專利名稱：用于改善反芻動(dòng)物健康和/或性能的菌株和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)涉及用于控制酸中毒的菌株和方法。更具體地，本申請(qǐng)涉及用于改善反芻動(dòng)物健康和/或性能的細(xì)菌菌株以及制備和使用所述菌株的方法。相關(guān)背景描述在過去的50年間給反芻動(dòng)物飼喂高濃度的可發(fā)酵碳水化合物已經(jīng)成為在牛肉和乳牛エ業(yè)中常見的實(shí)踐。改善肉的生產(chǎn)效率和品質(zhì)的需求導(dǎo)致了這種趨勢(shì)。還沒有在不存在某些困難的情況下出現(xiàn)生產(chǎn)的改善。通過飼喂較高水平的谷物増加反芻動(dòng)物對(duì)可發(fā)酵碳水化合物的消耗導(dǎo)致了諸如酸中毒的代謝疾患的發(fā)病率増加。高度濃縮物的消耗和瘤胃酸中毒之間的關(guān)系已在綜述中得到很好地證明(Dunlop，1972 ；Slyter，1976)。許多研究者已顯示在高水平的可迅速發(fā)酵碳水化合物(RFC)飼喂給牛之后，瘤胃pH降低，并且隨后在動(dòng)物中出現(xiàn)瘤胃微生物群破壞和生理改變(Allison，等人，1975 ；Hungate等人，1952 ；Elam, 1976)。大多數(shù)研究者將這種降低歸因于由瘤胃細(xì)菌如牛鏈球菌(Streptococcus bovis) 的有機(jī)酸過量產(chǎn)生。然而，過量碳水化合物對(duì)瘤胃微生物群起始這種反應(yīng)的作用還沒有很好地被證明。在過去，飼喂的精細(xì)管理是對(duì)抗酸中毒的唯一方法。更具體地，用粗糧稀釋谷物并且以逐步方法仔細(xì)控制飲食濃度百分比的増加以確保在14-21天的期間內(nèi)平穩(wěn)過渡至高濃度水平。大多數(shù)商業(yè)飼育場(chǎng)配制并制造含有不同比例的谷物與飼料的幾種“適應(yīng)”飲食。盡管精細(xì)飼喂管理在控制酸中毒方面通常很有效，但由于生產(chǎn)、運(yùn)輸、斬?cái)囡暳稀?處置增加的動(dòng)物廢物的高成本以及降低的生產(chǎn)效率，其對(duì)生產(chǎn)者來說極為昂貴。生產(chǎn)者和商業(yè)飼育場(chǎng)管理者需要容許有效生產(chǎn)飼喂家畜的高濃縮定額食物(ration)的執(zhí)行性策略。其他策略結(jié)合了適應(yīng)飲食的使用與飼喂抗微生物組分，如離子載運(yùn)體。離子載運(yùn)體通過降低革蘭氏陽性的、產(chǎn)乳酸生物體如牛鏈球菌和乳酸桿菌(LactcAacillus spp.)的瘤胃群體來抑制攝入并降低瘤胃中乳酸的產(chǎn)生(Muir等人1981)。盡管離子載運(yùn)體的使用降低了飼育場(chǎng)中急性酸中毒的發(fā)病率，但消費(fèi)者關(guān)注肉類生產(chǎn)中抗生素的使用并且飼育場(chǎng)管理者繼續(xù)尋找降低成本同時(shí)改善動(dòng)物性能和屠體組成的需要導(dǎo)致了降低酸中毒并改善飼育場(chǎng)牛性能的替代性方法的研究。使用直接飼喂微生物作為調(diào)節(jié)瘤胃功能并改善牛性能的方法在過去10年得到更多贊同。有兩種目前用于牛肉ェ業(yè)來控制瘤胃酸中毒的基本的直接飼喂微生物技術(shù)(1)使用產(chǎn)乳酸DFM技術(shù)和( 添加能夠利用瘤胃乳酸的特定細(xì)菌物種。盡管這些技術(shù)的每一個(gè)的報(bào)道的作用模式不同，但它們都試圖解決瘤胃乳酸積累的問題。第一種方法，S卩，使用產(chǎn)乳酸DFM技術(shù)，試圖通過刺激天然瘤胃微生物群來增加瘤胃乳酸利用率。如所報(bào)道的，相對(duì)緩慢生長(zhǎng)的產(chǎn)乳酸菌如腸球菌(Enterococcus)物種的添加產(chǎn)生了輕微升高的瘤胃乳酸濃度。這種逐步的增加迫使瘤胃微生物群適應(yīng)性改變?yōu)檩^高比例的酸耐受乳酸利用者。然而，這些腸球菌菌株不能充分地控制并防止酸中毒。第二種方法，S卩，添加能夠利用瘤胃乳酸的特定細(xì)菌物種，是基于在大量可迅速發(fā)酵的碳水化合物(RFC)的酸中毒攻擊期間顯著將瘤胃乳酸積累最小化的丙酸桿菌 (Propionibacterium)物種的發(fā)現(xiàn)。丙酸桿菌是在乳牛和肉牛二者的瘤胃的天然習(xí)居菌 (inhabitant)并且在瘤胃中通過利用乳酸產(chǎn)生重要的揮發(fā)性脂肪酸如乙酸和丙酸來起作用。目前開發(fā)的最新DFM技術(shù)是基于瘤胃中酸中毒發(fā)病率的陳舊微生物理解開發(fā)的。 直到最近，研究瘤胃微生物生態(tài)學(xué)的方法依賴于培養(yǎng)技術(shù)。這些技術(shù)由于未知的生長(zhǎng)需求和對(duì)于許多瘤胃微生物不合適的厭氧條件而受到限制。因此，依賴于這些培養(yǎng)技術(shù)的生態(tài)學(xué)研究是基于對(duì)瘤胃微生物群的有限理解。當(dāng)前的DFM在單獨(dú)使用或與酵母一起使用來最小化瘤胃酸中毒的風(fēng)險(xiǎn)并改善含有高濃縮物的飼育場(chǎng)牛飲食的利用時(shí)提供混合的結(jié)果。然而，單獨(dú)飼喂或與酵母釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)組合飼喂的DFM菌株丙酸桿菌P15、和屎腸球菌 (Enterococcus faecium)EF212和屎腸球菌(E. faecium)EF212的研究表明，與酵母組合或不與酵母組合的DFM的添加對(duì)防止瘤胃酸中毒沒有作用(Yang，W.，2004)。根據(jù)上述，將期望提供預(yù)防和/或治療酸中毒的一種或多種菌株。如果所述一種或多種菌株還改善反芻動(dòng)物健康和/或性能的其他量度，則將是有利的。還期望的是提供制備和使用所述菌株的方法。發(fā)明概述由本公開內(nèi)容最后所列出的權(quán)利要求書所界定的本發(fā)明旨在解決至少一些上述問題。提供了分離的菌株，包括屎腸球菌菌株8G-1(NRRLB-50173)、具有屎腸球菌菌株 8G-1 (NRRL B-50173)的所有鑒定特征的菌株、屎腸球菌菌株8G-73 (NRRL B-50172)、具有屎腸球菌菌株8G-73(NRRL B-50172)的所有鑒定特征的菌株、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)菌株 8G-134(NRRL B-50174)、具有短小芽孢桿菌菌株 8G-134(NRRL B-50174)的所有鑒定特征的菌株、以及它們的組合。還提供了包括上面所列菌株的一種或多種與莫能菌素的組合物。還提供了將有效量的上面所列菌株的一種或多種施用給動(dòng)物的方法，以及將包括有效量的上面所列菌株的一種或多種與莫能菌素的組合物施用給動(dòng)物的方法。在至少一些實(shí)施方案中，將一種或多種菌株施用給動(dòng)物在所述動(dòng)物中或?yàn)樗鰟?dòng)物提供了與未施用所述菌株的動(dòng)物相比下列益處的至少一種(a)降低酸中毒；(b)如延遲的乳酸積累和延長(zhǎng)的揮發(fā)性脂肪酸產(chǎn)生所顯示的，穩(wěn)定瘤胃代謝；(c)如pH恢復(fù)和乳酸降低所度量的，更迅速地從酸中毒攻擊恢復(fù)；(d)降低與酸中毒相關(guān)的臨床體征的表現(xiàn)；(e) 增加泌乳的乳牛中的牛奶產(chǎn)量；(f)增加泌乳的乳牛中的牛奶脂肪含量；(g)降低泌乳的乳牛中的體細(xì)胞計(jì)數(shù)(SCC) ； (h)如降低的SCC證明的，改善免疫應(yīng)答和健康；以及(i)增加泌乳的乳牛的牛奶生產(chǎn)效率。還提供了制備直接飼喂微生物的方法。在該方法中，使選自由下列組成的組的菌株生長(zhǎng)在液體營(yíng)養(yǎng)肉湯中屎腸球菌菌株8G-1 (NRRL B-50173)、屎腸球菌菌株8G-73 (NRRL B-50172)和短小芽孢桿菌菌株8G-134(NRRL B-50174)。將所述菌株從液體營(yíng)養(yǎng)肉湯分離以制備直接飼喂微生物。在該方法的至少一些實(shí)施方案中，所述菌株被冷凍干燥。另外提供了制備直接飼喂微生物的方法。在該方法中，使選自由下列組成的組的菌株生長(zhǎng)在液體營(yíng)養(yǎng)肉湯中屎腸球菌菌株8G-1 (NRRL B-50173)、屎腸球菌菌株 8G-73 (NRRL B-50172)和短小芽孢桿菌菌株8G-134 (NRRL B-50174)。將所述菌株從液體營(yíng)養(yǎng)肉湯分離以制備直接飼喂微生物。添加莫能菌素至所述直接飼喂微生物。附圖簡(jiǎn)述在所附的附圖中圖示了本文所述的優(yōu)選的示例性實(shí)施方案，其中整個(gè)附圖中同樣的指示數(shù)字代表同樣的部分，并且其中

圖1是顯示測(cè)試群體(非酸中毒的，集群2、和驅(qū)動(dòng)群體(酸中毒的，集群1)之間的PH差異的圖。圖2是顯示測(cè)試群體(非酸中毒的，集群2~)和驅(qū)動(dòng)群體(酸中毒的，集群1)之間的乳酸積累差異的圖。圖3是顯示體外葡萄糖隨處理時(shí)間變化的圖。圖4是顯示體外乳酸積累隨處理時(shí)間變化的圖。圖5是顯示總VFA(乙酸+丙酸+ 丁酸)積累隨時(shí)間變化的圖。圖6是顯示對(duì)照和候選DFM牛中平均瘤胃pH隨時(shí)間變化的圖。圖7是顯示對(duì)照和候選DFM牛中平均瘤胃乳酸隨時(shí)間變化的圖。圖8是顯示瘤胃VFA濃度隨處理時(shí)間變化的圖。(總VFA =乙酸+丙酸+ 丁酸)。在詳細(xì)解釋本文所述的實(shí)施方案之前，應(yīng)理解本發(fā)明并不限于應(yīng)用于在下面的說明書中所述的或在附圖中所圖示的組分的構(gòu)造和排列的細(xì)節(jié)。本發(fā)明能夠具有其他實(shí)施方案或能夠以多種方式實(shí)踐或?qū)嵤?。并且，?yīng)理解本文所采用的措辭和術(shù)語是為了說明的目的并且不應(yīng)被認(rèn)為是限制性的。碰本文提供了菌株。還提供了制備和使用所述菌株的方法。在至少一些實(shí)施方案中，用一種或多種本文所提供的菌株制備的直接飼喂微生物 (DFM)容許牛肉和牛奶生產(chǎn)者繼續(xù)管理飼喂方案以優(yōu)化生長(zhǎng)和性能，而不會(huì)由于伴隨瘤胃酸中毒的消化失常而犧牲健康。DFM的至少一些實(shí)施方案是基于經(jīng)由乳酸利用或促使瘤胃維持乳酸利用微生物群來管理瘤胃乳酸濃度而選擇的。DFM的至少一些實(shí)施方案被開發(fā)用于管理瘤胃能量濃度。與目前售給牛生產(chǎn)者的減輕酸中毒的DFM不同，本發(fā)明的至少一些實(shí)施方案并非被開發(fā)用于在問題出現(xiàn)之后管理問題，而是在其發(fā)生之前減輕問題。菌株本文提供的菌株包括屎腸球菌菌株8G-1、屎腸球菌菌株8G-73和短小芽孢桿菌菌株8G-134，它們?cè)诒疚闹羞€分別被稱為8G-l、8G-73和8G-134。菌株屎腸球菌菌株8G-1、屎腸球菌菌株8G-73和短小芽孢桿菌菌株8G-134于 2008年8月四日被保藏在美國(guó)北方農(nóng)業(yè)研究培養(yǎng)物保藏中心(Agricultural ResearchService Culture Collection,NRRL),1815 North University Street,Peoria,Illinois, 61604，并分別被給予登錄號(hào)B-50173、B-50172和B-50174。該保藏是根據(jù)國(guó)際承認(rèn)用于專利程序目的的微生物保藏布達(dá)佩斯條約的規(guī)定進(jìn)行的。本文所提供的一種或多種菌株可以用作直接飼喂微生物(DFM)。為了本公開內(nèi)容的目的，“生物上純的菌株”意指不含有足以干擾所述菌株的復(fù)制或可被正常細(xì)菌學(xué)技術(shù)檢測(cè)的量的其他細(xì)菌菌株?！胺蛛x的”在與本文所述的生物體和培養(yǎng)物一起使用時(shí)，不僅包括生物上純的菌株，還包括不像它們天然存在的那樣生長(zhǎng)或維持的任何生物體培養(yǎng)物。在一些實(shí)施方案中，菌株是也提供與8G-l、8G-73和8G-134所提供的益處相當(dāng)?shù)囊嫣幍木?G-l、8G-73或8G-134的突變體、變體或衍生物。在一些實(shí)施方案中， 菌株是具有菌株8G-l、8G-73或8G-134的所有鑒定特征的菌株。此外，各單獨(dú)菌株(8G-1、 8G-73或8G-134)或這些菌株的任何組合也可提供一種或多種本文所述的益處。還應(yīng)清楚的是，添加其他微生物菌株、載體、添加劑、酶、酵母或類似物也將提供酸中毒的控制并且不會(huì)構(gòu)成實(shí)質(zhì)上不同的DFM。桿菌(Bacillus)菌株具有使得它們可用作DFM的許多品質(zhì)。例如，幾種桿菌物種還具有GRAS狀態(tài)，即，它們一般被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局認(rèn)可為安全的，并且還被美國(guó)飼料管理官員協(xié)會(huì)(AAFCO)批準(zhǔn)用于動(dòng)物飼料。本文所述的桿菌菌株是需氧的和兼性的產(chǎn)孢菌類并且因此是穩(wěn)定的。桿菌物種是被認(rèn)為GRAS的僅有的產(chǎn)孢菌類。發(fā)現(xiàn)的一種預(yù)防或治療酸中毒的桿菌菌株是短小芽孢桿菌菌株8G-134。腸球菌菌株也具有使得它們可用作DFM的許多品質(zhì)。已知腸球菌菌株定殖在單胃動(dòng)物和反芻動(dòng)物的胃腸道，并且適于在這種環(huán)境下存活。已顯示腸球菌是兼性厭氧的生物體，這使得它們?cè)谛柩鹾腿毖鯒l件下都是穩(wěn)定的和有活性的。發(fā)明人將屎腸球菌菌株8G-1和屎腸球菌菌株8G-73鑒定為可用于這些目的。菌株的制備在至少一個(gè)實(shí)施方案中，使用常規(guī)的液體或固體發(fā)酵技術(shù)分別培養(yǎng)每一種本文所述的菌株。在至少一個(gè)實(shí)施方案中，桿菌菌株和腸球菌菌株在液體營(yíng)養(yǎng)肉湯中生長(zhǎng)，在桿菌的情況下，生長(zhǎng)至形成最高孢子數(shù)目的水平。桿菌菌株是通過發(fā)酵細(xì)菌菌株制備的，這可以通過成比例增加種菌培養(yǎng)來開始。這包括重復(fù)且無菌地將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至大得多的體積中以充當(dāng)發(fā)酵的接種物，這可以在大的不銹鋼發(fā)酵罐中在含有最佳生長(zhǎng)所必需的蛋白、碳水化合物和礦物質(zhì)的培養(yǎng)基中進(jìn)行。非限制性的示例性培養(yǎng)基是MRS或TSB。然而，也可以使用其他培養(yǎng)基。在將接種物添加至發(fā)酵器皿中之后，控制溫度和攪拌以容許最大的生長(zhǎng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，菌株在攪拌條件下在32°至37°生長(zhǎng)。在培養(yǎng)物達(dá)到最大群體密度之后， 通過從發(fā)酵培養(yǎng)基分離細(xì)胞來收獲培養(yǎng)物。這通常通過離心來進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，為制備桿菌菌株，將桿菌菌株發(fā)酵至5X108CFU/ml至約 4X109CFU/ml的水平。在至少一個(gè)實(shí)施方案中，使用2X109CFU/ml的水平。通過離心收獲細(xì)菌，并且移除上清液。然后可以使用沉淀的細(xì)菌來制備DFM。在至少一些實(shí)施方案中，將沉淀的細(xì)菌冷凍干燥，然后用于形成DFM。然而，在使用桿菌之前并不必需將桿菌冷凍干燥。 還可以在具有或不具有防腐劑，并且以濃縮的、非濃縮的或稀釋的形式使用菌株。然后可以確定培養(yǎng)物的計(jì)數(shù)。CFU或菌落形成單位是由標(biāo)準(zhǔn)微生物鋪板方法所得的樣品的活細(xì)胞計(jì)數(shù)。該術(shù)語是由在單個(gè)細(xì)胞被鋪板在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中將在瓊脂培養(yǎng)基中生長(zhǎng)并變?yōu)榛畹木涞氖聦?shí)衍生而來。由于多個(gè)細(xì)胞可能產(chǎn)生一個(gè)可見的菌落，因此術(shù)語菌落形成單位是比細(xì)胞數(shù)目更有用的單位量度。使用菌株在至少一些實(shí)施方案中，使用一種或多種菌株來形成DFM?？梢詫⒁环N或多種載體添加到菌株中，所述一種或多種載體包括但不限于蔗糖、麥芽糖糊精、石灰石和稻殼。為了混合菌株和載體(使用時(shí))，可以將他們添加至螺帶式混合器或葉片式混合器中并優(yōu)選地混合約15分鐘，盡管可以增加或降低時(shí)間。將組分共混以便得到培養(yǎng)物和載體的均一混合物。最終產(chǎn)物優(yōu)選是干燥的、可流動(dòng)的粉末，并且可以基于終產(chǎn)物中期望的 DFM終濃度來配制。在制備DFM的方法的至少一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述的菌株生長(zhǎng)在培養(yǎng)基中，例如液體營(yíng)養(yǎng)肉湯。將所述菌株從液體營(yíng)養(yǎng)肉湯分離以制備直接飼喂微生物。在將菌株從肉湯分離之后可以將其冷凍干燥?？梢詫⑹耗c球菌菌株8G-1、屎腸球菌菌株8G-73和短小芽孢桿菌菌株8G-134的一種或多種飼喂給動(dòng)物以降低或甚至消除酸中毒的出現(xiàn)。對(duì)于此，將有效量的一種或多種的這些菌株施用給動(dòng)物。在施用給動(dòng)物之后，所述菌株在動(dòng)物中或?yàn)閯?dòng)物提供下列益處的至少一種(a)降低動(dòng)物中的酸中毒；(b)如延遲的乳酸積累和延長(zhǎng)的揮發(fā)性脂肪酸產(chǎn)生所表明的，穩(wěn)定瘤胃代謝；(c)如pH恢復(fù)和乳酸降低所度量的，更迅速地從酸中毒攻擊中恢復(fù)； 以及(d)不表現(xiàn)與酸中毒相關(guān)的臨床體征。動(dòng)物可以是牛，包括肉牛和乳牛，即，一種或多種公牛、小閹牛(steer)、小母牛、牛犢或母牛；山羊；綿羊；美洲駝羊(llamas)；羊駝；在飼喂可迅速發(fā)酵的碳水化合物(RFC) 時(shí)可能遭遇瘤胃不平衡的其他四胃室的反芻動(dòng)物。在至少一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)飼喂屎腸球菌菌株8G-1或屎腸球菌菌株8G-73時(shí)，以使得每天用約5 X IO8CFU/動(dòng)物/天至約5 X IOltlCFU/動(dòng)物/天給予動(dòng)物的水平給動(dòng)物施用菌株。在至少一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)飼喂短小芽孢桿菌菌株8G-134時(shí)，以使得每天用約 5 X IO8CFU/動(dòng)物/天至約5 X IO10CFU/動(dòng)物/天給予動(dòng)物的水平給動(dòng)物施用菌株。在至少一個(gè)實(shí)施方案中，飼喂屎腸球菌菌株8G-1、屎腸球菌菌株8G-73和短小芽孢桿菌菌株8G-134 的兩種或更多種菌株，并且將菌株以如下的水平施用給動(dòng)物該水平使得用約5X IO8CFU/ 動(dòng)物/天至約5X IOltlCFU/動(dòng)物/天作為混合菌株的總劑量給予動(dòng)物?？梢詫⑵渌降囊环N或多種菌株飼喂給動(dòng)物。可以從約30天大直至成年反芻生產(chǎn)期的剩余時(shí)間或其他時(shí)間段將菌株施用給動(dòng)物。在至少一個(gè)實(shí)施方案中，菌株作為直接飼喂微生物(DFM)飼喂，并且DFM用作每日定額食物的覆蓋料(top dressing) 0此外，菌株可以以完全混合的定額食物、沉淀的飼料、 與液體飼料混合、與蛋白預(yù)混物混合、經(jīng)由維生素和礦物預(yù)混物的遞送來飼喂。在至少一個(gè)實(shí)施方案中，菌株作為DFM飼喂，并且DFM以約50mg/頭至660mg/頭的日劑量與A型藥用莫能菌素(Rumensin )組合飼喂。飼喂莫能菌素以增加飼喂效率。 莫能菌素作為離子載運(yùn)體，在細(xì)菌細(xì)胞膜中產(chǎn)生了滲透性，從而產(chǎn)生了胞內(nèi)空間和胞外空間之間的離子不平衡。這種反應(yīng)影響了瘤胃微生物群體并影響飼料發(fā)酵以改善家畜的飼喂效率。在至少一個(gè)實(shí)施方案中，菌株作為DFM飼喂，并且DFM以約60mg/頭至90mg/頭的日劑量與A型藥用泰洛星磷酸鹽(Tylan )組合飼喂。將泰洛星磷酸鹽飼喂給肉牛以降低由壞死梭桿菌(Fusobacterium necrophorum)禾口酉良月農(nóng)放線菌(Actinomyces pyogenes) 引起的肝膿腫。
實(shí)施例僅為了示例的目的提供了下列實(shí)施例。本文所包括的實(shí)施例僅僅是幫助更完整地理解本文所述的發(fā)明。這些實(shí)施例不以任何方式限制本文所述的或本文所要求保護(hù)的范圍。實(shí)施例1酸中毒模型實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)10頭雜種小閹牛進(jìn)行重量分組并將它們分配至兩個(gè)圍欄中。在攻擊前所有處理組的日飼養(yǎng)定額飼料由按干物質(zhì)計(jì)45%粗飼料和55%濃縮物組成。早上給牛飼喂15磅 /頭/天的定額食物一次，并且在傍晚將剩余的飼料推至接近飼喂用拴牛枷。在用濃縮飲食處理物攻擊之前對(duì)兩個(gè)圍欄均禁食M小時(shí)。濃縮飲食處理物由以飼料90%計(jì)的高度可發(fā)酵的碳水化合物源蒸汽壓片玉米組成。在禁食M小時(shí)后，以100磅/圍欄將濃縮飲食隨意飼喂給兩個(gè)圍欄(Oh)。視覺監(jiān)測(cè)攻擊飲食消耗并且根據(jù)需要添加額外的飼料。使用與真空瓶相連的收集管經(jīng)由口腔插管從個(gè)體動(dòng)物獲得瘤胃液樣品。每個(gè)圍欄使用不同的瓶和收集管以最小化處理之間微生物群的交叉污染。將在真空瓶中收集的瘤胃液潷入標(biāo)有取樣時(shí)間和動(dòng)物識(shí)別編號(hào)(耳朵標(biāo)簽編號(hào))的無菌的50ml i^lcon管中。 在-3Mu-24h和-1 從所有的圍欄收集瘤胃樣品。時(shí)間-3 和-24h的樣品代表每個(gè)動(dòng)物的生理基線。時(shí)間-1 的樣品代表每個(gè)動(dòng)物在禁食狀態(tài)的瘤胃液。將時(shí)間Oh指定為飼喂攻擊的開始。在+6至+22小時(shí)每4小時(shí)從所有的動(dòng)物收集瘤胃樣品。所有圍欄均在+28、 +36和+48小時(shí)取樣。在采集后立即分析來自個(gè)體瘤胃樣品的pH。將所有樣品冷凍并準(zhǔn)備運(yùn)輸至 Agtech Products, Inc. (Waukesha，WI)供進(jìn)一步分析。測(cè)量個(gè)體瘤胃樣品中的揮發(fā)性脂肪酸和碳水化合物的濃度。通過從在各時(shí)間階段由每只動(dòng)物收集的瘤胃液無菌移出兩份重復(fù)的1.0ml樣品來制備用于HPLC分析的樣品。 將樣品置于1. 5ml的微量離心管中并通過離心(10分鐘，以12，500rpm)沉淀碎片。將上清液(750 μ 1)轉(zhuǎn)移至干凈的管中并用等體積的5mM 酸化。徹底混合酸化的液體并將其通過0. 2 μ m濾器直接過濾到anl HPLC自動(dòng)取樣瓶中并加蓋。使用Waters ^90HPLC系統(tǒng) (Waters Inc.，Milford，ΜΑ)分析樣品。將樣品注射到加熱至65°C的5mM H2SO4流動(dòng)相中并使用 BioRad HPX-87H 柱(Bio-Rad Laboratories, Inc. , Hercules, CA)分離。使用一組濃度的感興趣的每種化合物來標(biāo)準(zhǔn)化HPLC。用作標(biāo)準(zhǔn)的化合物包括右旋糖(葡萄糖)、乳酸、甲基乙二醛、丁酸、丙酸和乙酸。非酸中毒牛瘤胃微生物群中細(xì)菌基因的發(fā)現(xiàn)抑制性消減雜交利用基因組消減試劑盒(Clontech Jalo Alto,CA)來測(cè)定兩組匯集的瘤胃樣品之間的微生物群體差異。進(jìn)行了等級(jí)集群分析(Hierarchal clustering analysis)以基于隨時(shí)間變化的PH和乳酸譜測(cè)定動(dòng)物之間的相似性和差異。集群分析將牛2069、2071、2078、 2113和2127置于集群1中并且將牛2107、2115、2088、2133和2124置于集群2中。進(jìn)行重復(fù)量度分析以比較來自集群1和集群2的pH和乳酸。獨(dú)立分析所有的變量。在整個(gè)攻擊飲食期間，集群1具有比集群2顯著更高的平均乳酸譜(P = 0. 0004)，并伴隨著更低的平均 PH(P = 0. 0075)(圖1和2)。匯集集群內(nèi)個(gè)體動(dòng)物的瘤胃液以供抑制性消減雜交(SSH)程序。開發(fā)了抑制性消減雜交(SSH)策略來比較在取樣時(shí)間+6h、+10h、+14h和+1 自集群1的牛匯集的瘤胃DNA樣品與自集群2的牛匯集的那些瘤胃DNA樣品。利用集群2作為測(cè)試群體(非酸中毒牛)且集群1作為驅(qū)動(dòng)群體(酸中毒牛)進(jìn)行抑制性消減雜交。認(rèn)為SSH從生物體產(chǎn)生了獨(dú)特DNA片段，該獨(dú)特的DNA片段導(dǎo)致了較低的乳酸水平和較高的 PH(瘤胃能量調(diào)節(jié)生物體)。通過使用時(shí)間+IOh的樣品進(jìn)行消減，所發(fā)現(xiàn)的DNA片段(基因)來自于能夠以RFC形式調(diào)節(jié)瘤胃環(huán)境中過量能量的利用并減輕可能的酸中毒作用的生物體。獨(dú)特測(cè)試序列文庫的克隆和篩選克隆消減后回收的菌株特異性DNA序列以供進(jìn)一步分析。將DNA序列插入到 pCR2. 1載體(Invitrogen)中并化學(xué)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)T0P10細(xì)胞中。將轉(zhuǎn)化混合物鋪板到含有50 μ g/ml卡那霉素并覆蓋有在DMF中的40mg/ml X-gal的22 X 22cm LB瓊脂板上。將板在37°C孵育Mh。挑取重組菌落(白色菌落)至含有LB培養(yǎng)基和50 μ g/ml卡那霉素的無菌微量滴定板中。將含有重組PCR產(chǎn)物的所有孔分成Iml小份。使用Qiaquick PCR純化試劑盒Oliagen)純化一個(gè)小份，將第二小份經(jīng)由離心沉淀，重懸于LB+Kan+10%甘油中并儲(chǔ)存在-80°C下。DNA 雜交使用標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行狹線印跡雜交。為確定克隆的DNA插入物的特異性，將帶正電荷的 kta-Probe 印跡膜(Bio-Rad Laboratories ；Hercules, CA)與探針雜交，該探針由原始測(cè)試DNA和驅(qū)動(dòng)DNA用Alu I消化并用DIG High Prime DNA標(biāo)記試劑盒(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN)標(biāo)記而制得。選擇顯示出與測(cè)試DNA而不是驅(qū)動(dòng)DNA序列同源的重組插入物進(jìn)行序列分析。對(duì)克隆的插入物進(jìn)行雜交。在各時(shí)間階段，進(jìn)行消減，SSH 6、10、14和18。SSH 6、10、14和18分別有12、29、105和四個(gè)測(cè)試特異性的克隆的插入物。確定來自各測(cè)試陽性插入物的DNA序列(Lark Technologies ;Houston，TX)。使用blastX函數(shù)比較來自各插入物的序列與來自NCBI數(shù)據(jù)庫的序列。翻譯核苷酸序列并通過使用blastX函數(shù)將序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)的那些序列進(jìn)行比較來推斷基因功能。使用直系同源簇(Clusters of Orthologous Groups, COG)網(wǎng)站，基因功能歸類至基因類別中。使用鑒定的特異性COG基因構(gòu)建用于菌落雜交和狹線印跡雜交實(shí)驗(yàn)的寡核苷酸探針。 以從非酸中毒牛選擇為基礎(chǔ)，從SSH 10的四個(gè)基因中選擇4個(gè)基因用于基于功能屬性的菌落雜交。經(jīng)由使用NCBI blastX函數(shù)鑒定選自克隆79、84、94和110的分別具有如下指定的功能的基因β -木糖苷酶、葡萄糖/半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、4- α -葡聚糖轉(zhuǎn)移酶和4- α -葡聚糖轉(zhuǎn)移酶。選擇用于菌落雜交的所有基因均具有通過COG鑒定為碳水化合物和運(yùn)輸代謝功能的指定特性，所述功能將為含有這些基因的細(xì)菌提供代謝過量能量的優(yōu)點(diǎn)，如在用RFC 攻擊時(shí)在瘤胃中發(fā)現(xiàn)的。菌落雜交
使用在酸中毒試驗(yàn)期間在時(shí)間+10h、+14h和+1 從牛收集的瘤胃液。從這些時(shí)間階段的每一個(gè)選擇牛2107、21M、2115、2088和2133。這些牛代表之前被選擇為“測(cè)試群體”或非酸中毒組的動(dòng)物。從-20°C取出個(gè)體瘤胃樣品并使其在室溫下解凍。將解凍的瘤胃樣品分別以兩個(gè)重復(fù)鋪板在三種獨(dú)立的培養(yǎng)基上。所使用的培養(yǎng)基由以下組成乳酸鈉瓊脂(NLA)、乳酸丙酸菌選擇瓊脂(LPSA)以及改良的強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基(RCQ。RCS與商購(gòu)獲得的無葡萄糖的強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基類似地制備。因此，RCS中主要的碳水化合物源是淀粉。 下表1示出了在各培養(yǎng)基上鋪板的瘤胃液的孵育條件和稀釋物。
權(quán)利要求
1.一種分離的菌株，選自由下列組成的組屎腸球菌(Enterococcus faecium)菌株 8G-1 (NRRL B-50173)、具有屎腸球菌菌株8G-1(NRRL B-50173)的所有鑒定特征的菌株、屎腸球菌菌株8G-73(NRRL B-50172)、具有屎腸球菌菌株8G-73 (NRRL B-50172)的所有鑒定特征的菌株、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)菌株8G-134(NRRL B-50174)、具有短小芽孢桿菌菌株8G-134(NRRL B-50174)的所有鑒定特征的菌株、以及它們的組合。
2.如權(quán)利要求1所述的菌株，其中所述菌株是屎腸球菌菌株8G-1(NRRL B-50173)。
3.如權(quán)利要求1所述的菌株，其中所述菌株是具有屎腸球菌菌株8G-1(NRRL B-50173) 的所有鑒定特征的菌株。
4.如權(quán)利要求1所述的菌株，其中所述菌株是屎腸球菌菌株8G-73(NRRL B-50172)。
5.如權(quán)利要求1所述的菌株，其中所述菌株是具有屎腸球菌菌株8G-73(NRRL B-50172)的所有鑒定特征的菌株。
6.如權(quán)利要求1所述的菌株，其中所述菌株是短小芽孢桿菌菌株8G-134(NRRL B-50174)。
7 如權(quán)利要求1所述的菌株，其中所述菌株是具有短小芽孢桿菌菌株8G-134(NRRL B-50174)的所有鑒定特征的菌株。
8.一種組合物，包括下列物質(zhì)選自由下列組成的組的分離的菌株屎腸球菌菌株8G-1 (NRRL B-50173)、具有屎腸球菌菌株8G-1 (NRRL B-50173)的所有鑒定特征的菌株、屎腸球菌菌株8G-73 (NRRL B-50172)、 具有屎腸球菌菌株8G-73(NRRL B-50172)的所有鑒定特征的菌株、短小芽孢桿菌菌株 8G-134 (NRRL B-50174)、具有短小芽孢桿菌菌株8G-134 (NRRL B-50174)的所有鑒定特征的菌株、以及它們的組合；以及莫能菌素。
9.一種方法，包括給動(dòng)物施用有效量的選自由下列組成的組的菌株屎腸球菌菌株 8G-1 (NRRL B-50173)、具有屎腸球菌菌株8G-1(NRRL B-50173)的所有鑒定特征的菌株、屎腸球菌菌株8G-73(NRRL B-50172)，具有屎腸球菌菌株8G-73 (NRRL B-50172)的所有鑒定特征的菌株、短小芽孢桿菌菌株8G-134(NRRL B-50174)、具有短小芽孢桿菌菌株8G-134(NRRL B-50174)的所有鑒定特征的菌株、以及它們的組合。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中在施用給所述動(dòng)物之后，所述菌株在所述動(dòng)物中或?yàn)樗鰟?dòng)物提供與未施用所述菌株的動(dòng)物相比下列益處的至少一種(a)降低酸中毒；(b) 如延遲的乳酸積累和延長(zhǎng)的揮發(fā)性脂肪酸產(chǎn)生所指示的，穩(wěn)定瘤胃代謝；(c)如PH恢復(fù)和乳酸降低所度量的，更迅速地從酸中毒攻擊恢復(fù)；以及(d)降低與酸中毒相關(guān)的臨床體征表現(xiàn)；(e)增加牛奶產(chǎn)量；⑴增加牛奶脂肪含量；(g)降低體細(xì)胞計(jì)數(shù)(SCC) ； (h)如降低的 SCC證明的，改善免疫應(yīng)答和健康；以及(i)增加牛奶生產(chǎn)效率。
11.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述動(dòng)物是反芻動(dòng)物。
12.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述動(dòng)物是公牛、小閹牛、小母牛、母?；蚺?。
13.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述菌株是屎腸球菌菌株8G-1(NRRL B-50173)、屎腸球菌菌株8G-73(NRRL B-50172)或它們的組合，并且其中以使得每天用約5 X IO8CFU/動(dòng)物/天至約5 X IOltlCFU/動(dòng)物/天給予動(dòng)物的水平給動(dòng)物施用所述菌株。
14.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述菌株是短小芽孢桿菌菌株8G-134(NRRLB-50174)，并且其中以使得每天用約5X IO8CFU/動(dòng)物/天至約5X IOltlCFU/動(dòng)物/天給予動(dòng)物的水平給動(dòng)物施用所述菌株。
15.如權(quán)利要求11所述的方法，其中從約30天齡開始給所述動(dòng)物施用所述菌株。
16.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述動(dòng)物是肉牛動(dòng)物。
17.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述動(dòng)物是乳牛。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中在施用給所述乳牛之后，所述菌株在所述乳牛中或給所述乳牛提供與未施用所述菌株的乳牛相比下列益處的至少一種(a)所述菌株增加被施用所述菌株的所述乳牛的每日脂肪產(chǎn)量和牛奶脂肪百分比；(b)所述菌株降低被施用所述菌株的所述乳牛的對(duì)數(shù)體細(xì)胞計(jì)數(shù)(LogSCC)評(píng)分；(c)如降低的LogSCC所證明的，改善免疫應(yīng)答和健康；(d)增加被施用所述菌株的所述乳牛的牛奶生產(chǎn)效率，以及(e)在所述乳牛是二產(chǎn)或更大經(jīng)產(chǎn)數(shù)的母牛時(shí)，所述菌株增加被施用所述菌株的所述乳牛的牛奶產(chǎn)量。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中被施用所述菌株的所述乳牛的牛奶產(chǎn)量增加是在基本上沒有增加被施用所述菌株的所述乳牛的干物質(zhì)攝入的情況下實(shí)現(xiàn)的。
20.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述菌株是屎腸球菌菌株8G-1(NRRLB-50173)或具有屎腸球菌菌株8G-1 (NRRL B-50173)的所有鑒定特征的菌株。
21.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述菌株是屎腸球菌菌株8G-73(NRRLB-50172)或具有屎腸球菌菌株8G-73(NRRL B-50172)的所有鑒定特征的菌株。
22.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述菌株是短小芽孢桿菌菌株8G-134(NRRL B-50174)或具有短小芽孢桿菌菌株8G-134(NRRL B-50174)的所有鑒定特征的菌株。
23.一種方法，包括給動(dòng)物施用包含下列物質(zhì)的組合物有效量的選自由下列組成的組的菌株屎腸球菌菌株8G-1(NRRL B-50173)、具有屎腸球菌菌株8G-1(NRRL B-50173)的所有鑒定特征的菌株、屎腸球菌菌株8G-73 (NRRL B-50172)、具有屎腸球菌菌株8G-73(NRRL B-50172)的所有鑒定特征的菌株、短小芽孢桿菌菌株8G-i;34(NRRL B-50174)、具有短小芽孢桿菌菌株8G-134 (NRRL B-50174)的所有鑒定特征的菌株、和它們的組合；以及莫能菌素。
24.一種制備直接飼喂微生物的方法，所述方法包括(a)使選自由下列組成的組的菌株在液體營(yíng)養(yǎng)肉湯中生長(zhǎng)屎腸球菌菌株8G-1(NRRL B-50173)、屎腸球菌菌株8G-73 (NRRL B-50172)、短小芽孢桿菌菌株8G-134 (NRRL B-50174)、具有屎腸球菌菌株8G-1(NRRL B-50173)的所有鑒定特征的菌株、具有屎腸球菌菌株8G-73(NRRL B-50172)的所有鑒定特征的菌株和具有短小芽孢桿菌菌株8G_134(NRRL B-50174)的所有鑒定特征的菌株；以及(b)從所述液體營(yíng)養(yǎng)肉湯分離所述菌株以制備所述直接飼喂微生物。
25.如權(quán)利要求M所述的方法，還包括冷凍干燥所述菌株。
26.如權(quán)利要求M所述的方法，其中所述菌株是屎腸球菌菌株8G-1(NRRL B-50173)或具有屎腸球菌菌株8G-1 (NRRL B-50173)的所有鑒定特征的菌株。
27.如權(quán)利要求M所述的方法，其中所述菌株是屎腸球菌菌株8G-73(NRRL B-50172) 或具有屎腸球菌菌株8G-73 (NRRL B-50172)的所有鑒定特征的菌株。
28.如權(quán)利要求M所述的方法，其中所述菌株是短小芽孢桿菌菌株8G-134(NRRL B-50174)或具有短小芽孢桿菌菌株8G-134(NRRL B-50174)的所有鑒定特征的菌株。
29.一種制備直接飼喂的微生物的方法，所述方法包括(a)使選自由下列組成的組的菌株在液體營(yíng)養(yǎng)肉湯中生長(zhǎng)屎腸球菌菌株8G-1(NRRL B-50173)、屎腸球菌菌株8G-73 (NRRL B-50172)、短小芽孢桿菌菌株8G-134 (NRRL B-50174)、具有屎腸球菌菌株8G-1(NRRL B-50173)的所有鑒定特征的菌株、具有屎腸球菌菌株8G-73(NRRL B-50172)的所有鑒定特征的菌株和具有短小芽孢桿菌菌株8G_134(NRRL B-50174)的所有鑒定特征的菌株；(b)從所述液體營(yíng)養(yǎng)肉湯分離所述菌株以制備所述直接飼喂微生物；以及(c)添加莫能菌素至所述直接飼喂微生物。
全文摘要
描述了包括下列菌株的菌株屎腸球菌菌株8G-1(NRRL B-50173)、屎腸球菌菌株8G-73(NRRL B-50172)、短小芽孢桿菌菌株8G-134(NRRL B-50174)和具有這些菌株的每一種的所有鑒定特征的菌株。所述菌株的一種或多種可用于治療或預(yù)防酸中毒。它們還可用于改善反芻動(dòng)物健康和/或性能的其他量度。描述了單獨(dú)或組合使用所述菌株的方法。還提供了制備所述菌株的方法。
文檔編號(hào)C12P1/04GK102549162SQ200980148513
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2009年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月2日
發(fā)明者基斯·J·默茨, 托馬斯·G·雷貝格爾 申請(qǐng)人:丹尼斯科公司, 拉曼公司