 片段(圖 1 中的 F2 禾Π F3)融合至 HA PCR 產(chǎn)物(見(jiàn)圖lb)。第一種DNA片段(F2)包含CMV啟動(dòng)子和Poll終止子，第二種片段(F3) 包含人類(lèi)Poll啟動(dòng)子和BGH polyA信號(hào)。為了便于生成交疊PCR產(chǎn)物，用于HA擴(kuò)增的寡核苷酸在它們的5’端延伸，使得Pl含有與Poll終止子互補(bǔ)的序列，而P2含有與Poll啟動(dòng)子互補(bǔ)的序列(見(jiàn)圖la)。類(lèi)似地，用于生成片段Fl和F2的引物P3和P5在它們的5’ 端延伸以含有與HA的5，和3，端互補(bǔ)的序列(見(jiàn)圖la)。片段F2和F3含有自pHW2000骨架中描述的序列衍生的保護(hù)序列。這些序列不直接涉及mRNA和vRNA的轉(zhuǎn)錄但降低外切核酸酶對(duì)雙向表達(dá)盒的降解。使用Qiagen ViralAmp試劑盒自Vero細(xì)胞培養(yǎng)物衍生的甲型流感H3N2病毒提取病毒RNA并如先前所述使用Unil2寡核苷酸逆轉(zhuǎn)錄(HofTmarm et al. 2001, Arch Virol. 146 :2275-89)。使用Pfu Turbo DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶的混合物用表1所示寡核苷酸擴(kuò)增HA區(qū)段表 1
Ply-CGPJ^GTTGGGGGGGAGCAAAAGCAGGGGATAATTCTATTAAC-y (SEQ ID No. 1)P25，-GCCGCCGGGTTATX4 GTA GAAA CAA GGGTGTTTTTAATTAATGC-3 ‘ (SEQ ID No. 2)與H3序列對(duì)應(yīng)的核苷酸顯示為斜體、粗體字母，與Poll終止子(Pl)和Poll啟動(dòng)子(P》同源的核苷酸顯示為標(biāo)準(zhǔn)大寫(xiě)字母。使用Qiaquick PCR 純化試劑盒 ^jiagen)純化 HA F4PCR 產(chǎn)物。使用 Pfu Turbo DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶的混合物分別用引物對(duì)P3+P4和P5+P6 (見(jiàn)表2和圖la)自 PHW2000質(zhì)粒DNA擴(kuò)增PCR片段F2和F3。使用QIAquick PCR純化試劑盒(Qiagen)純化 PCR產(chǎn)物F2禾口 F3。表2
P35'-CCrGCJJrr(7CrCCCCCCCAACTTCGGAGGTC-3' (SEQ ID No. 3)P45'-GGGGTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATAC-3' (SEQ ID No. 4)P55'-CCJr^JrrCJ/4CrAATAACCCGGCGGCCCAAAATGC-3' (SEQ ID
權(quán)利要求
1.一種用于生成負(fù)鏈區(qū)段化RNA病毒的方法，包括下述步驟a)提供不含任何擴(kuò)增和/或選擇序列的線性表達(dá)構(gòu)建物，該構(gòu)建物包含插入RNA聚合酶II (polll)啟動(dòng)子和聚腺苷酸化信號(hào)之間的RNA聚合酶I (poll)啟動(dòng)子和poll終止信號(hào)，該構(gòu)建物進(jìn)一步包含插入poll啟動(dòng)子和poll終止信號(hào)之間的HA和/或NA基因區(qū)段，b)用所述線性表達(dá)構(gòu)建物轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，c)用具有輔助病毒HA和/或NA蛋白的輔助病毒感染所述宿主細(xì)胞，d)培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞以擴(kuò)增病毒顆粒，e)選擇如下的病毒顆粒(i)含有自所述線性表達(dá)構(gòu)建物衍生的HA和/或NA蛋白，但( )不含輔助病毒HA和NA蛋白或其區(qū)段，其中所述選擇是基于HA和/或NA蛋白的表型、基因型或抗原性特性，且任選f)其中輔助病毒HA和NA蛋白的缺失是通過(guò)分析核酸或氨基酸序列來(lái)確定的。
2.依照權(quán)利要求1的方法，其中用編碼選自下組的蛋白質(zhì)的線性構(gòu)建物轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞:PB1, PB2, PA, NS, M，禾口 NP。
3.依照權(quán)利要求1或2任一項(xiàng)的方法，其中通過(guò)用蛋白酶處理后代病毒顆粒將包含自輔助病毒衍生的HA蛋白的后代病毒顆粒與候選病毒顆粒分開(kāi)，且其中所述蛋白酶不切割自輔助病毒衍生的HA蛋白但切割候選病毒顆粒的HA蛋白。
4.依照權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)的方法，其中所述蛋白酶選自下組胰蛋白酶，彈性蛋白酶，糜蛋白酶，木瓜蛋白酶。
5.依照權(quán)利要求1或2的方法，其中輔助病毒的HA蛋白經(jīng)修飾可被蛋白酶切割，其中所述蛋白酶不是胰蛋白酶。
6.依照權(quán)利要求1或3的方法，其中通過(guò)提供低PH條件將包含輔助病毒起源的HA和 NA蛋白的后代病毒顆粒與候選病毒顆粒分開(kāi)。
7.依照權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)的方法，其中將包含輔助病毒起源的HA和/或NA蛋白的后代病毒顆粒與候選病毒顆粒分開(kāi)，這是通過(guò)使后代病毒與結(jié)合所述HA和/或NA蛋白的抗體接觸來(lái)進(jìn)行的。
8.依照權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)的方法，其中所述輔助病毒顆粒包含活性降低的NA蛋白或缺少功能性NA蛋白。
9.依照權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)的方法，其中所述輔助病毒包含丙型流感病毒的HEF蛋白。
10.依照權(quán)利要求9的方法，其中所述輔助病毒的HEF蛋白經(jīng)修飾可被蛋白酶切割，其中所述蛋白酶不是胰蛋白酶。
11.依照權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)的方法，其中所述輔助病毒包含冠狀病毒的HA蛋白。
12.依照權(quán)利要求1至11任一項(xiàng)的方法，其中所述病毒顆粒是流感病毒顆粒。
13.依照權(quán)利要求1至12任一項(xiàng)的方法，其中所述病毒顆粒是減毒流感病毒顆粒。
14.依照權(quán)利要求1至13任一項(xiàng)的方法，其中所述病毒在NSl基因內(nèi)包含刪除或修飾。
15.依照權(quán)利要求1至14任一項(xiàng)的方法，其中所述輔助病毒包含修飾或刪除的NS基因且在干擾素勝任細(xì)胞中生長(zhǎng)缺陷。
16.依照權(quán)利要求1至15任一項(xiàng)的方法，其中所述輔助病毒包含至少4個(gè)、優(yōu)選至少5個(gè)、優(yōu)選6個(gè)與待生成的病毒相同的區(qū)段。
17.一種HA多肽片段，其包含下述序列PSIQPIGLFGA(SEQ ID NO. 7)。
18.一種 HA 核苷酸序列片段，其包含序列 CCATCCATTCAACCCATTGGTTTGTTTGGAGCC(SEQ ID NO. 9)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種在輔助病毒存在下使用線性表達(dá)構(gòu)建物生成負(fù)鏈區(qū)段化RNA病毒的方法。
文檔編號(hào)C12N15/09GK102239250SQ200980148635
公開(kāi)日2011年11月9日 申請(qǐng)日期2009年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月3日
發(fā)明者安德里杰·埃戈羅夫, 托馬斯·馬斯特, 馬庫(kù)斯·沃爾謝克 申請(qǐng)人:阿維爾綠山生物技術(shù)研究發(fā)展貿(mào)易股份公司