專利名稱：Sirt4及其用途的制作方法
SIRT4及其用途相關(guān)申請(qǐng)
本申請(qǐng)要求于2008年9月23日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)序列號(hào)61/192，892的優(yōu)先權(quán)利益，其內(nèi)容在此引入作為參考。
背景技術(shù)：
Sir2 (沉默信息調(diào)節(jié)因子2)及其同系物在酵母、蠕蟲和蒼蠅中延長(zhǎng)壽命。哺乳動(dòng)物含有sir2 (sirtuins,SIRTl-7)的7種同系物，其具有NAD+-依賴性脫乙酰酶和/或ADP-核糖基化活性。SIRT1，最緊密的哺乳動(dòng)物sir2直向同源物，是研究最多的sirtuin，并且已顯示使超過(guò)許多(a dozen)底物脫乙酰，以促進(jìn)代謝適應(yīng)和細(xì)胞存活。例如，在胰腺β細(xì)胞中，SIRTl抑制線粒體解偶聯(lián)蛋白質(zhì)表達(dá)且增加胰島素分泌。在肝中，SIRTl活性在禁食過(guò)程中是上調(diào)的，導(dǎo)致通過(guò)F0X01、CRTC2和PGC- 1 α脫乙酰的糖質(zhì)新生調(diào)節(jié)。3種哺乳動(dòng)物sirtuins(SIRT3、SIRT4和SIRT5)內(nèi)源定位在線粒體中，并且在這種細(xì)胞器中可以作為能量狀態(tài)傳感器起作用。SIRT3在體外使乙酰輔酶A合成酶2(AceCS2)、 谷氨酸脫氫酶(GDH)和電子轉(zhuǎn)運(yùn)鏈的復(fù)合物I脫乙酰，但SIRT3敲除小鼠在基本條件下不具有明顯表型。SIRT5具有弱脫乙酰酶活性，并且它的體內(nèi)靶仍未得到鑒定。在胰腺β細(xì)胞中，通過(guò)ADP-核糖基化且抑制⑶H，SIRT4調(diào)控谷氨酸鹽和谷氨酰胺至α -酮戊二酸的轉(zhuǎn)換，從而抑制來(lái)自胰腺β細(xì)胞的胰島素分泌。然而，SIRT4是廣泛表達(dá)的，并且它在除胰腺外的組織中的作用仍未得到描述。發(fā)明_既述
線粒體功能牽涉廣泛多樣的病癥，包括例如生理學(xué)和病理生理學(xué)應(yīng)激、肥胖、心血管疾病、衰老和年齡相關(guān)性疾病。目前已發(fā)現(xiàn)線粒體蛋白質(zhì)SIRT4是脂肪酸氧化的關(guān)鍵調(diào)控劑， 并且在疾病、衰老和相關(guān)病理狀態(tài)情況中起重要作用。SIRT4活性的阻遏通過(guò)減少脂肪組織來(lái)阻止飲食誘導(dǎo)的重量增加，并且即使在高脂肪飲食的條件下也允許維持無(wú)脂肪表型。本文描述的是用于調(diào)控脂質(zhì)代謝包括脂肪酸氧化、控制重量增加和治療代謝綜合征的方法和組合物。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了評(píng)估SIRT4脂肪酸氧化抑制活性的方法，該方法包括提供包括SIRT4蛋白質(zhì)、催化脂肪酸氧化的酶和底物的無(wú)細(xì)胞組合物，以及評(píng)估組合物中的脂肪酸氧化活性。在某些實(shí)施方案中，底物包括脂肪酸。任選地，該方法還提供了將測(cè)試化合物加入無(wú)細(xì)胞組合物中的步驟。在某些實(shí)施方案中，測(cè)試化合物是小分子、抗體或核酸。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于測(cè)量測(cè)試化合物針對(duì)SIRT4蛋白質(zhì)的抑制性質(zhì)的方法，其包括在催化脂肪酸氧化的酶和底物的存在下，使SIRT4蛋白質(zhì)與測(cè)試化合物接觸，測(cè)量在測(cè)試化合物的存在下脂肪酸氧化的測(cè)試速率，并且使脂肪酸氧化的測(cè)試速率與在不存在測(cè)試化合物的情況下獲得的脂肪酸氧化的對(duì)照速率比較，其中測(cè)試速率相對(duì)于對(duì)照速率的增加指示測(cè)試化合物的抑制性質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，測(cè)試化合物是小分子、抗體或核酸。在一個(gè)進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了用于測(cè)量測(cè)試化合物針對(duì)SIRT4蛋白質(zhì)的刺激性質(zhì)的方法，其包括以下步驟在催化脂肪酸氧化的酶和底物的存在下，使SIRT4蛋白質(zhì)與測(cè)試化合物接觸，測(cè)量在測(cè)試化合物的存在下脂肪酸氧化的測(cè)試速率，并且使脂肪酸氧化的測(cè)試速率與在不存在測(cè)試化合物的情況下獲得的脂肪酸氧化的對(duì)照速率比較，其中測(cè)試速率相對(duì)于對(duì)照速率的降低指示測(cè)試化合物的刺激性質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，測(cè)試化合物是小分子、抗體或核酸。在還進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物受試者中的脂肪酸氧化病癥(FOD)的方法，其包括給受試者施用有效量的減少SIRT4蛋白質(zhì)活性的試劑。示例性FOD 包括肥胖、中鏈?；o酶A脫氫酶(MCAD)缺乏癥、短鏈?；o酶A脫氫酶(SCAD)缺乏癥、長(zhǎng)鏈酰基輔酶A脫氫酶(LCAD)缺乏癥、肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶移位酶I和II型缺乏癥、肉堿?；鈮A移位酶缺乏癥、極長(zhǎng)鏈?；o酶A脫氫酶(VLCAD)缺乏癥、戊二酸尿癥II、EFT缺乏癥 HMG肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)缺陷(原發(fā)性肉堿缺乏癥)、長(zhǎng)鏈3-羥基?；o酶A脫氫酶(LCHAD)缺乏癥、三功能蛋白質(zhì)(TFP)缺乏癥、2，4 二烯?；o酶A還原酶缺乏癥、3-羥基酰基輔酶A脫氫酶缺乏癥(HADH)、電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白質(zhì)(ETF)脫氫酶缺乏癥和3-羥基-3-甲基戊二?；o酶A (HMG)裂解酶缺乏癥。在特定實(shí)施方案中，SIRT4水平在肝細(xì)胞中進(jìn)行調(diào)節(jié)。在某些實(shí)施方案中，試劑是減少SIRT4表達(dá)的拮抗性核酸。在其他實(shí)施方案中，試劑包括靶向SIRT4 mRNA 的核酸或靶向SIRT4蛋白質(zhì)的抗體。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了評(píng)估測(cè)試化合物對(duì)SIRT4的作用的方法，該方法包括提供包括SIRT4和測(cè)試化合物的反應(yīng)混合物，并且評(píng)估SIRT4的脂肪酸氧化活性。在某些實(shí)施方案中，測(cè)試化合物是小分子。在其他實(shí)施方案中，該方法對(duì)于各個(gè)來(lái)自化學(xué)文庫(kù)的多個(gè)測(cè)試化合物重復(fù)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，反應(yīng)混合物在真核細(xì)胞例如肝細(xì)胞中提供。 在還進(jìn)一步的實(shí)施方案中，反應(yīng)混合物在哺乳動(dòng)物受試者中提供。在一個(gè)進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了在哺乳動(dòng)物受試者中誘導(dǎo)重量增加或脂肪酸沉積的方法，其包括給受試者施用有效量的增加SIRT4蛋白質(zhì)活性的試劑。例如，受試者是營(yíng)養(yǎng)不良的。在還進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了增加哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體- a (PPAR-a)活性的方法，其包括使哺乳動(dòng)物細(xì)胞與減少SIRT4活性的化合物接觸。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了增加哺乳動(dòng)物受試者的能量消耗的方法，其包括給受試者施用SIRT4抑制劑。例如，受試者是過(guò)重的，患有或處于發(fā)生線粒體相關(guān)疾病的危險(xiǎn)中，或具有代謝病癥導(dǎo)致在受試者的組織中減少的脂肪酸氧化和/或增加的脂肪酸沉積。 線粒體相關(guān)疾病包括衰老、MELAS綜合征、肌營(yíng)養(yǎng)不良、糖尿病、Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變、利氏(Leigh)綜合征、NARP綜合征和肌神經(jīng)源性(Myoneurogenic)胃腸道腦病。在某些實(shí)施方案中，SIRT4抑制劑以有效劑量提供，從而使得受試者組織中的脂肪貯存減少。在其他實(shí)施方案中，SIRT4抑制劑施用于肝組織、棕色脂肪組織、骨骼肌組織或其組合。在一個(gè)進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了減少哺乳動(dòng)物受試者中的膽固醇水平的方法，其包括給受試者施用以有效量的SIRT4抑制劑，從而使得膽固醇水平減少。例如，血清膽固醇水平可以減少。在某些實(shí)施方案中，該方法還包括給受試者施用有效量的過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體- α激動(dòng)劑，例如環(huán)丙貝特、氯貝丁酯、非諾貝特、苯扎貝特、WY14, 643 或其組合。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了減少組織中的活性氧(reactive oxygen species,R0S)的方法，其包括使組織與SIRT4激活物接觸。ROS是例如氧離子、自由基或含過(guò)氧化物的化合物。在某些方面，組織包括肝細(xì)胞。在一個(gè)進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了增加細(xì)胞中的SIRTl活性的方法，其包括使所述細(xì)胞與SIRT4抑制劑接觸。在某些實(shí)施方案中，所述SIRT4抑制劑選自小分子、抗體和拮抗性核酸。在還進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了包括SIRT4抑制劑和過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-α激動(dòng)劑的組合物。在某些實(shí)施方案中，過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-α激動(dòng)劑是環(huán)丙貝特、氯貝丁酯、非諾貝特、苯扎貝特、WY14，643或其組合。


圖1顯示了定量RT-PCR測(cè)定結(jié)果，描述了取自WT小鼠的肝細(xì)胞中的SIRT4 (圖 1Α)、SIRT3 (圖 IB)、SIRT5 (圖 1C)、Gk (圖 ID)、Cptla (圖 1Ε)和 Acot3 (圖 1F)表達(dá)，所述WT小鼠已禁食所示時(shí)間段。圖2顯示了與SIRT4 WT小鼠比較，在SIRT4 KO小鼠的全肝中的基因表達(dá)的微陣列分析結(jié)果。圖2A列出了在SIRT4 KO小鼠肝中的基因表達(dá)譜中過(guò)度表現(xiàn)的基因本體項(xiàng) (gene ontology terms)。圖2B描述具有ρ值< 0. 01的所有注解的、差異表達(dá)基因的途徑和代謝過(guò)程分類。圖2C描述了與脂質(zhì)代謝過(guò)程相關(guān)的具有ρ值< 0.1的基因的相對(duì)表達(dá)。圖3 顯示了在定量 RT-PCR 測(cè)定中用于檢測(cè) Acot3、Asns、Egfr、Lipg、Ban 和 Rspl6 表達(dá)的引物。圖4顯示了檢測(cè)得自喂食或禁食SIRT4 WT或SIRT4 KO小鼠的全肝中的cptla、 lipg、acot3、asns、egfr、SIRT4 和 esr 表達(dá)的定量 RT-PCR 測(cè)定結(jié)果。圖 5 顯示了在 SIRT4 KO 肝轉(zhuǎn)錄組以及來(lái)自 Gene Expression Omnibus (GEO) 和ArrayExpress的公開(kāi)肝轉(zhuǎn)錄組之間的相似性。WY PPAR α WT 用WY14643處理5天的 WT 小鼠(GSE8295，(Rakhshandehroo 等人，(2007) PPAR Research 2007,26839)), WY PPAR α KO 用 WY14643 處理 5 天的 PPAR α KO 小鼠(GSE8295 (Rakhshandehroo 等人， (2007) PPAR Research 2007，26839))，PPAR α KO 未用 WY14643 處理的 WT 與 PPAR α KO 小鼠比較(GSE8295，(Rakhshandehroo 等人，(2007) PPAR Research 2007,26839)), CR 長(zhǎng)期卡路里限制小鼠與對(duì)照飲食比較(GSEM31，(Dhahbi等人，(2005) Physiol Genomics 23,343-350)), PGC-1 β mut :PGC_1 β 突變型小鼠與 WT 小鼠比較(GSE6210，(Vianna 等 A, (2006) Cell Metab 4,453-464)), agingl :22 個(gè)月與 4 個(gè)月 WT Snell 侏儒小鼠比較 (GSE3129，(Boylston 等人，(2004)Aging Cell 3，283- 296))，aging2 :22 個(gè)月與 4 個(gè)月 WT Ames 侏儒小鼠比較(GSE3150，(Boylston 等人，(2006) AGE 28，125-144))，aging3 :130 周與 13 周 WT 小鼠比較(E-MEXP-1504，(Schumacher 等人，(2008)PLoS Genet 4，el000161 ))。 使用排列計(jì)算顯著性。*p<0.0001。圖6顯示了檢測(cè)SICT4 KO和SIRT4 WT肝中的PPARa禾口 PPARa靶基因表達(dá)的定量RT-PCR測(cè)定結(jié)果。圖7A顯示了描述在來(lái)自由對(duì)照(_)或SIRT4表達(dá)病毒(+ )感染的SIRT4 KO和 SIRT4 WT小鼠的原代小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEFs)中SIRT4表達(dá)的免疫印跡。圖7B顯示了在來(lái)自由對(duì)照(-)或SIRT4表達(dá)病毒(+ )感染且用50 μ M WY14643處理或未處理的SIRT4KO 或 SIRT4 WT MEFs 中的 pdk4 表達(dá)。圖 7C 顯示了在 SIRT4 KO (-/-)或 SIRT4 WT (+/+) MEFs和用50 μ M WY14643處理或未處理中的pdk4表達(dá)。圖8A顯示了在用螢光素酶報(bào)道分子連同表達(dá)PPARa ,RXRa的構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的人胚腎四3了(HEK293T)細(xì)胞中的 SIRT4-Flag (T4)、H161A-SIRT4_Flag (Mut)、 HA-PPARa和肌動(dòng)蛋白表達(dá)的免疫印跡，所述螢光素酶報(bào)道分子通過(guò)共有區(qū)PPAR應(yīng)答元件的3個(gè)串聯(lián)重復(fù)(3xPPRE)驅(qū)動(dòng)。圖8B顯示了在來(lái)自圖8A用pCMV對(duì)照(pCMV)、SIRT4_Flag (SIRT4)或 H161A-SIRT4-Flag (SIRT4 Mut)轉(zhuǎn)染的人胚腎 (ΗΕΚ293Τ)細(xì)胞中的螢光素酶表達(dá)。圖 8C 顯示在用 pCMV 對(duì)照(pCMV)、SIRT4-Flag (SIRT4)或 H161A- SIRT4_Flag (SIRT4 Mut)轉(zhuǎn)染的H2. 35肝細(xì)胞瘤細(xì)胞中的螢光素酶表達(dá)。圖 9A 和 9B 顯示了如使用 SIRT4 (-/-)和 SIRT4 (+/+)MEFs (圖 9A)或 SIRT4 (-/-)和SIRT4 (+/+)原代肝細(xì)胞(圖9B)分析的，[3H]棕櫚酸鹽的氧化(nmol [3H]棕櫚酸鹽/小時(shí)/ mg蛋白質(zhì))。圖9C顯示了來(lái)自SIRT4 (_/_)和(+/+)原代肝細(xì)胞的培養(yǎng)基中的棕櫚酸鹽消耗。圖IOA顯示了在過(guò)夜禁食后SIRT4 KO和WT小鼠(n=6/基因型)的肝中的甘油三酯(TG)水平(yg/mg組織)。圖IOB顯示了在過(guò)夜禁食后SIRT4 KO和WT小鼠的肝中的甘油三酯的脂肪酸組成。數(shù)據(jù)表示平均值士 SEM(n=6/基因型)。圖IOC顯示了在禁食前(0 小時(shí))和后(16小時(shí)和M小時(shí))依靠正常食物飲食的雄性SIRT4 KO和WT小鼠血漿中的非酯化脂肪酸水平(NEFA，μΜ)0圖11顯示了在過(guò)夜禁食過(guò)程中SIRT4 WT和SIRT4 KO小鼠經(jīng)歷的過(guò)夜重量減輕。圖12Α顯示了依靠低脂肪飲食直到6個(gè)月大的SIRT4 KO和WT小鼠的生長(zhǎng)曲線 (η=10-12/基因型，數(shù)據(jù)表示平均值士 SEM)。圖12Β顯示了依靠高脂肪飲食(HFD，60%脂肪，研究飲食)的SIRT4 KO和WT小鼠以及依靠低脂肪飲食(LFD，10%脂肪，研究飲食)的WT 小鼠的體重。圖12C顯示了依靠HFD的SIRT4 KO和WT小鼠以及依靠LFD的WT小鼠的相對(duì)重量增加。圖12D顯示了在依靠HFD的SIRT4 KO和WT小鼠以及依靠LFD的WT小鼠中的每周食物攝入(g/g BW)。圖13A顯示了依靠HFD的SIRT4 KO和WT小鼠以及依靠LFD的WT小鼠的起始體重。圖1 顯示了依靠HFD的SIRT4 KO和WT小鼠以及依靠LFD的WT小鼠的起始年齡。圖14顯示了依靠HFD的SIRT4 KO和WT小鼠以及依靠LFD的WT小鼠的每日食物攝入(g/g體重)。圖15A顯示了依靠HFD的SIRT4 KO和WT小鼠的總糞便排泄量(48小時(shí))。圖15B 顯示了依靠HFD的SIRT4 KO和WT小鼠的總糞便排泄量/體重(48小時(shí))。圖16A和16B顯示了依靠HFD或LFD的喂食或禁食SIRT4 KO和WT小鼠中的血漿甘油三酯。圖16C和16D顯示了依靠HFD或LFD飲食的喂食或禁食SIRT4 KO和WT小鼠中的血漿NEFA。圖17A和17B顯示了喂食或禁食的依靠HFD的SIRT4 KO和WT小鼠以及依靠LFD 的WT小鼠中的血糖水平。圖17C顯示了在依靠HFD 16周后的SIRT4 KO和WT小鼠或依靠 LFD的SIRT4 WT小鼠的肝重。圖17D顯示了在依靠HFD 16周后的SIRT4 KO和WT小鼠或依靠LFD的SIRT4 WT小鼠的附睪白脂肪組織(WAT)重量。圖17E和17F顯示了喂食或禁食的依靠HFD的SIRT4 KO和WT小鼠以及依靠LFD的WT小鼠的血漿中的胰島素水平。圖17G顯示了與依靠HFD的WT小鼠和依靠LFD的WT小鼠比較，依靠HFD的SIRT4 KO小鼠的重量減輕百分比。圖18A顯示了在依靠HFD的SIRT4 KO和WT小鼠或依靠LFD的WT小鼠中執(zhí)行的葡萄糖耐受測(cè)試(GTT)。(n=6/組)。圖18B顯示了來(lái)自圖18A的GTTs的曲線下面積。圖19顯示了使用針對(duì)磷酸-乙酰輔酶A羧化酶(ρ- ACC)、乙酰輔酶A羧化酶 (ACC)、磷酸-AMP-活化激酶(p-AMPK)、AMP-活化激酶(AMPK)、SIRT4和肌動(dòng)蛋白的抗體，對(duì)過(guò)夜禁食的SIRT4 KO和SIRT4 WT小鼠的肝進(jìn)行的蛋白質(zhì)印跡分析。圖20A顯示了如在來(lái)自過(guò)夜禁食的SIRT4 KO和SIRT4 WT小鼠的肝的酸可溶性部分中測(cè)量的ATP和ADP水平(nmol/mg組織)。圖20B顯示了由圖20A中呈現(xiàn)的結(jié)果計(jì)算的， 在 SIRT4 WT 和 SIRT4 KO 肝中的 ATP/ADP 比值。圖21A顯示了如由SIRT4 KO和SIRT4 WT小鼠(禁食，n=6_8)的肝測(cè)量的NAD。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)表示一只動(dòng)物的NAD濃度(pmol NAD/mg組織)。直線表示平均NAD濃度。圖21B 顯示了如由SIRT4 KO和SIRT4 WT小鼠(禁食，n=6_8)的肝測(cè)量的NADH。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)表示一只動(dòng)物中的NADH濃度(pmol NAD/mg組織)。直線表示平均NADH濃度。圖21C顯示了來(lái)自SIRT4 KO和SIRT4 WT全肝組織裂解產(chǎn)物的NAD/NADH比值。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)表示一只動(dòng)物中的NAD/NADH比值。直線表示平均NAD/NADH比值。圖22顯示了描述來(lái)自禁食SIRT4 KO和WT小鼠的全肝裂解產(chǎn)物中的SIRTl和肌動(dòng)蛋白表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡。圖23顯示了如使用SIRT4 WT和SIRT4 KO原代肝細(xì)胞分析的[3H]棕櫚酸鹽氧化 (nmol [3H]棕櫚酸鹽/小時(shí)/ mg蛋白質(zhì))，所述原代肝細(xì)胞未處理、用SIRTl抑制劑Ex 527處理的，或用乙莫克舍(ETO)處理。發(fā)明詳述
本發(fā)明的實(shí)施方案和實(shí)踐、其他實(shí)施方案及其特點(diǎn)和特征，根據(jù)下述說(shuō)明書、附圖和權(quán)利要求將是顯而易見(jiàn)的，其中所有權(quán)利要求在此引入本概述內(nèi)作為參考。定義
為了方便起見(jiàn)，在說(shuō)明書、實(shí)施例和附加權(quán)利要求中采用的特定術(shù)語(yǔ)在此處收集。除非另有說(shuō)明，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與由本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解相同的含義。冠詞“a”和“an”在本文中用于指一個(gè)或超過(guò)一個(gè)(即，至少一個(gè))冠詞的語(yǔ)法目標(biāo)。例如，“元件”意指一個(gè)元件或超過(guò)一個(gè)元件。術(shù)語(yǔ)“測(cè)試化合物”和“試劑”在本文中用于指示化學(xué)化合物，小分子，化學(xué)化合物的混合物，生物大分子(例如，核酸、抗體、蛋白質(zhì)或其部分例如肽)，或由生物材料例如細(xì)菌、植物、真菌或動(dòng)物(特別是哺乳動(dòng)物)細(xì)胞或組織制備的提取物。測(cè)試化合物和試劑可以通過(guò)下文描述的篩選測(cè)定鑒定為具有特定活性。此類測(cè)試化合物和試劑的活性可以致使其適合作為在受試者中局部或全身作用的“治療化合物”或“治療劑”，其是生物學(xué)、生理學(xué)或藥理學(xué)活性物質(zhì)(或多種物質(zhì))。測(cè)試化合物可以能夠且用于結(jié)合、激動(dòng)、拮抗或以其他方式調(diào)節(jié)(調(diào)控、修飾、上調(diào)、下調(diào))本發(fā)明的蛋白質(zhì)或復(fù)合物的活性。術(shù)語(yǔ)“氨基酸”意欲包括無(wú)論天然還是合成的所有分子，這包括氨基功能性和酸功能性且能夠包括在天然存在的氨基酸的聚合物中。示例性氨基酸包括天然存在的氨基酸；其類似物、衍生物和同源物；具有變體側(cè)鏈的氨基酸類似物；和前述任何中的任何的所有立體異構(gòu)體。術(shù)語(yǔ)“結(jié)合”或“相互作用”指在生理?xiàng)l件下由于例如靜電、疏水、離子和/或氫鍵相互作用，在2個(gè)分子之間的結(jié)合，其可以是穩(wěn)定結(jié)合，例如在多肽和結(jié)合配偶體或試劑例如小分子之間。術(shù)語(yǔ)“卡路里限制的”和“卡路里限制”包括在隨意水平下(below ad libitum levels)的對(duì)于哺乳動(dòng)物或其他生物的任何飲食或喂食程序，例如在隨意水平下10%、 20%、30%、40%、50%或超過(guò) 50%。如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“化學(xué)實(shí)體”指化學(xué)化合物、2種或更多種化學(xué)化合物的混合物、和此類化合物或復(fù)合物的片段。在特定情況下，希望使用顯示出廣泛范圍的結(jié)構(gòu)和功能多樣性的化學(xué)實(shí)體，例如顯示出不同形狀(例如，一個(gè)或多個(gè)平芳環(huán)，一個(gè)或多個(gè)折疊芳環(huán)， 具有單、雙或三鍵的直鏈和支鏈脂肪族化合物)和不同官能團(tuán)(例如，羧酸、酯、醚、胺、醛、酮和各種雜環(huán))的化合物。術(shù)語(yǔ)“復(fù)合物”指對(duì)于彼此具有親和力的至少2個(gè)部分(例如化學(xué)或生物化學(xué))之間的結(jié)合。復(fù)合物的例子包括抗原/抗體、凝集素/抗生物素蛋白、靶多核苷酸/探針寡核苷酸、抗體/抗抗體、受體/配體、酶/配體、多肽/多肽、多肽/多核苷酸、多肽/輔因子、 多肽/底物、多肽/抑制劑、多肽/小分子等之間的結(jié)合?！皬?fù)合物的成員”指復(fù)合物的一個(gè)部分，例如蛋白質(zhì)?！暗鞍踪|(zhì)復(fù)合物”或“多肽復(fù)合物”指包括至少2種多肽或蛋白質(zhì)的復(fù)合物。術(shù)語(yǔ)“包括”以包括在內(nèi)的開(kāi)放含義使用，意指可以包括另外元件。當(dāng)在本文中使用術(shù)語(yǔ)“包括”或“具有”時(shí)，應(yīng)當(dāng)理解在合適時(shí)這個(gè)術(shù)語(yǔ)也可以由短語(yǔ)“基本上由……組成”或“由……組成”替換。例如，“包括序列X的氨基酸1-100的片段”應(yīng)解釋為提供關(guān)于“基本上由序列X的氨基酸1-100組成的片段”以及“由序列X的氨基酸1-100組成的片段”的支持。術(shù)語(yǔ)“對(duì)照”包括設(shè)計(jì)為證實(shí)被測(cè)試的因子負(fù)責(zé)所觀察到的效應(yīng)，并且因此用于分離且定量一個(gè)變量對(duì)系統(tǒng)的作用的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的任何部分。對(duì)照包括如本文描述的“參考樣
π ”
ΡΠ O當(dāng)提及多肽、核酸、復(fù)合物等使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“成藥(druggable)區(qū)域”指其為用于結(jié)合調(diào)節(jié)劑的靶或可能靶的分子區(qū)域。對(duì)于多肽，成藥區(qū)域一般指其中多肽的數(shù)個(gè)氨基酸將能夠與調(diào)節(jié)劑或其他分子相互作用的區(qū)域。對(duì)于多肽或其復(fù)合物，示例性成藥區(qū)域包括結(jié)合袋和位點(diǎn)、酶促活性位點(diǎn)、多肽或復(fù)合物的結(jié)構(gòu)域之間的界面、能夠參與和另一種分子的相互作用的多肽或復(fù)合物的表面凹槽或輪廓或表面。在特定情況下，相互作用分子是另一種多肽，其可以是天然存在的。成藥區(qū)域可以在分子的表面上。成藥區(qū)域可以以許多方式描述且表征。例如，成藥區(qū)域可以通過(guò)一些或所有氨基酸進(jìn)行表征，所述氨基酸構(gòu)成該區(qū)域、或其主鏈原子、或其側(cè)鏈原子(任選連同或不連同C α 原子)?？商娲?，在特定情況下，成藥區(qū)域的體積與至少約200 amu且通常直到約800 amu 的基于碳的分子的那種對(duì)應(yīng)。在其他情況下，應(yīng)當(dāng)理解此類區(qū)域的體積可以與至少約600 amu且通常直到約1600 amu或更多的分子對(duì)應(yīng)?？商娲?，成藥區(qū)域可以通過(guò)與相同或其他分子上的其他區(qū)域比較進(jìn)行表征。例如，術(shù)語(yǔ)“親和力區(qū)域”指在分子(例如本發(fā)明的多肽)上的成藥區(qū)域，其存在于數(shù)個(gè)其他分子中，由于相同親和力區(qū)域的結(jié)構(gòu)足夠相同，從而使得它們預(yù)期結(jié)合相同或相關(guān)結(jié)構(gòu)類似物。親和力區(qū)域的例子是蛋白質(zhì)激酶的ATP-結(jié)合位點(diǎn)，其在數(shù)個(gè)蛋白質(zhì)激酶中發(fā)現(xiàn)(無(wú)論是否相同起源)。術(shù)語(yǔ)“選擇性區(qū)域”指可能在其他分子上未發(fā)現(xiàn)的分子成藥區(qū)域，由于不同選擇性區(qū)域的結(jié)構(gòu)足夠不同，從而使得它們不預(yù)期結(jié)合相同或相關(guān)結(jié)構(gòu)類似物。示例性選擇性區(qū)域是蛋白質(zhì)激酶的催化結(jié)構(gòu)域，其顯示出對(duì)于一種底物的特異性。在特定情況下，單個(gè)調(diào)節(jié)劑可以與許多蛋白質(zhì)的相同親和力區(qū)域結(jié)合，所述許多蛋白質(zhì)具有基本上相似的生物學(xué)功能，而相同調(diào)節(jié)劑可以與這些蛋白質(zhì)之一中的僅一個(gè)選擇性區(qū)域結(jié)合。當(dāng)提及成藥區(qū)域中使用時(shí)，分子例如調(diào)節(jié)劑對(duì)于成藥區(qū)域的“選擇性”或“特異性” 可以用于描述分子和成藥區(qū)域之間的結(jié)合。例如，調(diào)節(jié)劑就成藥區(qū)域而言的選擇性可以通過(guò)與另一種調(diào)節(jié)劑比較而表達(dá)，使用各自的Kd值(即，對(duì)于每種調(diào)節(jié)劑-成藥區(qū)域復(fù)合物的結(jié)合常數(shù))，或在其中生物學(xué)效應(yīng)低于Kd觀察到的情況下，使用各自EC5tl的比值(即，產(chǎn)生關(guān)于與每個(gè)成藥區(qū)域相互作用的調(diào)節(jié)劑的最大限度應(yīng)答50%的濃度)。“天然存在的形式”當(dāng)提及化合物時(shí)意指以其中它可以天然發(fā)現(xiàn)的形式的化合物， 例如組合物。化合物不以天然存在的形式，如果例如化合物已純化且與在自然界中與化合物一起發(fā)現(xiàn)的其他分子中的至少一些分離。在特定實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“分離的多肽”指由重組DNA或RNA制備、或具有合成起源、或其某些組合的多肽，其(1)不與它在自然界中通常與之一起發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)結(jié)合，(2)從其中它通常存在的細(xì)胞中分離，(3)被分離而不含來(lái)自相同細(xì)胞來(lái)源的其他蛋白質(zhì)，(4)由來(lái)自不同種類的細(xì)胞表達(dá)，或(5)在自然界中不存在。術(shù)語(yǔ)“分離的核酸”指基因組、cDNA或合成起源或其某些組合的多核苷酸，其(1) 不與其中“分離的核酸”在自然界中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞結(jié)合，或(2)與它在自然界中不與之連接的多核苷酸可操作地連接。術(shù)語(yǔ)“標(biāo)記”或“標(biāo)記的”指可檢測(cè)標(biāo)記任選共價(jià)或非共價(jià)地?fù)饺牖蚋街椒肿永缍嚯膬?nèi)。術(shù)語(yǔ)“同一性百分比”指2個(gè)氨基酸序列或2個(gè)核苷酸序列之間的序列同一性。 同一性可以各自通過(guò)比較每個(gè)序列中的位置進(jìn)行測(cè)定，所述序列可以就比較的目的進(jìn)行比對(duì)。當(dāng)比較序列中的等價(jià)位置由相同堿基或氨基酸占據(jù)時(shí)，那么分子在那個(gè)位置上是等同的；當(dāng)?shù)葍r(jià)位點(diǎn)由相同或相似氨基酸殘基(例如，在立體和/或電子性質(zhì)中相似)占據(jù)時(shí)，那么分子可以被稱為在那個(gè)位置上同源(相似)。作為同源性、相似性或同一性百分比的表示指在由比較序列共享的位置上等同或相似氨基酸數(shù)目的函數(shù)。作為同源性、相似性或同一性百分比的表示指在由比較序列共享(shared)的位置上等同或相似氨基酸數(shù)目的函數(shù)。 可以使用各種比對(duì)算法和/或程序，包括FASTA、BLAST或ENTREZ。FASTA和BLAST可作為 GCG序列分析包(University of Wisconsin, Madison, Wis.)的部分獲得，并且可以與例如缺省設(shè)置一起使用。ENTREZ可通過(guò)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information),美國(guó)國(guó)家醫(yī)學(xué)圖書館(National Library of Medicine),美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health)，Bethesda，Md獲得。在一個(gè)實(shí)施方案中，2個(gè)序列的同一性百分比可以通過(guò)GCG程序用空位權(quán)1進(jìn)行測(cè)定，例如每個(gè)氨基酸缺口加權(quán)，如同在2個(gè)序列之間存在單個(gè)氨基酸或核苷酸錯(cuò)配。
用于比對(duì)的其他技術(shù)在 Methods in Enzymology，第 266 卷Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis( 1996),編輯 Doolittle, Academic Press, Inc., a division of Harcourt Brace & Co. , San Diego, California, USA 中描述。優(yōu)選地，允許序列中的缺口的比對(duì)程序用于比對(duì)序列。Smith-Waterman是允許序列中的缺口的一類算法。參見(jiàn) Meth. Mol. Biol. 70:173-187 (1997)。此外，使用 Needleman 和 Wunsch 比對(duì)方法的GAP程序可以用于比對(duì)序列?？商娲阉鞑呗允褂肕PSRCH軟件，這在MASPAR計(jì)算機(jī)上運(yùn)行。MPSRCH使用Smith-Waterman算法，以在大量平行計(jì)算機(jī)上評(píng)分序列。這種方法改善挑選遙遠(yuǎn)相關(guān)匹配的能力，并且特別耐受小缺口和核苷酸序列誤差。核酸編碼的氨基酸序列可以用于搜索蛋白質(zhì)和DNA數(shù)據(jù)庫(kù)。術(shù)語(yǔ)“哺乳動(dòng)物”是本領(lǐng)域已知的，并且示例性哺乳動(dòng)物包括人、靈長(zhǎng)類、牛、豬、 犬、貓和嚙齒類(例如，小鼠和大鼠)。當(dāng)提及功能性質(zhì)或生物活性或過(guò)程(例如，酶活性或受體結(jié)合)使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)”指上調(diào)(例如，活化或刺激)、下調(diào)(例如，抑制或阻遏)或以其他方式改變此類性質(zhì)、活性或過(guò)程的質(zhì)量的能力。在特定情況下，此類調(diào)控可以視特定事件的發(fā)生而定，例如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的活化，和/或可以僅在特定細(xì)胞類型中表現(xiàn)。“調(diào)節(jié)劑”可以是多肽、核酸、大分子、復(fù)合物、分子、小分子、化合物、種類等(天然存在或非天然存在的)或由生物材料例如細(xì)菌、植物、真菌或動(dòng)物細(xì)胞或組織制備的提取物。調(diào)節(jié)劑可以通過(guò)在測(cè)定中包括就作為功能性質(zhì)、生物活性或過(guò)程或其組合的抑制劑或激活物(直接或間接)的潛在活性進(jìn)行評(píng)估(例如，激動(dòng)劑、部分拮抗劑、部分激動(dòng)劑、反激動(dòng)劑、拮抗劑、抗微生物試劑、微生物感染或增殖抑制劑等)。在此類測(cè)定中，許多調(diào)節(jié)劑可以同時(shí)進(jìn)行篩選。調(diào)節(jié)劑的活性可以是已知、未知或部分已知的。術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”和“核酸”可互換使用。它們指任何長(zhǎng)度的聚合形式的核苷酸， 脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸、或其類似物。多核苷酸可以具有任何三維結(jié)構(gòu)，并且可以進(jìn)行任何功能，已知或未知的。下述是多核苷酸的非限制性例子基因或基因片段的編碼或非編碼區(qū)、由連鎖分析限定的基因座(基因座)、外顯子、內(nèi)含子、信使RNA (mRNA)、轉(zhuǎn)移RNA、核糖體RNA、核酶、cDNA、重組多核苷酸、分支多核苷酸、質(zhì)粒、載體、任何序列的分離DNA、任何序列的分離RNA、核酸探針和引物。多核苷酸可以包括修飾核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸類似物。如果存在，那么對(duì)于核苷酸結(jié)構(gòu)的修飾可以在聚合物裝配前或后賦予。核苷酸的序列可以由非核苷酸組分間斷。多核苷酸可以進(jìn)一步修飾，例如通過(guò)用標(biāo)記組分綴合。 術(shù)語(yǔ)“重組”多核苷酸意指基因組、cDNA、半合成或合成起源的多核苷酸，其在自然界中不存在或以非天然排列與另一種多核苷酸連接?！盎颊摺薄ⅰ笆茉囌摺被颉八拗鳌敝溉嘶蚍侨藙?dòng)物。術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的載體”是領(lǐng)域公認(rèn)的，并且指藥學(xué)上可接受的材料、組合物或媒介物，例如液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑、溶劑或封裝材料，涉及攜帶或轉(zhuǎn)運(yùn)任何主題組合物或其組分從機(jī)體的一個(gè)器官或部分到機(jī)體的另一個(gè)器官或部分。每個(gè)載體必須在與主題組合物及其組分相容并且對(duì)患者無(wú)害的含義中是“可接受的”。可以充當(dāng)藥學(xué)上可接受的載體的材料的某些例子包括(1)糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉；(3)纖維素及其衍生物，例如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和乙酸纖維素；(4)黃蓍膠粉；(5)麥芽；(6)明膠；(7)滑石；(8)賦形劑，例如可可脂和栓劑蠟；(9)油，例如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和大豆油；(10) 二醇，例如丙二醇；(11)多元醇，例如丙三醇、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯，例如油酸乙酯和十二烷酸乙酯；(13)瓊脂；(14)緩沖試劑，例如氫氧化鎂和氫氧化鋁；(15)海藻酸；(16)無(wú)熱原水；(17)等滲鹽水；(18)林格氏(Ringer’ s)溶液；(19)乙醇；(20)磷酸鹽緩沖溶液；和 (21)在藥物制劑中采用的其他無(wú)毒相容物質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的鹽”是領(lǐng)域公認(rèn)的，并且指化合物相對(duì)無(wú)毒的、無(wú)機(jī)和有機(jī)酸加成鹽，包括例如在本文描述的組合物中含有的那些。當(dāng)提及參考多肽中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“多肽片段”或“片段”指這樣的多肽，其中與參考多肽其自身比較，氨基酸殘基缺失，但其中其余氨基酸序列通常等同于參考多肽中的相應(yīng)位置。此類缺失可以在參考多肽的氨基末端或羧基末端或可替代地兩者上發(fā)生。片段一般是至少5、6、8或10個(gè)氨基酸長(zhǎng)，至少14個(gè)氨基酸長(zhǎng)，至少20、30、40或50個(gè)氨基酸長(zhǎng)，至少75個(gè)氨基酸長(zhǎng)，至少100、150、200、300、500個(gè)或更多個(gè)氨基酸長(zhǎng)。片段可以保留參考多肽的一種或多種生物活性。在特定實(shí)施方案中，片段可以包括成藥區(qū)域，和任選地在成藥區(qū)域的一側(cè)或兩側(cè)上的另外氨基酸，所述另外氨基酸可以從5、10、15、20、30、40、50個(gè)或直到 100個(gè)或更多個(gè)殘基編碼。進(jìn)一步地，片段可以包括特定區(qū)域的亞片段，所述亞片段保留它由之衍生的區(qū)域的功能。在另一個(gè)實(shí)施方案中，片段可以具有免疫原性性質(zhì)。片段可以在野生型蛋白質(zhì)的N或C末端上缺乏約1、2、5、10、20、50、100個(gè)或更多個(gè)氨基酸。術(shù)語(yǔ)“小分子”是領(lǐng)域公認(rèn)的，并且指這樣的組合物，其具有小于約2000 amu、或小于約1000 amu且甚至小于約500 amu的分子量。小分子可以是例如核酸、肽、多肽、肽核酸、擬肽、碳水化合物、脂質(zhì)或其他有機(jī)(含碳)或無(wú)機(jī)分子。許多制藥公司具有化學(xué)和/或生物制品混合物的廣泛文庫(kù)，通常為真菌、細(xì)菌或藻類提取物，其可以用本文描述的任何測(cè)定進(jìn)行篩選。術(shù)語(yǔ)“小有機(jī)分子”指這樣的小分子，其通常鑒定為有機(jī)或醫(yī)學(xué)化合物，并且不包括唯一地核酸、肽或多肽的分子?！皝喖?xì)胞部分”是細(xì)胞或細(xì)胞外基質(zhì)的任何部分，如通過(guò)任何分餾或本領(lǐng)域已知的其他方法產(chǎn)生的。當(dāng)與氨基酸序列結(jié)合使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“基本上同源的”指彼此在序列中基本上等同或相似的序列，產(chǎn)生構(gòu)象同源性且因此保留一種或多種生物(包括免疫學(xué))活性至有用程度。 該術(shù)語(yǔ)不意欲暗示序列的共同進(jìn)化?！盎旧霞兓摹敝敢雅c天然伴隨其的組分分離的蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，蛋白質(zhì)是樣品中至少約80%、更優(yōu)選至少約90%、且最優(yōu)選至少約99%的總材料(按體積計(jì)、按濕或干重計(jì)、或按摩爾百分比或摩爾分?jǐn)?shù)計(jì))。純度可以通過(guò)任何合適方法進(jìn)行測(cè)量，例如，在多肽的情況下通過(guò)柱層析、凝膠電泳或HPLC分析?！鞍械鞍踪|(zhì)”是能夠由具有酶促或其他活性例如SIRT4的活性的蛋白質(zhì)起作用的任何蛋白質(zhì)、肽或其同系物。“靶mRNA”是能夠由拮抗性核酸起作用的任何信使RNA轉(zhuǎn)錄物，所述拮抗性核酸減少由mRNA編碼的蛋白質(zhì)表達(dá)或水平。SIRT4 蛋白質(zhì)
如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“SIRT4”或“SIRT4蛋白質(zhì)”指蛋白質(zhì)，例如真核蛋白質(zhì)，例如哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)，包括具有ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性的線粒體蛋白質(zhì)，以及其功能結(jié)構(gòu)域、片段(例如，功能片段)，例如至少8個(gè)氨基酸的片段，例如至少8、18、觀、64、128、150、180、200、 220,240,260或280個(gè)氨基酸，和變體。SIRT4的示例性功能片段可以例如具有ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性和/或與SIRT4結(jié)合配偶體相互作用的能力。示例性SIRT4蛋白質(zhì)包括指定 GenBank 匪 012240 (人 SIRT4 ;SEQ ID NO :1)禾Π XM 485674 (小鼠 SIRT4 ;SEQ ID NO 2) 的那些。SIRT4蛋白質(zhì)的同系物將與已知SIRT4蛋白質(zhì)共享60%、80%、85%、90%、95%、 98%、99%序列同一性，并且特征在于SIRT4活性，例如ADP核糖基化、脂肪酸氧化抑制、和 /或谷氨酸脫氫酶下調(diào)。真核SIRT4蛋白質(zhì)可以定位于例如線粒體。SIRT4蛋白質(zhì)的變體可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法產(chǎn)生，包括定點(diǎn)和隨機(jī)誘變。示例性組合物
包括本文描述的分離多肽或蛋白質(zhì)或其類似物的組合物可以包括小于約25%、10%， 或可替代地約5%，或可替代地約的污染生物大分子或多肽。在特定實(shí)施方案中，組合物含有SIRT4蛋白質(zhì)。任選地，組合物含有SIRT4蛋白質(zhì)和SIRT4相互作用蛋白質(zhì)。在其他實(shí)施方案中，SIRT4蛋白質(zhì)是變體，例如H161YSIRT4。在特定實(shí)施方案中，本文描述的蛋白質(zhì)與異源多肽進(jìn)一步連接，所述異源多肽例如包括增加其可溶性和/或促進(jìn)其純化、鑒定、檢測(cè)和/或結(jié)構(gòu)表征的結(jié)構(gòu)域的多肽。示例性結(jié)構(gòu)域包括例如谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、蛋白質(zhì)A、蛋白質(zhì)G、鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽、硫氧還蛋白、麥芽糖結(jié)合蛋白、HA、myc、聚精氨酸、聚His、聚His-Asp或FLAG融合蛋白和標(biāo)記。另外的示例性結(jié)構(gòu)域包括改變體內(nèi)蛋白質(zhì)定位的結(jié)構(gòu)域，例如信號(hào)肽、III型分泌系統(tǒng)-靶向肽、胞轉(zhuǎn)作用結(jié)構(gòu)域、核定位信號(hào)等。本文描述的蛋白質(zhì)可以與至少2、3、4、5種或更多種異源多肽連接。多肽可以與相同異源多肽的多個(gè)拷貝連接或與2種或更多種異源多肽連接。融合物可以在多肽的N末端上、多肽的C末端上、或多肽的N和C末端上出現(xiàn)。在本文描述的蛋白質(zhì)和融合結(jié)構(gòu)域之間包括接頭序列也在本發(fā)明的范圍內(nèi)，以便促進(jìn)融合蛋白的構(gòu)建或最佳化蛋白質(zhì)表達(dá)或融合蛋白的結(jié)構(gòu)限制。多肽也可以這樣構(gòu)建，以便在融合多肽和本發(fā)明的多肽之間含有蛋白酶切割位點(diǎn)，以便在蛋白質(zhì)表達(dá)后或其后去除標(biāo)記。合適內(nèi)切蛋白酶的例子包括例如因子敘和TEV蛋白酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)可以這樣進(jìn)行修飾，使得它穿過(guò)細(xì)胞膜的速率增加。 例如，多肽可以與第二種多肽融合，所述第二種多肽促進(jìn)“胞轉(zhuǎn)作用”，例如肽由細(xì)胞的攝取。肽可以是HIV反式激活因子(TAT)蛋白質(zhì)的部分，例如與TAT的殘基37-62或48-60 對(duì)應(yīng)的片段，已觀察到在體外由細(xì)胞快速吸收的部分(Green和Loewenstein，(1989) Cell 55:1179-1188)?？商娲兀瑑?nèi)在化肽可以衍生自果蠅觸角足蛋白質(zhì)，或其同系物。同源異型蛋白質(zhì)觸角足的60氨基酸長(zhǎng)同源異型結(jié)構(gòu)域已證實(shí)通過(guò)生物膜移位，并且可以促進(jìn)它與之偶聯(lián)的異源多肽的移位。因此，多肽可以與由用于胞轉(zhuǎn)作用的果蠅觸角足的約氨基酸 42-58 或較短片段組成的肽融合(Derossi 等人(1996) J Biol Chem 271 :18188-18193 ； Derossi 等人(1994) J Biol Chem 269 10444-10450 ；和 Perez 等人(1992) J Cell Sci 102:717-722)。胞轉(zhuǎn)作用多肽還可以是非天然存在的膜移位序列(MTS)，例如美國(guó)專利號(hào) 6，248, 558中公開(kāi)的肽序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述的蛋白質(zhì)用同位素標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記，以促進(jìn)其使用核磁共振或另一種可應(yīng)用技術(shù)的檢測(cè)和或結(jié)構(gòu)表征。示例性同位素標(biāo)記包括放射性同位素標(biāo)記，例如鉀-40 (4CIK)、碳-14 (14C)、氘(3H)、硫-35 (mS)、磷-32 (32P)、锝 _99m (99mTc), 鉈-201 (2CI1T1)、鎵-67 (67&0、銦-111 (111 )、碘-123 (1231)、碘-131 (1311)、釔-90 (90Y), 釤-153 (153Sm)、錸-186 (186Re)、錸-188 (188Re)、鏑-165 (lfi5Dy)和鈥-166 (166Ho)0 同位素標(biāo)記還可以是具有非零核自旋的原子，包括例如氫-1 (力)、氫-2 (2H)、氫-3 (3H)、磷-31 (31P)、鈉-23 ( 23Na)、氮-14 (14N)、氮-15 (1 )、碳-13 (13C)和氟-19 (19F)0 在特定實(shí)施方案中，多肽用同位素標(biāo)記均勻標(biāo)記，例如其中多肽中的至少50 %、70 %、80 %、90 %、95 % 或98 %可能標(biāo)記被標(biāo)記，例如其中多肽中的至少50 %、70 %、80 %、90 %、95 %或98 %氮原子是15N,和/或其中多肽中的至少50%、70%、80%、90%、95%或98%碳原子是13C,和/或其中多肽中的至少50%、70%、80%、90%、95%或98%氫原子是2H。在其他實(shí)施方案中，同位素標(biāo)記定位于多肽內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)特定位置中，例如標(biāo)記可以特異性摻入多肽的一個(gè)或多個(gè)亮氨酸殘基內(nèi)。本發(fā)明還包括其中單個(gè)多肽包括2、3種或更多種不同同位素標(biāo)記的實(shí)施方案；例如，多肽包括15N和13C標(biāo)記。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述的蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記，以促進(jìn)使用X射線晶體學(xué)或另一種可應(yīng)用技術(shù)的結(jié)構(gòu)表征。示例性標(biāo)記包括重原子標(biāo)記，例如鈷、硒、氪、溴、鍶、鉬、 釕、銠、鈀、銀、鎘、錫、碘、氙、鋇、鑭、鈰、鐠、釹、釤、銪、釓、鋱、鏑、鈥、鉺、銩、鐿、镥、鉭、鎢、 錸、鋨、銥、鉬、金、汞、鉈、鉛、釷和鈾。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，多肽用硒代甲硫氨酸進(jìn)行標(biāo)記。各種方法可用于制備具有標(biāo)記的多肽，所述標(biāo)記例如放射性同位素標(biāo)記或重原子標(biāo)記。例如，在一個(gè)此類方法中，將包括編碼多肽的核酸的表達(dá)載體引入宿主細(xì)胞內(nèi)，并且在標(biāo)記來(lái)源的存在下在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞，從而生成標(biāo)記多肽。多肽可以標(biāo)記的程度可以改變。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述的蛋白質(zhì)用熒光標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記，以促進(jìn)其檢測(cè)、 純化或結(jié)構(gòu)表征。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽與異源多肽序列融合，所述異源多肽序列產(chǎn)生可檢測(cè)熒光信號(hào)，包括例如綠色熒光蛋白(GFP)、增強(qiáng)型綠色熒光蛋白、 Renilla Reniformis綠色熒光蛋白、GFPmut2、GFPuv4、增強(qiáng)型黃色熒光蛋白(EYFP)、增強(qiáng)型青色熒光蛋白(ECFP)、增強(qiáng)型藍(lán)色熒光蛋白(EBFP)、來(lái)自香菇珊瑚的檸檬黃和紅色熒光蛋白(dsRED)。在其他實(shí)施方案中，本文描述的蛋白質(zhì)固定在固體表面上，包括微量滴定板、載玻片、珠、薄膜等。本文描述的蛋白質(zhì)可以作為陣列的部分固定在“芯片”上。具有多個(gè)地址的陣列可以包括在那些地址中的一個(gè)或多個(gè)中的一種或多種多肽。在其他實(shí)施方案中，本文描述的蛋白質(zhì)包含在對(duì)于處理多肽樣品有用的容器內(nèi)。 例如，本發(fā)明的多肽可以包含在微量滴定板內(nèi)，以促進(jìn)多肽的檢測(cè)、篩選或純化。多肽還可以包含在作為適合于給受試者施用多肽的容器的注射器內(nèi)，以便生成抗體或作為疫苗接種方案的部分。多肽還可以包含在NMR管內(nèi)，以便使得能夠通過(guò)核磁共振技術(shù)表征。在另外其他的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的晶狀多肽和已固定用于如下文進(jìn)一步描述的通過(guò)χ射線晶體學(xué)檢查的晶狀多肽。在特定情況下，以晶體形式的本文描述的蛋白質(zhì)可以是各種尺度的單晶(例如，微晶)或可以是結(jié)晶材料的聚集物。在特定實(shí)施方案中，提供本發(fā)明多肽的天然存在或?qū)嶒?yàn)衍生的同系物可以是有利的。此類同系物可以充當(dāng)調(diào)節(jié)劑，以促進(jìn)或抑制天然存在形式的多肽的生物活性子集。因此，特定生物效應(yīng)可以通過(guò)用功能有限的同系物處理來(lái)引發(fā)，并且相對(duì)于用激動(dòng)劑或拮抗劑處理具有較少的副作用，所述激動(dòng)劑或拮抗劑針對(duì)本發(fā)明多肽的所有生物活性。例如，可以生成拮抗性同系物，其干擾本發(fā)明的野生型多肽與特定蛋白質(zhì)結(jié)合的能力，但基本上不干擾天然多肽和其他細(xì)胞蛋白質(zhì)之間的復(fù)合物形成。編碼本文描述的任何蛋白質(zhì)或同系物的核酸也在本文中提供。核酸可以與啟動(dòng)子和/或其他調(diào)控序列進(jìn)一步連接，如本文進(jìn)一步描述的。示例性核酸是與本文提供的核苷酸序列或其片段至少約80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%等同的那些，例如編碼本文描述的蛋白質(zhì)片段的核酸序列。核酸還可以在嚴(yán)格雜交條件下與本文描述的核酸或其片段特異性雜交。本文還提供的是分子復(fù)合物，例如蛋白質(zhì)復(fù)合物，包括SIRT4蛋白質(zhì)或其同系物和線粒體蛋白質(zhì)，和任選地其他輔因子或分子。此類組合物和復(fù)合物可以例如在篩選測(cè)定中用于鑒定試劑，所述試劑調(diào)節(jié)SIRT4蛋白質(zhì)和線粒體蛋白質(zhì)之間的相互作用，以及ADP核糖基可轉(zhuǎn)移和靶蛋白質(zhì)之間的相互作用。本文描述的蛋白質(zhì)和復(fù)合物可以存在于溶液中。溶液可以是組合物，例如藥物組合物，例如包括藥學(xué)上可接受的稀釋劑。本文描述的蛋白質(zhì)或復(fù)合物也可以以晶體形式存在。晶狀復(fù)合物可以包括本文描述的蛋白質(zhì)和下述中的一種或多種組蛋白或其同系物、輔因子(例如鹽、金屬、核苷酸、寡核苷酸或多肽)、調(diào)節(jié)劑或小分子。在另一個(gè)方面，本發(fā)明考慮了晶狀復(fù)合物，其包括本發(fā)明的多肽和在體內(nèi)與多肽結(jié)合的任何其他分子或原子(例如金屬離子)。本文還提供的是這樣的抗體，其與SIRT4蛋白質(zhì)或其同系物和線粒體蛋白質(zhì)或其同系物之間的復(fù)合物特異性結(jié)合，但基本上不與單獨(dú)的SIRT4蛋白質(zhì)或同系物和單獨(dú)的線粒體蛋白質(zhì)或同系物結(jié)合。還提供的是與通過(guò)SIRT4起作用的蛋白質(zhì)或其他生物分子特異性結(jié)合的抗體?？贵w可以是全長(zhǎng)抗體、抗體片段(例如Fab或F(ab’》)、單克隆抗體、多克隆抗體、 單鏈抗體、嵌合抗體、人源化抗體、人抗體、微型抗體或任何其他形式的分子或分子復(fù)合物， 其與本文描述的分子復(fù)合物特異性結(jié)合。篩選方法
本文提供的是用于評(píng)估SIRT4活性且用于鑒定調(diào)節(jié)SIRT4活性例如脂肪酸氧化活性的測(cè)試化合物或試劑的方法。例如，本發(fā)明部分提供了評(píng)估SIRT4脂肪酸氧化抑制活性的方法，該方法包括提供包括SIRT4蛋白質(zhì)、催化脂肪酸氧化的酶和底物例如脂肪酸的無(wú)細(xì)胞組合物；并且評(píng)估組合物中的脂肪酸氧化活性。優(yōu)選地，該方法另外包括在無(wú)細(xì)胞組合物中包括測(cè)試化合物的步驟。測(cè)試化合物可以具有針對(duì)SIRT4蛋白質(zhì)的抑制性質(zhì)，并且本發(fā)明提供了這樣的方法，其包括步驟在催化脂肪酸氧化的酶和底物的存在下，使SIRT4蛋白質(zhì)與測(cè)試化合物接觸，測(cè)量在測(cè)試化合物的存在下脂肪酸氧化的測(cè)試速率，并且使脂肪酸氧化的測(cè)試速率與在不存在測(cè)試化合物的情況下獲得的脂肪酸氧化的對(duì)照速率比較，其中測(cè)試速率相對(duì)于對(duì)照速率的增加指示測(cè)試化合物的抑制性質(zhì)?？商娲兀瑴y(cè)試化合物具有針對(duì)SIRT4蛋白質(zhì)的刺激性質(zhì)，并且本發(fā)明提供了這樣的方法，其包括步驟在催化脂肪酸氧化的酶和底物的存在下，使SIRT4蛋白質(zhì)與測(cè)試化合物接觸，測(cè)量在測(cè)試化合物的存在下脂肪酸氧化的測(cè)試速率，并且使脂肪酸氧化的測(cè)試速率與在不存在測(cè)試化合物的情況下獲得的脂肪酸氧化的對(duì)照速率比較，其中測(cè)試速率相對(duì)于對(duì)照速率的降低指示測(cè)試化合物的刺激性質(zhì)。測(cè)試化合物對(duì)SIRT4的作用通過(guò)下述進(jìn)行測(cè)定提供包括SIRT4和測(cè)試化合物的反應(yīng)混合物，以及評(píng)估SIRT4的活性。本文描述的方法可以以多路或高流通量形式進(jìn)行，從而使得來(lái)自化學(xué)文庫(kù)的多個(gè)測(cè)試化合物可被測(cè)定。反應(yīng)混合物在體外提供，例如真核細(xì)胞， 例如肝細(xì)胞、棕色脂肪細(xì)胞和/或肌細(xì)胞?？商娲?，反應(yīng)混合物在體內(nèi)提供，例如在哺乳動(dòng)物受試者中。細(xì)胞組合物由其獲得的組織的非限制性例子包括肝、肌肉和棕色脂肪組織(BAT)。 細(xì)胞或細(xì)胞裂解產(chǎn)物可以來(lái)自真核細(xì)胞，例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如人細(xì)胞)、酵母細(xì)胞、非人靈長(zhǎng)類細(xì)胞、牛細(xì)胞、羊細(xì)胞、馬細(xì)胞、豬細(xì)胞、綿羊細(xì)胞、鳥(例如雞或家禽)細(xì)胞、犬細(xì)胞、 貓細(xì)胞或嚙齒類(小鼠或大鼠)細(xì)胞。它還可以是非哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如魚細(xì)胞。酵母細(xì)胞包括釀酒酵母(5 cer^isiae)和白色念珠菌(C albicans)。細(xì)胞還可以是原核細(xì)胞，例如細(xì)菌細(xì)胞。細(xì)胞還可以是單細(xì)胞微生物，例如原生動(dòng)物。細(xì)胞還可以是后生動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞。該方法可以進(jìn)一步包括測(cè)定測(cè)試化合物或試劑對(duì)生物活性的作用，所述生物活性例如SIRT4或其復(fù)合物的生物活性。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了使SIRT4蛋白質(zhì)與包括靶分子和測(cè)試化合物或與SIRT4相互作用的細(xì)胞組合物的其他組分的細(xì)胞組合物接觸，所述靶分子例如蛋白質(zhì)、 脂肪酸、核酸或相似生物部分，無(wú)論是天然還是合成衍生的，所述測(cè)試化合物具有直接對(duì)于 SIRT4的抑制性質(zhì)或刺激性質(zhì)。篩選測(cè)定還可以包括使用包括SIRT4蛋白質(zhì)和靶分子的細(xì)胞或細(xì)胞裂解產(chǎn)物或其部分；使細(xì)胞或細(xì)胞裂解產(chǎn)物或其部分與測(cè)試化合物接觸；且測(cè)定SIRT4蛋白質(zhì)和靶分子之間的相互作用是否受測(cè)試化合物的存在的影響。SIRT4蛋白質(zhì)和靶分子可以是例如由異源或外源核酸編碼的蛋白質(zhì)，即在天然存在的細(xì)胞中不存在的核酸。測(cè)試化合物
化合物或測(cè)試化合物可以是任何化學(xué)化合物，例如大分子(例如，多肽、蛋白質(zhì)復(fù)合物或核酸)或小分子(例如，氨基酸、核苷酸、有機(jī)或無(wú)機(jī)化合物)。測(cè)試化合物可以具有小于約 10 000克/摩爾、小于5 000克/摩爾、小于1 000克/摩爾、或小于約500克/摩爾的式量。測(cè)試化合物可以是天然存在的(例如，草藥或天然產(chǎn)物)、合成的或兩者。大分子的例子是蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)復(fù)合物和糖蛋白，核酸例如DNA、RNA (例如，雙鏈RNA或RNAi )和PNA (肽核酸)。小分子的例子是肽、擬肽(例如類肽)、氨基酸、氨基酸類似物、多核苷酸、多核苷酸類似物、核苷酸、核苷酸類似物、核苷、糖苷化合物、有機(jī)或無(wú)機(jī)化合物例如雜有機(jī)或有機(jī)金屬化合物。測(cè)試化合物可以是通過(guò)本文描述的方法測(cè)定的唯一物質(zhì)。可替代地，測(cè)試化合物的集合可以通過(guò)本文描述的方法連續(xù)或同時(shí)進(jìn)行測(cè)定。在一個(gè)實(shí)施方案中，高流通量篩選方法涉及提供含有大量潛在治療化合物(潛在調(diào)節(jié)劑或配體化合物)的組合化學(xué)或肽文庫(kù)。此類“組合化學(xué)文庫(kù)”或“配體文庫(kù)”隨后在一種或多種測(cè)定中進(jìn)行篩選，如本文描述的，以鑒定展示所需特征活性的那些文庫(kù)成員(特別是化學(xué)種類或亞類)。因此鑒定的化合物可以充當(dāng)常規(guī)“前導(dǎo)化合物”或其自身可以用作
16潛在或?qū)嶋H治療劑。組合化學(xué)文庫(kù)是通過(guò)使許多化學(xué)“構(gòu)件塊”例如試劑組合，由化學(xué)合成或生物合成生成的各種化學(xué)化合物的集合。例如，線性組合化學(xué)文庫(kù)例如多肽文庫(kù)通過(guò)使一組化學(xué)構(gòu)件塊(氨基酸)對(duì)于給定化合物長(zhǎng)度(即，多肽化合物中的氨基酸數(shù)目)以每種可能方式組合而形成。數(shù)百萬(wàn)種化學(xué)化合物可以通過(guò)化學(xué)構(gòu)件塊的此類組合混合來(lái)合成。組合化學(xué)文庫(kù)的制備和篩選是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。此類組合化學(xué)文庫(kù)包括但不限于肽文庫(kù)(參見(jiàn)例如，美國(guó)專利5，010，175 ;Furka，ht. J. Pept. Prot. Res. 37:487-493 (1991)和 Houghton 等人，Nature 354:84-88 (1991))。還可以使用用于生成化學(xué)多樣性文庫(kù)的其他化學(xué)品。此類化學(xué)品包括但不限于類肽(例如，PCT
發(fā)明者C. 海吉斯 M., 德貝爾 V. 申請(qǐng)人:哈佛大學(xué)校長(zhǎng)及研究員協(xié)會(huì)