專利名稱：新穎的基因sms 43的制作方法
新穎的基因SMS 43本發(fā)明涉及新鑒定出的基因，其編碼L-抗壞血酸(下文中也稱為維生素C)和/或 2_酮-L-古洛酸(下文中也稱為2-KGA)合成中涉及的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還涉及包含該新 穎基因的全長(zhǎng)多核苷酸序列的多核苷酸及其片段，所述多核苷酸編碼的新穎的多肽及其片 段，以及它們的功能等同物。本發(fā)明還涉及所述多核苷酸和多肽作為生物技術(shù)工具在從微 生物生產(chǎn)維生素C和/或2-KGA中的用途，其中對(duì)所述多核苷酸和/或被編碼的多肽的修飾 對(duì)在所述微生物中生產(chǎn)所述發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)率、產(chǎn)量和/或效率有著直接或間接的影響。本 發(fā)明還包括使用所述多核苷酸和經(jīng)修飾的多核苷酸序列轉(zhuǎn)化宿主微生物的方法/工藝。本 發(fā)明還涉及經(jīng)過(guò)遺傳工程改造的微生物及其用于直接生產(chǎn)維生素C和/或2-KGA的用途。維生素C是對(duì)人類來(lái)說(shuō)非常重要且必不可少的營(yíng)養(yǎng)因子。維生素C還用于動(dòng)物飼 料，盡管一些畜牧動(dòng)物可自身合成維生素C。在過(guò)去的70年中，已通過(guò)公知的Reichstein方法從D-葡萄糖對(duì)維生素C進(jìn)行了 工業(yè)生產(chǎn)。該工藝中的所有步驟都是通過(guò)化學(xué)方式進(jìn)行的，只除了其中一個(gè)步驟(從D-山 梨糖醇到L-山梨糖的轉(zhuǎn)化)，其通過(guò)微生物轉(zhuǎn)化來(lái)進(jìn)行。從對(duì)維生素C的工業(yè)生產(chǎn)的最初 實(shí)踐開(kāi)始，就已使用了多種化學(xué)改良和技術(shù)改良，來(lái)提高Reichstein方法的效率。近來(lái)對(duì) 維生素 C 生產(chǎn)的發(fā)展被概括于 Ullmann，s Encyclopedia of Industrial Chemistry, 5th Edition,Vol.A27(1996)，pp. 547ff 中。維生素C生產(chǎn)的不同中間步驟已在微生物或從中分離出的酶的協(xié)助下進(jìn)行。因 此，可通過(guò)發(fā)酵工藝，通過(guò)屬于例如Ketogulonicigenium屬或Gluconobacter屬的菌株從 L-山梨糖或D-山梨糖醇起始來(lái)生產(chǎn)2-KGA (這是可通過(guò)堿性重排反應(yīng)化學(xué)轉(zhuǎn)化為維生素C 的中間產(chǎn)物)，或者通過(guò)屬于Gluconobacter屬或Pantoea屬的重組菌株，從D-葡萄糖起始 進(jìn)行另一種發(fā)酵工藝來(lái)生產(chǎn)2-KGA。目前用于對(duì)維生素進(jìn)行化學(xué)生產(chǎn)的方法具有一些人們不想要的特征，例如高能耗 以及要使用大量的有機(jī)及無(wú)機(jī)溶劑。因此，在過(guò)去數(shù)十年中，人們已在研究更加經(jīng)濟(jì)且環(huán)保 的用微生物轉(zhuǎn)化來(lái)制造維生素C的其它方法。從大量底物(包括D-山梨糖醇、L-山梨糖和L-山梨糖酮)來(lái)直接生產(chǎn)維生素 C已在多種微生物中被報(bào)道過(guò)，所述微生物例如藻類、酵母和乙酸細(xì)菌，其中使用了不同 的培養(yǎng)方法。已知能直接生產(chǎn)維生素C的細(xì)菌的例子包括，例如，來(lái)自Gluconobacter、 Gluconacetobacter、Acetobacter、Ketogulonicigenium、Pantoea、Pseudomonas 或 Escherichia屬的菌株。已知酵母或藻類的例子包括，例如Candida、Saccharomyces、 ZygosaccharomycesλSchizosaccharomyces、Kluyveromyces 或 Chlorella0能吸收D-山梨糖醇用于生長(zhǎng)的微生物通常具有能將該化合物氧化為普遍性的同 化吸收底物(例如D-果糖)的酶。能在L-山梨糖上生長(zhǎng)的微生物還擁有一種酶——NAD(P) H-依賴性L-山梨糖還原酶，該酶可將該化合物還原為D-山梨糖醇，D-山梨糖醇再被進(jìn)一 步氧化為D-果糖。被D-果糖激酶磷酸化之后，D-果糖成為很多微生物生長(zhǎng)的優(yōu)秀底物。例如，在乙酸細(xì)菌(其是專性需氧的革蘭氏陰性微生物，屬于Acetobacter、 Gluconobacter和Gluconacetobacter屬)的情況下，這些微生物能將D-山梨糖醇轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)胞質(zhì)溶膠(cytosol)，并通過(guò)胞質(zhì)溶膠中的NAD-依賴性D-山梨糖醇脫氫酶將其轉(zhuǎn) 化為D-果糖。一些個(gè)體菌株，例如Gluconobacter oxydans IFO 3292和IFO 3293還 能將L-山梨糖轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)胞質(zhì)溶膠，并通過(guò)胞質(zhì)溶膠中的NAD(P)H-依賴性L-山梨糖還原 酶將其還原為D-山梨糖醇，D-山梨糖醇再被進(jìn)一步氧化為D-果糖。在這些細(xì)菌中， Embden-Meyerhof-Parnas途徑以及三羧酸循環(huán)并不具有完全活性，將糖導(dǎo)向中央代謝的主 要途徑是磷酸戊糖途徑。通過(guò)磷酸化反應(yīng)從D-果糖獲得的D-果糖-6-磷酸進(jìn)入磷酸戊糖 途徑，其被進(jìn)一步代謝，產(chǎn)生以NAD (P)H形式存在的還原能量和生長(zhǎng)及維持所必需的三羧 基化合物。乙酸細(xì)菌因其能不完全氧化不同底物(例如醇、糖、糖醇和醛)的能力而為人們公 知。這些過(guò)程為人們所已知并通常被稱為氧化發(fā)酵或不完全氧化，它們已被長(zhǎng)時(shí)間應(yīng)用于 食品和化學(xué)工業(yè)中，尤其是對(duì)醋和L-山梨糖的生產(chǎn)中。已知能用屬于Gluconobacter屬的 菌株從D-山梨糖醇或L-山梨糖進(jìn)行不完全氧化獲得的有用產(chǎn)物是2-KGA。乙酸細(xì)菌通過(guò)位于周質(zhì)空間中、周質(zhì)膜上或胞質(zhì)中的不同脫氫酶來(lái)完成這些不完 全氧化反應(yīng)。不同的脫氫酶使用不同的輔助因子，最常見(jiàn)的是用于膜結(jié)合酶或周質(zhì)酶的PQQ 和FAD，以及用于胞質(zhì)酶的NAD/NADP。雖然這些氧化反應(yīng)的所有產(chǎn)物都通過(guò)外層膜分散回到外界水環(huán)境，但是它們中的 一些可被主動(dòng)或被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)細(xì)胞，并進(jìn)一步用于與生長(zhǎng)和能量形成有關(guān)的代謝途徑。細(xì)胞 中，氧化產(chǎn)物可被還原酶多次還原回它們的最初底物，然后被導(dǎo)向進(jìn)入中央代謝。在D-山梨糖醇或L-山梨糖的代謝中具有活性的蛋白質(zhì)，尤其是酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白， 在本文中被稱為涉及山梨糖醇/山梨糖代謝系統(tǒng)(Sorbitol/Sorbose Metabolization System)。此類蛋白質(zhì)在本文中被縮寫為SMS蛋白，其在對(duì)D-山梨糖醇或L-山梨糖的直接 代謝中發(fā)揮作用。D-山梨糖醇或L-山梨糖的代謝包括一方面，將這些化合物吸收進(jìn)胞質(zhì)溶膠，以 及進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為可用于吸收途徑的代謝物，所述吸收途徑例如Embden-Meyerhof-Parnas 途徑、磷酸戊糖途徑、Entner-Doudoroff途徑以及三羧酸循環(huán)，它們都涉及對(duì)于活的細(xì)胞的 生長(zhǎng)和維持來(lái)說(shuō)必要的全部關(guān)鍵的能量形成和合成代謝反應(yīng)。另一方面，D-山梨糖醇或 L-山梨糖的代謝還包括通過(guò)所謂的不完全氧化過(guò)程將這些化合物轉(zhuǎn)化為經(jīng)進(jìn)一步氧化的 產(chǎn)物，例如L-山梨糖酮、2-KGA和維生素C。本發(fā)明的一個(gè)目的是提高維生素C和/或2-KGA生產(chǎn)的產(chǎn)率和/或生產(chǎn)能力。令人吃驚地，我們發(fā)現(xiàn)，SMS蛋白或此類蛋白的涉及對(duì)D-山梨糖醇、L-山梨糖或 L-山梨糖酮的吸收或轉(zhuǎn)化或具有針對(duì)此的活性的亞基在對(duì)維生素C和/或2-KGA的生物技 術(shù)生產(chǎn)中具有重要作用。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的SMS蛋白選自轉(zhuǎn)移酶[EC 2]例如激酶和磷酸酶，優(yōu) 選地選自轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)[EC 2. 7]，更優(yōu)選地選自以含氮基團(tuán)作為受體的磷酸轉(zhuǎn)移酶[EC 2. 7. 3]。此外，本發(fā)明的SMS蛋白可選自與膜結(jié)合的PQQ依賴性的D-山梨糖醇脫氫酶、與 膜結(jié)合的L-山梨糖脫氫酶、與膜結(jié)合的L-山梨糖酮脫氫酶、與膜結(jié)合的FAD依賴性的D-山 梨糖醇脫氫酶、胞質(zhì)NAD依賴性的D-山梨糖醇脫氫酶、NAD(P)依賴性的D-山梨糖醇脫氫 酶(也被稱為NADPH依賴性的山梨糖還原酶)、NAD依賴性的木糖醇脫氫酶、NAD依賴性的醇脫氫酶、與膜結(jié)合的L-山梨糖脫氫酶、NAD (P) H依賴性的L-山梨糖還原酶、胞質(zhì)NADP依 賴性的山梨糖酮脫氫酶、胞質(zhì)NAD (P) H依賴性的L-山梨糖酮還原酶、與膜結(jié)合的醛脫氫酶、 胞質(zhì)醛脫氫酶、3-磷酸甘油脫氫酶、3-磷酸甘油醛脫氫酶以及SMS功能中涉及的其它蛋白 質(zhì)構(gòu)成的組，所述其它蛋白質(zhì)包括任何上述脫氫酶和還原酶的調(diào)節(jié)(例如信號(hào)傳導(dǎo))中涉 及的蛋白質(zhì)，例如作為感受傳導(dǎo)蛋白激酶/磷酸酶，其為具有發(fā)送器(transmitter)和接收 器(receiver)模塊、尤其具有規(guī)范組氨酸激酶發(fā)送器和天冬氨酸接收器模塊的多(例如 二)_組分調(diào)節(jié)蛋白系統(tǒng)。特別地，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，具有下述核苷酸序列的多核苷酸編碼的SMS蛋白在對(duì)維生素C 和/或2-KGA的生物技術(shù)生產(chǎn)中具有重要作用，該核苷酸序列能在優(yōu)選高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與 SEQ ID NO :1所示的序列雜交?，F(xiàn)還已發(fā)現(xiàn)，通過(guò)在能直接生產(chǎn)維生素C的微生物(例如 Gluconobacter)中對(duì)根據(jù)本發(fā)明的核苷酸的表達(dá)水平進(jìn)行遺傳改變，可很大程度地提高所 述微生物對(duì)維生素C和/或2-KGA的直接發(fā)酵。隨后，本發(fā)明涉及選自下述組的多核苷酸或此類多核苷酸的互補(bǔ)鏈，所述組由(a)編碼包含根據(jù)SEQ ID NO 2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(b)包含根據(jù)SEQ ID NO 1的核苷酸序列的多核苷酸；(c)包含下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列可使用來(lái)自微生物的基因 組DNA作為模板，并使用根據(jù)SEQ ID NO 3和SEQ IDNO 4的引物組，通過(guò)核酸擴(kuò)增(例如 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))來(lái)獲得；(d)多核苷酸，其包含編碼被(a)至(C)中任一項(xiàng)的多核苷酸編碼的多肽的片段或 衍生物的核苷酸序列，其中，在所述衍生物中，一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基較之所述多肽被保守 取代，并且，所述片段或衍生物具有轉(zhuǎn)移酶[EC 2]的活性，優(yōu)選地具有轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)的磷 酸轉(zhuǎn)移酶[EC 2. 7] (SMS43)的活性；(e)編碼轉(zhuǎn)移酶[EC 2]，優(yōu)選地編碼轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)的磷酸轉(zhuǎn)移酶[EC2. 7] (SMS 43)多肽的多核苷酸，且其互補(bǔ)鏈能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(a)至(d)中任一項(xiàng)所定義的多核苷酸 雜交；以及(f)編碼轉(zhuǎn)移酶[EC 2]，優(yōu)選地編碼轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)的磷酸轉(zhuǎn)移酶[EC2. 7] (SMS 43)多肽的多核苷酸，且其與(a)至(d)中任一項(xiàng)所定義的多核苷酸至少60%相同，例如 70%、85%、90%或 95%相同；構(gòu)成。我們發(fā)現(xiàn)，本文中描述的SEQ ID NO :2示出的從Gluconobacteroxydans DSM 17078分離的SMS蛋白是特別有用的SMS蛋白，因?yàn)榭雌饋?lái)其在微生物(特別是細(xì)菌，例如 乙酸細(xì)菌，例如 Gluconobacter, Acetobacter 禾口 Gluconacetobacter)中的直接維生素 C 生 產(chǎn)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此，本發(fā)明涉及編碼根據(jù)SEQ ID NO :2的多肽的多核苷酸。該蛋白 可由SEQ ID NO :1示出的核苷酸序列編碼。本發(fā)明因此還涉及包含根據(jù)SEQ ID N0:1的核 苷酸序列的多核苷酸。上文確定的核苷酸序列和氨基酸序列被用作為“查詢序列”，以便用來(lái)自National Center for Biotechnology[NCBI]的 BLAST 或 Blast2 程序(版本 2)針對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù) PRO SW-SwissProt (完全發(fā)布版本加上增加的更新)進(jìn)行搜索。根據(jù)這些搜索結(jié)果，將根據(jù)SEQ ID NO :1的SMS 43多核苷酸標(biāo)注為編碼具有組氨酸激酶/磷酸酶發(fā)送器和天冬氨酸接收器活性的蛋白質(zhì)。SEQ ID NO :2編碼的蛋白質(zhì)發(fā)揮下述各個(gè)蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)物/活化物的作 用，所述蛋白質(zhì)包括脫氫酶，尤其是可由根據(jù)SEQ ID NO :9的多核苷酸編碼的例如SEQ ID NO :10中所示的L-山梨糖酮脫氫酶。本發(fā)明的蛋白質(zhì)可與其它調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)組合發(fā)揮作用， 所述其它調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)例如為可由根據(jù)SEQ ID N0:11或N0:13的多核苷酸編碼的如SEQ ID NO :12或NO 14中所示的蛋白質(zhì)。可使用cDNA、mRNA或基因組DNA作為模板，使用合適的寡核苷酸引物(例如根據(jù) SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4的核苷酸引物)，按照標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增技術(shù)，通過(guò)核酸擴(kuò)增來(lái)獲 得根據(jù)本發(fā)明的核酸。由此擴(kuò)增出的核酸可被克隆進(jìn)合適的載體，并通過(guò)DNA序列分析對(duì) 其進(jìn)行表征。用于反應(yīng)的模板可以是通過(guò)對(duì)從已知包含或懷疑包含根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸的 菌株制備的mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA。PCR產(chǎn)物可被亞克隆和測(cè)序，以確保擴(kuò)增出的序 列代表本文所述的新的核酸序列或其功能等同物的序列。然后可通過(guò)多種已知方法，用PCR片段分離全長(zhǎng)cDNA克隆。例如，可標(biāo)記擴(kuò)增出 的片段，用其篩選噬菌體或粘粒(Cosmid)CDNA文庫(kù)?；蛘?，經(jīng)標(biāo)記的片段可用于篩選基因 組文庫(kù)。因此，本發(fā)明涉及包含下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列可使用來(lái)自 微生物的基因組DNA作為模板，并使用根據(jù)SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4的引物組，通過(guò)核 酸擴(kuò)增(例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))來(lái)獲得。本發(fā)明還涉及下述多核苷酸，其包含編碼本文所述的多核苷酸編碼的多肽的片段 或衍生物的核苷酸序列，其中，在所述衍生物中，一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基較之所述多肽被保 守取代，并且，所述片段或衍生物具有SMS多肽(優(yōu)選地，SMS 43多肽)的活性。本發(fā)明還涉及下述多核苷酸，其編碼SMS多肽(優(yōu)選地，SMS 43多肽)，其互補(bǔ)鏈 能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與本文定義的多核苷酸雜交。本發(fā)明還涉及下述多核苷酸，其與本文定義的多核苷酸至少60%相同，并且其編 碼SMS多肽；本發(fā)明還涉及是上文定義的多核苷酸的互補(bǔ)鏈的多核苷酸。本發(fā)明還涉及下述引物、探針和片段，其可用于擴(kuò)增或檢測(cè)根據(jù)本發(fā)明的DNA，和 用于鑒定也帶有這類基因的相關(guān)種或科的微生物。本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明多核苷酸的載體，和用多核苷酸或所述載體遺傳工程改 造過(guò)的微生物。本發(fā)明還涉及用于生產(chǎn)下述微生物的方法，所述微生物能夠表達(dá)上文定義的多核 苷酸編碼的多肽和如上文所定義的多核苷酸編碼的多肽。本發(fā)明還涉及下述微生物，其中，SMS多肽(優(yōu)選地，SMS 43多肽)的活性增強(qiáng)和 /或提高，使得從D-山梨糖醇或L-山梨糖直接生產(chǎn)的維生素C和/或2-KGA的產(chǎn)率增加。 這可例如通過(guò)將根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸轉(zhuǎn)入重組或非重組微生物來(lái)完成，所述為生物可以 含有SMS 43基因的內(nèi)源等同物，或者可以不含。技術(shù)人員將知道如何增強(qiáng)和/或提高SMS蛋白(優(yōu)選地，SMS 43蛋白)的活性。 這些可以例如增加SMS蛋白(優(yōu)選地，SMS 43蛋白)的比活性，或者通過(guò)對(duì)宿主生物進(jìn)行 遺傳修飾來(lái)完成，所述遺傳修飾以較之野生型生物產(chǎn)生更多或更穩(wěn)定的SMS蛋白(優(yōu)選地， SMS 43蛋白)的拷貝的方式來(lái)進(jìn)行。
在下述說(shuō)明書中，將對(duì)達(dá)到此目的(即，通過(guò)增加SMS 43蛋白的活性，增加從 D-山梨糖醇或L-山梨糖直接生產(chǎn)的維生素C和/或2-KGA的產(chǎn)率和/或產(chǎn)量)的方案進(jìn) 行詳細(xì)描述。在進(jìn)行必要修正后，這些方案可應(yīng)用于其它SMS蛋白。為獲得產(chǎn)生更多拷貝的SMS 43基因(即，過(guò)量表達(dá)該基因)和/或蛋白的生物進(jìn) 行的修飾包括使用強(qiáng)啟動(dòng)子，或者對(duì)SMS 43基因(的部分)或其調(diào)控元件加以突變(例 如，插入、缺失或點(diǎn)突變)。這還可包括將多個(gè)拷貝的基因插入到合適的微生物中。SMS 43 蛋白比活性的增加也可通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法來(lái)完成。此類方法可包括對(duì)SMS 43基因(的 部分)的突變(例如，插入、缺失或點(diǎn)突變)。如果基因的轉(zhuǎn)錄水平較之野生型基因有所增 強(qiáng)，那么認(rèn)為該基因被“過(guò)量表達(dá)”。這可通過(guò)例如對(duì)mRNA的量加以定量的Northern印跡 分析來(lái)測(cè)量，mRNA的量被用作為對(duì)基因表達(dá)的指示。在本文中，如果產(chǎn)生的mRNA的量較之 野生型基因產(chǎn)生的mRNA的量增加至少1%、2%、5%、10%、25%、50%、75%、100%、200% 或者甚至超過(guò)500%，那么基因就是過(guò)量表達(dá)的。本領(lǐng)域中還已知可以通過(guò)將SMS 43蛋白與特定增強(qiáng)子相接觸或與能與SMS 43蛋 白發(fā)生特異性相互作用的其它物質(zhì)相接觸，來(lái)增強(qiáng)給定蛋白質(zhì)活性。為鑒定出此類特定增 強(qiáng)子，可表達(dá)SMS 43蛋白，并對(duì)存在懷疑能增強(qiáng)SMS 43蛋白活性的化合物時(shí)的活性加以測(cè) 試。還可通過(guò)對(duì)編碼SMS 43的信使RNA進(jìn)行穩(wěn)定化來(lái)增加SMS 43蛋白的活性。此類方 法也是本領(lǐng)域已知的，見(jiàn)，例如 Sambrook et al.，1989，Molecular Cloning, ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N. Y.禾口 Ausubel et al. (eds. ),1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons, N.Y.)。合適的宿主細(xì)胞包括下述微生物細(xì)胞，其能夠生產(chǎn)給定的發(fā)酵產(chǎn)物，例如將給定 的碳源直接轉(zhuǎn)化成維生素C和/或2-KGA，和帶有SMS 43基因或其等同物或同源物。帶有 這類基因或其等同物的合適的微生物可選自細(xì)菌，尤其是乙酸細(xì)菌，它們可以是野生型菌 株或通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的誘變方法和選擇方法獲得的突變體菌株以及重組菌株。此類細(xì)菌的例子 可以是，例如，Gluconobacterλ AcetobacterΛ GluconacetobacterΛ Ketogulonicigenium、 Methylobacterium 禾口 Magnetospirillum。優(yōu)選的是 Gluconobacter 或 Acetobacter, 例 如，G. oxydans、G.cerinus、G.frateurii、G. industrius、G. thailandicus、 G. rubiginosus、G. melanogenus、A. aceti、A. aceti subsp. xylinum、A. aceti subsp. orleanus、Methylobacterium sp. 4—46、Methylobacterium chloromethanicum CM4、 Methylobacterium extorquensPAl、Methylobacterium populi BJ001、Magnetospirillum gryphiswaldenseMSR-1 或 Magnetospirillum magneticum AMB-1，更優(yōu)選地是 G. oxydans?？捎糜诒景l(fā)明的微生物可被公眾從不同來(lái)源獲得，例如，DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ)，Inhoffenstr. 7B，D-38124 Braunschweig, Germany、American Type Culture Collection (ATCC)，P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108 USA 或 Culture Collection Division, NITE Biological Resource Center， 2-5-8，Kazusakamatari，Kisarazu-shi，Chiba，292-0818，Japan(以前是 Institue for Fermentation，Osaka (IFO)，17-85，Juso-honmachi 2-chome，Yodogawa-ku，Osaka 532-8686，Japm)。這類菌株的合適的例子可在例如WO 2006/084719中找到或列于表1中， 包括下述微生物，其帶有編碼L-山梨糖酮脫氫酶的基因，例如編碼與膜結(jié)合的L-山梨糖酮 脫氫酶(SNDHai)或其等同物的基因，如SEQ ID NO :9中所示和W02005/017159中所公幵。特別優(yōu)選的是 Gluconobacter oxydans DSM 17078 (先前已知為 Gluconobacter oxydans N44-1 并描述于 Sugisawa 等，Agric. Biol. Chem. 54 1201-1209，1990 中)，其在 2005 年 1 月 26 日保藏于 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ)on 26.January 2005。在關(guān)于本發(fā)明的方面，應(yīng)當(dāng)理解，上述微生物還包括此類菌株的具有同樣生理屬 性的異名(synonym)或基原異名(basonym),其如 International Code of Nomenclature of Prokaryotes所定義。本文中使用的對(duì)微生物的命名是International Committee on Systematics of Prokaryotes andthe Bacteriology and Applied Microbiology Division of the International Unionof Microbiological Societies 官方接受的(在 優(yōu)先權(quán)申請(qǐng)的提交日期時(shí))，并被其官方出版物International Journal of Systematic and EvolutionaryMicrobiology(IJSEM)所公開(kāi)。具體的參考文獻(xiàn)是 Urbance et al.， IJSEM(200l)vol 51 :1059_1070，以及 IJSEM(2001) vol 51 1231-1233 上的修訂通知，其中 描述了對(duì)作為Ketogulonicigenium vulgare的G. oxydans DSM 4025的分類學(xué)上的重新歸 類。本發(fā)明涉及經(jīng)修飾的微生物，其中所述修飾導(dǎo)致從底物(例如D-山梨糖醇或 L-山梨糖)直接生產(chǎn)維生素C和/或2-KGA的提高的產(chǎn)率、產(chǎn)量和/或效率。這可通過(guò)提 高本文所述的SMS 43基因的活性來(lái)進(jìn)行。另外，本發(fā)明的微生物可在DNA水平或蛋白質(zhì)水 平上攜帶其它修飾(見(jiàn)上文所述)，只要此類修飾對(duì)從底物(例如D-山梨糖醇或L-山梨 糖)直接生產(chǎn)維生素C和/或2-KGA的產(chǎn)率、產(chǎn)量和/或效率具有直接影響即可。此類其 它修飾可以例如影響編碼上文所述的SMS蛋白的其它基因，特別是，編碼與膜結(jié)合的L-山 梨糖酮脫氫酶或與膜結(jié)合的PQQ結(jié)合D-山梨糖醇脫氫酶的基因。進(jìn)行此類修飾的方法是 本領(lǐng)域已知的，一些例子在本文中有進(jìn)一步描述。用于直接生產(chǎn)維生素C的這樣的與膜結(jié) 合的L-山梨糖酮脫氫酶及其核苷酸和氨基酸序列公開(kāi)于WO 2005/017159中。修飾也可以 影響涉及所述脫氫酶(優(yōu)選L-山梨糖酮脫氫酶)調(diào)節(jié)的其它基因，尤其是W02005/017159 中公開(kāi)的基因。一個(gè)特定的例子是下述修飾，其影響例如SEQ ID NO :11所示的編碼根據(jù) SEQ ID NO :12的蛋白質(zhì)的基因或其同源物。導(dǎo)致直接生產(chǎn)維生素C和/或2-KGA的提高 的產(chǎn)率、產(chǎn)量和/或效率的修飾可以是編碼根據(jù)SEQ ID NO :12的蛋白質(zhì)的DNA序列中的 修飾，優(yōu)選地是位于SEQ ID NO 12所示序列的300位和600位之間的至少一個(gè)突變，更優(yōu) 選地是563位上的替換，進(jìn)一步更優(yōu)選地是用另一氨基酸置換T563，最優(yōu)選地是用1563置 換T563，如例如SEQ ID N0:14中所示。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的重組微生物可以帶有例如影響 SMS 43基因或其同源物的一個(gè)修飾，或者可帶有例如影響本文所述的多核苷酸的多個(gè)修飾 (即多于1、2、3個(gè)或更多的修飾)加上脫氫酶(尤其是根據(jù)WO 2005/017159的L-山梨糖 酮脫氫酶)和/或所述脫氫酶調(diào)節(jié)物(尤其是根據(jù)SEQ ID NO :11的基因或同源物，尤其是 根據(jù)SEQ ID NO 13的基因)中的修飾。另外，這類修飾可例如影響下述基因，所述基因編碼D-山梨糖醇和/或L-山梨糖 代謝中涉及的多肽(其例如發(fā)揮SMS 43的阻抑物或誘導(dǎo)物/活化物的作用)和/或編碼 上述脫氫酶，尤其是導(dǎo)致所述阻抑物的活性降低或消除或所述誘導(dǎo)物/活化物活性提高的 修飾。技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道如何降低所述阻抑物的活性。這可以例如通過(guò)如下任一來(lái)實(shí)現(xiàn)以使宿主生物比野生生物生產(chǎn)更少拷貝的阻抑物或不生產(chǎn)所述阻抑物的方式遺傳修飾 宿主生物，或者降低或者消除所述阻抑物的比活性。目的是使生物生產(chǎn)更少拷貝的阻抑物基因和/或蛋白質(zhì)或者不生產(chǎn)阻抑物基因 和/或蛋白質(zhì)的修飾包括使用弱啟動(dòng)子，或突變(例如插入、缺失或點(diǎn)突變)基因(的部 分)或其調(diào)節(jié)元件，從而敲除或足抑制所述阻抑物，從而在被引入合適的宿主細(xì)胞時(shí)提高 發(fā)酵產(chǎn)物生產(chǎn)的產(chǎn)率、產(chǎn)量和/或效率。降低或消除蛋白質(zhì)的比活性也可以通過(guò)本領(lǐng)域已 知的方法完成。這類方法可包括基因(的部分)的突變(例如插入、缺失或點(diǎn)突變)。這可 例如影響蛋白質(zhì)N-端區(qū)域介導(dǎo)的與DNA的相互作用，或者與其它效應(yīng)器分子的相互作用。 在本文中使用時(shí)，“基因表達(dá)的阻抑”包括完全或部分阻抑，以及在特定條件下的阻抑，還有 兩個(gè)等位基因任一的表達(dá)的阻抑。本領(lǐng)域還已知的是通過(guò)將各自的阻抑物蛋白質(zhì)與特異性抑制劑或與所述蛋白質(zhì) 特異性相互作用的其它物質(zhì)接觸，來(lái)降低或消除給定蛋白質(zhì)的活性的方法。為了鑒定這類 特異性抑制劑，可以在存在懷疑抑制所述蛋白質(zhì)活性的化合物時(shí)，表達(dá)和測(cè)試所述蛋白質(zhì)。 可能的抑制性化合物可以例如是針對(duì)所述蛋白質(zhì)的單克隆或多克隆抗體。這類抗體可通過(guò) 合適的實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物的常規(guī)免疫流程獲得。根據(jù)本發(fā)明的另一目的，提供了本文定義的多核苷酸或者已用此類多核苷酸進(jìn)行 過(guò)遺傳工程改造的微生物在生產(chǎn)維生素C和/或2-KGA中的用途。本發(fā)明還涉及在微生物中表達(dá)內(nèi)源基因的工藝，涉及在微生物中生產(chǎn)上文定義的 多肽的工藝，以及生產(chǎn)能產(chǎn)生維生素C和/或2-KGA的微生物的工藝。所有這些工藝都可包 含改變微生物的步驟，其中，本文中使用的“改變”包括下述工藝，該工藝以使得發(fā)酵產(chǎn)物的 產(chǎn)率和/或生產(chǎn)能力較之野生型生物有所提高的方式來(lái)進(jìn)行“遺傳改變”或“改變細(xì)胞培養(yǎng) 基的組成和/或改變用于培養(yǎng)的方法”。本文中使用的“維生素C的提高的產(chǎn)率”表示較之 野生型微生物(即，沒(méi)有被遺傳改變的微生物)而言增加至少5%、10%、25%、30%、40%、 50 %、75 %、100 %、200 %或者甚至超過(guò)500 %。對(duì)2-KGA生產(chǎn)而言，“ 2-KGA的提高的產(chǎn)率” 表示較之野生型微生物(即，沒(méi)有被遺傳改變的微生物)而言增加至少1%、2%、5%、10%、 20%、30%、40%或者甚至超過(guò)100%。術(shù)語(yǔ)“遺傳工程改造”或“遺傳改變”表示對(duì)活的生物體中遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)的科學(xué)改 變。這包括生產(chǎn)和使用重組DNA。更特別地，這用于描述來(lái)自天然存在的生物而經(jīng)遺傳工程 改造或修飾的生物。遺傳工程改造可通過(guò)本領(lǐng)域已知的多種方法來(lái)進(jìn)行，例如，基因替換， 基因擴(kuò)增，基因打斷，使用質(zhì)粒、病毒或其它載體進(jìn)行的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染。經(jīng)遺傳修飾的生物，例 如，經(jīng)遺傳修飾的微生物通常還被稱作重組生物，例如重組微生物。因此，本發(fā)明可包括以下任一 (1)除了其天然基因(例如編碼SMS43的基因)以 外，還帶有更多拷貝的所述基因的重組微生物，所述更多拷貝的所述基因通過(guò)用本領(lǐng)域已 知和例如本文所例舉的技術(shù)遺傳工程改造所述微生物來(lái)引入；或(2)如上經(jīng)遺傳工程改造 的重組微生物，但是其不天然地帶有這類基因，例如編碼SMS 43的基因。優(yōu)選地，本發(fā)明的 重組微生物被修飾，使得其帶有比野生型微生物更多拷貝的編碼SMS 43的DNA，尤其是因 為用帶有一個(gè)或多個(gè)拷貝的編碼SMS 43的DNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，或者將編碼SMS 43的這類DNA 整合進(jìn)其基因組中而造成。根據(jù)本發(fā)明，提供了經(jīng)遺傳工程改造/重組產(chǎn)生的宿主細(xì)胞(也被稱為重組細(xì)胞
10或經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞)，其攜帶有此類經(jīng)修飾的多核苷酸，其中，相連的蛋白的功能較之野生型細(xì) 胞而言被顯著修飾，使得對(duì)一種或多種發(fā)酵產(chǎn)物(例如維生素C)的生產(chǎn)的產(chǎn)率、產(chǎn)量和/ 或效率被提高。宿主細(xì)胞可選自能從給定的碳源直接生產(chǎn)一種或多種發(fā)酵產(chǎn)物(例如維 生素 C 和 / 或 2-KGA)的微生物，特別是 Gluconobacter oxydans,優(yōu)選地，G. oxydansDSM 17078和本文所述的微生物?！敖?jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞”或“重組細(xì)胞”是已通過(guò)重組DNA技術(shù)向其(或其祖先細(xì)胞)中引 入了根據(jù)本發(fā)明的核酸的細(xì)胞，或者是其中(內(nèi)源)SMS43蛋白的活性已被增加和/或增強(qiáng) 的細(xì)胞。合適的宿主細(xì)胞包括能生產(chǎn)給定發(fā)酵產(chǎn)物(例如，能將給定碳源直接轉(zhuǎn)化為維生 素C和/或2-KGA)的微生物的細(xì)胞?？捎糜趯?shí)施本發(fā)明并且天然不帶有這類基因(例如 編碼SMS 43的基因)而是通過(guò)引入所述基因而被遺傳修飾的宿主細(xì)胞包括但不限于來(lái)自 Pseudomonas (例如 P. putida、Pantoea) > Escherichia (例如 Ε· coli)禾口 Corynebacterium 屬的菌株。本發(fā)明的實(shí)施方式既包括遺傳上改變帶有編碼SMS 43蛋白質(zhì)或其等同物的內(nèi)源 基因的微生物，使得所述基因產(chǎn)物的活性提高，也包括向下述合適的宿主生物中引入一個(gè) 或多個(gè)拷貝，例如1、2、3、4、5、6或更多拷貝所述多核苷酸或其等同物，所述宿主生物不天 然帶有這樣的基因并且能夠從上文所述給定的底物生產(chǎn)維生素C和/或2-KGA，還能夠表 達(dá)所述被引入的基因。所述被引入的多核苷酸的活性還可通過(guò)如本文所述的遺傳改變被提 高，導(dǎo)致提高的維生素C和/或2-KGA生產(chǎn)。通過(guò)對(duì)從Gluconobacter oxydans DSM 17078獲得的基因組克隆進(jìn)行測(cè)序，來(lái)測(cè) 定包含編碼SMS 43蛋白的SEQ ID NO=I的核苷酸序列的基因的序列。本發(fā)明還涉及編碼SEQ ID NO 2所示的SMS 43多肽的至少一個(gè)生物活性片段或 衍生物的多核苷酸。本文中使用的“生物活性片段或衍生物”表示保留有與SEQ ID NO 2所示的多肽 基本相同的生物功能或活性的多肽。生物活性的例子可以例如是酶活、信號(hào)傳遞活性或抗 體反應(yīng)活性。術(shù)語(yǔ)“相同的生物功能”或“功能等同物”在本文中使用時(shí)表示蛋白質(zhì)與SEQ ID NO 2所示的多肽具有基本相同的生物活性，例如，酶活性、信號(hào)傳遞活性或者抗體反應(yīng) 活性。通常，可通過(guò)技術(shù)人員公知的方法來(lái)測(cè)定SMS蛋白的生物活性、酶活性或其它 活性，所述方法例如在存在其底物、電子受體或供體(包括吩嗪硫酸甲酯(PMS)、二氯苯 酚_吲哚苯酚(DCIP)、NAD、NADH、NADP, NADPH,可通過(guò)光度、色度或熒光方法對(duì)其消耗進(jìn)行 直接或間接測(cè)量)以及其它可能與活性的發(fā)展相關(guān)的無(wú)機(jī)組分的情況下，溫育含有SMS蛋 白的膜級(jí)分(membrane fraction)。因此，例如，可在下述試驗(yàn)中測(cè)量與膜結(jié)合的D-山梨糖 醇脫氫酶的活性，所述試驗(yàn)中，在存在PH 6的磷酸鹽緩沖液、D-山梨糖醇和人工電子受體 DCIP和PMS的情況下，溫育含有該酶的膜級(jí)分?？稍?00nm處測(cè)量DCIP的消耗速率，其與 膜級(jí)分中存在的D-山梨糖醇脫氫酶活性直接成正比。SMS蛋白質(zhì)(尤其是SMS 43蛋白質(zhì))的生物、酶或其它活性可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù) 人員公知的方法測(cè)量，例如通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法(例如Northern印跡、轉(zhuǎn)錄融 合分析、微陣列分析、目標(biāo)酶活性分析、目標(biāo)酶蛋白質(zhì)水平等等)測(cè)定已知處于SMS 43蛋白 質(zhì)控制下的基因的表達(dá)。
本發(fā)明的多肽和多核苷酸優(yōu)選以經(jīng)分離的形式提供，優(yōu)選地，被純化至均質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“經(jīng)分離的”表示物質(zhì)被移出其原來(lái)的環(huán)境(例如，如果其天然存在的話，就 是天然環(huán)境)。例如，活的微生物中存在的天然存在的多核苷酸或多肽不是經(jīng)分離的，但與 天然系統(tǒng)中的一些或全部共存物質(zhì)分開(kāi)的同樣的多核苷酸或多肽就是經(jīng)分離的。此類多核 苷酸可以是載體的一部分和/或此類多核苷酸或多肽可以是組合物的一部分，但仍然是經(jīng) 分離的，因?yàn)榇祟愝d體或組合物并非其天然環(huán)境的一部分。本文中使用的經(jīng)分離的多核苷酸或核酸可以是這樣的DNA或RNA，它們與從中獲 得該多核苷酸或核酸的生物的天然存在的基因組中緊密相鄰的兩條編碼序列(5’末端一 條，3’末端一條)并非緊密相鄰。因此，在一種實(shí)施方式中，核酸包括與編碼序列緊密相鄰 的5’非編碼(例如，啟動(dòng)子)序列的一些或全部。術(shù)語(yǔ)“經(jīng)分離的多核苷酸”因此包括，例 如，加入到載體中、加入到自主復(fù)制質(zhì)?；虿《局?，或者加入到原核生物或真核生物的基因 組DNA中的重組DNA，或者作為獨(dú)立于其它序列的單獨(dú)分子(例如，通過(guò)PCR或限制性內(nèi)切 酶處理產(chǎn)生的cDNA或基因組DNA片段)存在的重組DNA。其還包括是雜合體基因的一部 分的重組DNA，所述基因編碼基本不含細(xì)胞物質(zhì)、病毒物質(zhì)或培養(yǎng)基(當(dāng)通過(guò)重組DNA技術(shù) 生產(chǎn)時(shí))或化學(xué)前體或其它化學(xué)物質(zhì)(當(dāng)通過(guò)化學(xué)方式合成時(shí))的額外多肽。此外，“經(jīng)分 離的核酸片段”是這樣的核酸片段其天然并不作為片段存在，并且將不會(huì)在天然狀態(tài)被發(fā) 現(xiàn)。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”、“基因”和“重組基因”指可與染色體DNA分離開(kāi) 的、包括編碼蛋白質(zhì)(例如，G.oxydans DSM 17078SMS蛋白)的開(kāi)放讀碼框的核酸分子。多 核苷酸可包括，例如，SEQ IDNO :1所示的多核苷酸序列或其片段以及基因序列上游或下游 的區(qū)域，所述區(qū)域可包括，例如，對(duì)于由其獲得的多肽的適當(dāng)表達(dá)和穩(wěn)定來(lái)說(shuō)重要的啟動(dòng)子 區(qū)域、調(diào)控子區(qū)域和終止子區(qū)域。基因可包括編碼序列、非編碼序列(例如，位于基因編碼區(qū)域3’末端和5’末端的 非翻譯序列)和調(diào)控序列。此外，基因指本文定義的經(jīng)分離的核酸分子。技術(shù)人員還將理 解，導(dǎo)致SMS蛋白氨基酸序列的變化的DNA序列多態(tài)性可存在于種群(population)中，例 ta, Gluconobacter oxydans種群中。SMS 43基因中的此類遺傳多態(tài)性可由于天然變異存 在于種群的個(gè)體間，或者存在于不同種群的細(xì)胞中。典型地，此類天然變異可導(dǎo)致SMS 43 基因核苷酸序列中1-5%的變化度。作為天然變異結(jié)果的、并且不會(huì)改變SMS蛋白的功能活 性的SMS 43中的任何以及全部此類核苷酸變異和由此得到的氨基酸多態(tài)性也包括在本發(fā) 明的范圍內(nèi)。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”或“核酸分子”意欲包括DNA分子(例如，cDNA或 基因組DNA)和RNA分子(例如mRNA)以及使用核苷酸類似物產(chǎn)生的DNA或RNA的類似物。 核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但優(yōu)選是雙鏈DNA?？墒褂霉押塑账犷愃莆锘蜓苌?例 如，肌苷或磷硫酰核苷酸)來(lái)合成核酸。此類寡核苷酸可用于例如，制備具有改變的堿基 配對(duì)能力或增加的對(duì)核酸酶的抗性的核酸。本文中提供的序列信息不應(yīng)被狹義理解為需要包括進(jìn)被錯(cuò)誤鑒定的堿基。本文公 開(kāi)的特定序列可以很容易地用于從能將給定碳源直接轉(zhuǎn)化為維生素C和/或2-KGA的重 組或非重組微生物(特別是 Gluconobacteroxydans，優(yōu)選地，Gluconobacter oxydans DSM 17078)中分離出完整基因，隨后可容易地對(duì)該基因進(jìn)行進(jìn)一步的序列分析，由此鑒定出測(cè)
12序錯(cuò)誤。除非特別指明，本文中通過(guò)對(duì)DNA分子進(jìn)行測(cè)序來(lái)確定的所有核苷酸序列都是用 自動(dòng)DNA測(cè)序儀(測(cè)定的，并且，本文測(cè)定的DNA分子編碼的多肽的所有氨基酸序列都是通 過(guò)對(duì)按照上文所述測(cè)定的DNA序列進(jìn)行翻譯來(lái)推測(cè)的。因此，如本領(lǐng)域所已知的，對(duì)由該自 動(dòng)方法所測(cè)定的任何DNA序列而言，本文所測(cè)定的任何核苷酸序列都可能含有一些錯(cuò)誤。 典型地，通過(guò)自動(dòng)方法測(cè)出的核苷酸序列與被測(cè)序的DNA分子的實(shí)際核苷酸序列至少大約 90 %同源，更典型地，至少大約95 %至至少大約99. 9 %相同。通過(guò)其它方法，包括本領(lǐng)域內(nèi) 公知的人工DNA測(cè)序方法，可對(duì)實(shí)際序列進(jìn)行更為精確的測(cè)定。也如本領(lǐng)域所已知的，測(cè)得 的核苷酸序列中較之實(shí)際序列的單個(gè)插入或缺失將會(huì)導(dǎo)致核苷酸序列翻譯中的讀碼框位 移，使得從此類插入或缺失的點(diǎn)開(kāi)始，測(cè)得的核苷酸序列編碼的預(yù)計(jì)氨基酸序列完全不同 于被測(cè)序的DNA分子實(shí)際編碼的氨基酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員能鑒定出此類被錯(cuò)誤鑒定的堿基，并且知道如何改正此類錯(cuò)誤。根據(jù)本發(fā)明的核酸分子可以僅包含本發(fā)明提供的核酸序列(例如，SEQ ID NO=I 示出的序列)的一部分或片段，例如，可用作為探針或引物的片段(例如SEQ ID N0:3或 SEQ ID NO 4)或編碼根據(jù)本發(fā)明的蛋白的一部分的片段。從對(duì)SMS 43基因的克隆測(cè)定的 核苷酸序列允許產(chǎn)生被設(shè)計(jì)來(lái)鑒定和/或克隆SMS 43家族其它成員以及來(lái)自其它物種的 SMS43同源體的探針和引物。典型地，該探針/引物包含基本純化的寡核苷酸，其典型地包 含與SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列或其片段或衍生物的至少大約12或15個(gè)、優(yōu)選大約 18或20個(gè)、更優(yōu)選大約22或25個(gè)、進(jìn)一步更優(yōu)選大約30、35、40、45、50、55、60、65或75個(gè) 或更多個(gè)連續(xù)核苷酸雜交(優(yōu)選地，在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交)的核苷酸序列區(qū)域。還可通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，使用基于本文含有的序列信息設(shè)計(jì)的合成寡核 苷酸引物，分離出包含SEQ ID NO 1的核苷酸序列的全部或一部分的核酸分子?？砂凑諛?biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增技術(shù)，用cDNA、mRNA或者基因組DNA作為模板，使用合適的寡 核苷酸引物，來(lái)擴(kuò)增本發(fā)明的核酸。由此擴(kuò)增的核酸可被克隆進(jìn)合適的載體，并通過(guò)DNA序 列分析加以表征。根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸的片段還可包含不編碼功能多肽的多核苷酸。此類多核苷 酸可作為探針或引物用于PCR反應(yīng)。不管其編碼功能或非功能多肽，根據(jù)本發(fā)明的核酸都可用作為雜交探針或聚合酶 鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)引物。不編碼具有SMS 43活性的多肽的本發(fā)明核酸分子的用途包括(1) 從cDNA文庫(kù)(例如來(lái)自除Gluconobacter oxydans外的其它生物)分離編碼本發(fā)明蛋白 的基因或其等位變體，以及(2)用于探測(cè)特定細(xì)胞中所述蛋白的mRNA的表達(dá)的Northern 印跡分析，或(3)用于增強(qiáng)和/或提高同源SMS 43基因在所述其它生物中的功能或活性?；诒疚奶峁┑暮塑账嵝蛄械奶结樋捎糜跈z測(cè)編碼同樣或同源蛋白(例如，其它 生物中的)的轉(zhuǎn)錄本或基因組序列?？苫谄渑c本文公開(kāi)的G.xoydans SMS 43核酸的同 源性，使用G. oxydans DNA或其一部分作為雜交探針，按照標(biāo)準(zhǔn)雜交技術(shù)，優(yōu)選在高度嚴(yán)謹(jǐn) 雜交條件下，分離出對(duì)應(yīng)于本發(fā)明的G.xoydans SMS 43 DNA的天然變體或非G. oxydans同 源體的核酸分子，它們也包括在本發(fā)明內(nèi)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，探針還包含與其附著的標(biāo)記基團(tuán)，例如，標(biāo)記基團(tuán)可以是放 射性同位素、熒光化合物、酶或酶的輔助因子。
例如，可使用基于本文教導(dǎo)的核苷酸序列設(shè)計(jì)的兩套簡(jiǎn)并寡核苷酸引物庫(kù)，進(jìn)行 PCR來(lái)分離同源基因序列。用于反應(yīng)的模板可以是通過(guò)對(duì)從已知能表達(dá)或懷疑能表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的多核苷 酸的菌株制備的mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA。PCR產(chǎn)物可被亞克隆及測(cè)序，以確保擴(kuò)增出 的序列代表本文所述的新的核酸序列或其功能等同物的序列。然后可通過(guò)多種已知方法，用PCR片段分離全長(zhǎng)cDNA克隆。例如，可標(biāo)記擴(kuò)增出 的片段，用其篩選噬菌體或粘粒cDNA文庫(kù)?；蛘?，經(jīng)標(biāo)記的片段可用于篩選基因組文庫(kù)。PCR技術(shù)還可用于從其它生物分離全長(zhǎng)cDNA。例如，可按照標(biāo)準(zhǔn)方案，從合適的細(xì) 胞或組織來(lái)源分離RNA。可在RNA上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，其中使用與擴(kuò)增片段的5’最末端具 有特異性的寡核苷酸引物，以引導(dǎo)第一鏈合成。然后可使用標(biāo)準(zhǔn)的末端轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)，對(duì)得到的RNA/DNA雜交體“加尾”(例如，用鳥(niǎo) 嘌呤)，可用RNaseH消化雜交體，然后可(例如，用poly-C引物)引導(dǎo)第二鏈合成。由此， 可容易地分離擴(kuò)增的片段上游的cDNA序列。關(guān)于有用的克隆策略的綜述，參見(jiàn)，例如上文 所述的Sambrook et al.禾口上文所述的Ausubel et al.。此外，編碼SMS 43家族其它成員、具有與根據(jù)SEQ ID NO=I的核苷酸序列不同的 核苷酸序列的核酸也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。此外，編碼來(lái)自其它物種的SMS 43蛋白、具有與 SEQ ID NO :1示出的核苷酸序列不同的核苷酸序列的核酸也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明還涉及經(jīng)分離的多核苷酸，其可在嚴(yán)謹(jǐn)條件下(優(yōu)選地，高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下) 與本發(fā)明的多核苷酸(例如，SEQ ID NO :1所示的多核苷酸)雜交。有利地，此類多核苷酸 可從能將給定的碳源直接轉(zhuǎn)化為維生素C的微生物(特別是Gluconobacter oxydans，優(yōu)選 地，Gluconobacteroxydans DSM 17078)中獲得。本文中用到的術(shù)語(yǔ)“雜交”被用來(lái)描述雜交和洗滌，在所述雜交和洗滌條件下，典 型地，互相之間同源性為至少約50%、至少約60%、至少約70%、更優(yōu)選為至少約80%、進(jìn) 一步優(yōu)選為至少約85%到90%、最優(yōu)選為至少95%的核苷酸序列保持相互雜交的狀態(tài)。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的核酸與SEQ ID NO :1所示的核酸序列或其互補(bǔ)序 列至少 40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99% 同源或更同源。此類嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件的一個(gè)優(yōu)選的非限制的例子是在6x氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC) 中，大約45°C下雜交，隨后在lxSSC、0. 1% SDS中，50°C下進(jìn)行一次或多次洗滌，洗滌優(yōu)選在 55°C下，更優(yōu)選在60°C下，進(jìn)一步優(yōu)選在65°C下進(jìn)行。高度嚴(yán)謹(jǐn)條件包括使用經(jīng)標(biāo)記的DNA探針(例如，用地高辛(DIG)標(biāo)記的DNA探 針)在42°C溫育數(shù)天(例如2-4天)，接著在2xSSC和0. 1 % SDS中于室溫下洗一次或多次， 以及在65-68°C，于0. 5xSSC和0. 1%SDS或0. IxSSC和0. 1 % SDS中洗一次或多次。特別地， 高度嚴(yán)謹(jǐn)條件包括，例如，在溶液中，例如含或不含100 μ g/ml的鮭魚精DNA的DigEasyHyb 溶液(Roche Diagnostics GmbH)中，或包含50% 甲酰胺、5xSSC(150mM NaCl、15mM檸檬酸三 鈉)、0. 02%十二烷基磺酸鈉、0. 1% N-月桂酰肌氨酸和2%封閉試劑(Roche Diagnostics GmbH)的溶液中，使用地高辛(DIG)標(biāo)記的DNA探針(例如通過(guò)用RocheDiagnostics GmbH, 68298 Mannheim, Germany的DIG標(biāo)記系統(tǒng)來(lái)制備的)在42°C溫育2小時(shí)至4天，接著在 2xSSC和0. 1 % SDS中，于室溫下，洗兩次膜，每次5至15分鐘，然后在65-68 °C，于0. 5xSSC
14和0. SDS或0. IxSSC和0. 1% SDS中洗兩次，每次15-30分鐘。優(yōu)選地，與本發(fā)明的核苷酸序列雜交(優(yōu)選在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交)的本發(fā)明的 經(jīng)分離的核酸對(duì)應(yīng)于天然存在的核酸分子。本文中使用的“天然存在的”核酸分子指具有 天然存在的核苷酸序列的RNA或DNA分子(例如，編碼天然蛋白質(zhì))。在一種實(shí)施方式中， 核酸編碼天然的G. oxydans SMS 43蛋白。技術(shù)人員知道何種條件適合用于嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件及高度嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件。本領(lǐng)域中易 于獲得關(guān)于此類條件的其它指導(dǎo)，例如，在Sambrook et al.，1989，Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N. Y.；禾口Ausubel et al. (eds. ),1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons, N. Y.)中。當(dāng)然，僅與 poly (A)序列(例如mRNA的3，末端poly (A)區(qū))或僅與T (或U)殘基的互補(bǔ)性延伸區(qū)段 (stretch)雜交的多核苷酸將不會(huì)被包括在用于與本發(fā)明核酸的一部分特異性雜交的本發(fā) 明多核苷酸中，因?yàn)榇祟惗嗪塑账釋⑴c任何含有Poly(A)延伸區(qū)段的核酸分子或其互補(bǔ)序 列(例如，實(shí)際上是任何雙鏈的cDNA克隆)雜交。采用典型手段，可以對(duì)從其它生物，例如能將給定碳源直接轉(zhuǎn)化為維生素C和/或 2-KGA的微生物(特別是其它Gluconobacter物種)構(gòu)建的DNA文庫(kù)進(jìn)行篩選。例如，可以通過(guò)Southern禾口 /或Northern印跡分析來(lái)對(duì)Gluconobacter的菌株進(jìn) 行篩選。在探測(cè)到與本發(fā)明多核苷酸同源的轉(zhuǎn)錄本之后，可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的 標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，由分離自合適菌株的RNA來(lái)構(gòu)建cDNA文庫(kù)?；蛘?，可以使用能與本發(fā)明多核苷 酸雜交的探針來(lái)對(duì)全基因組DNA文庫(kù)進(jìn)行篩選?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)以及本文提供的序列信息，來(lái)分離本發(fā)明的核酸序 列，例如SEQ ID NO :1所示的核酸分子或其片段或衍生物。例如，可使用標(biāo)準(zhǔn)雜交和克隆技 術(shù)(例如，Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E. F.，禾口 Maniati s,T. Molecular Cloning :A Laboratory Manual. 2nd, ed. , Cold SpringHarbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor，NY，1989所述)，使用SEQ ID NO :1所示的核酸分子的全部或 一部分作為雜交探針，分離根據(jù)本發(fā)明的核酸分子。此外，可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)合成技術(shù)(例如，使用自動(dòng)DNA合成儀)來(lái)制備對(duì)應(yīng)于本發(fā)明的 核苷酸序列的寡核苷酸或可與本發(fā)明的核苷酸序列雜交的寡核苷酸。術(shù)語(yǔ)“同源性”或“相同性百分比，，在本文中可互換使用。就本發(fā)明的目的而言， 在此定義為確定兩條氨基酸序列或兩條核酸序列的相同性百分比，本著最優(yōu)比較的目的 (例如，可以在第一條氨基酸序列或核苷酸序列上引入缺口，以與第二條氨基酸序列或核苷 酸序列達(dá)到最佳的比對(duì))，對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)。然后對(duì)相應(yīng)氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基 酸殘基或核苷酸進(jìn)行比較。如果第一條序列上某位置的氨基酸殘基或核苷酸與第二條序列 上相應(yīng)位置的相同，那么這些分子在此位置就是相同的。兩條序列間的相同性百分比是所 述序列共有的相同位置的數(shù)量的函數(shù)(即，％相同性=相同位置的數(shù)量/位置(即重疊位 置)總數(shù)XlOO)。優(yōu)選地，這兩條序列長(zhǎng)度相同。技術(shù)人員會(huì)知道有若干計(jì)算機(jī)程序可被用于確定兩條序列間的同源性。例如，可 以使用數(shù)學(xué)算法來(lái)完成對(duì)序列的比對(duì)和對(duì)兩條序列間相同性百分比的確定。在一種優(yōu)選 的實(shí)施方式中，使用 Needleman 和 Wunsch(J. Mol. Biol. (48) :444_453 (1970))算法來(lái)確定 兩條氨基酸序列間的相同性百分比，所述算法已被合并到GCG軟件包(可從httP://VWW.accelrys. com獲得)的GAP程序中，其中使用Blossom 62矩陣或PAM250矩陣，缺口權(quán)重 為16、14、12、10、8、6或4，長(zhǎng)度權(quán)重為1、2、3、4、5或6。技術(shù)人員會(huì)意識(shí)到上述的所有不 同參數(shù)將導(dǎo)致有細(xì)微區(qū)別的結(jié)果，但是使用不同算法時(shí)兩條序列的總體％相同性不會(huì)有顯 著改變。在又一種實(shí)施方式中，使用GCG軟件包(可從http //www, accelrys. com獲得)的 GAP程序來(lái)確定兩條核苷酸序列間的相同性百分比，其中使用NWSgapdna. CMP矩陣，缺口權(quán) 重為40、50、60、70或80，長(zhǎng)度權(quán)重為1、2、3、4、5或6。在另一種實(shí)施方式中，使用E. Meyers 和W.Miller(CABI0S，4 11-17 (1989))的算法來(lái)確定兩條氨基酸序列或核苷酸序列的相同 性百分比，所述算法已被合并到ALIGN程序(2. 0版)(可從httD://Vega. iRh. cnrs. fr/ bin/aliRn-Ruess. cgi獲得)中，其中使用PAM120權(quán)重殘基表，缺口長(zhǎng)度懲罰(penalty)為 12，缺口懲罰為4。本發(fā)明的核酸和蛋白質(zhì)序列可以進(jìn)一步地被用作“查詢序列”來(lái)進(jìn)行針對(duì)公眾數(shù) 據(jù)庫(kù)的搜索，例如，去鑒定相關(guān)序列或家族中其它成員?？梢允褂肁ltSChul，et al. (1990) J. Mol. Biol. 215 :403-10的BLASTN和BLASTX程序(2. 0版)來(lái)進(jìn)行此類搜索?？梢杂?BLASTN程序，以分?jǐn)?shù)=100，字長(zhǎng)(word length) = 12來(lái)進(jìn)行BLAST核苷酸搜索，以獲得 與本發(fā)明的核酸分子同源的核苷酸序列。可以用BLASTX程序，以分?jǐn)?shù)=50，字長(zhǎng)=3來(lái) 進(jìn)行BLAST蛋白質(zhì)搜索，以獲得與本發(fā)明的蛋白質(zhì)分子同源的氨基酸序列。本著比較的目 的，為獲得有缺口的比對(duì)，可以利用 Altschul et al. , (1997)Nucleic Acids Res. 25(17) 3389-3402中描述的Gapped BLAST。當(dāng)利用BLAST和Gapped BLAST程序時(shí)，可以使用各個(gè) 程序(例如 BLASTX 禾口 BLASTN)的缺省參數(shù)。見(jiàn) http://www, ncbi. nlm. nih. rov0在另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的經(jīng)分離的核酸分子包含是本發(fā)明的核苷酸 序列(例如，SEQ ID NO :1所示的序列)的互補(bǔ)序列的核酸分子。與本文公開(kāi)的核苷酸序 列互補(bǔ)的核酸分子是這樣的序列其與SEQID NO 1所示的核苷酸序列足夠互補(bǔ)，從而其可 與所述核苷酸序列雜交，由此形成穩(wěn)定的雙鏈體(duplex)。在另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，SEQ ID NO 1所示的本發(fā)明的核酸或其互補(bǔ)序列含 有至少一處突變，所述突變導(dǎo)致基因產(chǎn)物具有經(jīng)修飾的功能/活性。所述至少一處突變可 通過(guò)本文所述的方法引入。在一個(gè)方面，所述至少一處突變導(dǎo)致產(chǎn)生這樣的SMS 43蛋白 其功能和/或活性較之野生型副本而言有所增強(qiáng)或提高。用于引入此類突變的方法是本領(lǐng) 域公知的。本文中使用的術(shù)語(yǔ)——活性的“增加”包括增加生產(chǎn)生物中一種或多種多肽的 活性，所述多肽是本文所述的相應(yīng)的多核苷酸編碼的。本領(lǐng)域中可獲得用于增加給定蛋白 (在本文的情況下是SMS 43蛋白)活性的多種方法。通常，可增加蛋白質(zhì)的比活性或者可 以增加蛋白質(zhì)的拷貝數(shù)。術(shù)語(yǔ)增加活性或者等同物表達(dá)還包括下述情形其中，SMS 43蛋 白活性被引入以前不含該活性的細(xì)胞，這例如通過(guò)將編碼SMS 43的基因引入以前不含該 基因等同物的細(xì)胞或以前不能表達(dá)相應(yīng)蛋白的活性形式的細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)。為協(xié)助這種增加，對(duì)應(yīng)于本文所述多核苷酸的基因的拷貝數(shù)可被增加?；蛘?，可使 用強(qiáng)啟動(dòng)子來(lái)指導(dǎo)多核苷酸的表達(dá)。在另一種實(shí)施方式中，基因的啟動(dòng)子、調(diào)控區(qū)域和/或 核糖體結(jié)合位點(diǎn)可被改變，以增加表達(dá)。還可以通過(guò)增加信使RNA的相對(duì)半壽期來(lái)增強(qiáng)或 強(qiáng)加表達(dá)。在另一種實(shí)施方式中，還可以通過(guò)在多肽氨基酸序列中利用能增加活性的一處或多處突變來(lái)增加多肽自身的活性。例如，改變多肽與其相應(yīng)底物的親和性可導(dǎo)致活性提 高。類似地，可增加肽的相對(duì)半壽期。在基因表達(dá)增強(qiáng)或者比活性增加的情況下，可通過(guò)改 變細(xì)胞培養(yǎng)基的組成和/或用于培養(yǎng)的方法來(lái)達(dá)成這種提高。本文中使用的“增強(qiáng)的表達(dá)” 或“提高的活性”表示較之野生型蛋白、多核苷酸、基因、或多核苷酸或多肽被增強(qiáng)和/或提 高之前存在的蛋白的活性和/或濃度而言，至少5%、10%、25%、50%、75%、100%、200% 或者甚至超過(guò)500%的增加。還可通過(guò)將蛋白與其活性的特異性或一般性增強(qiáng)劑相接觸來(lái) 增加SMS 43蛋白的活性。本發(fā)明的另一方面涉及載體，所述載體含有編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的核酸或其功能等 同物或一部分。在本文中使用的術(shù)語(yǔ)“載體”指能運(yùn)送連接到其上的另一個(gè)核酸分子的核 酸分子。一種載體類型是“質(zhì)粒”，“質(zhì)?！敝腑h(huán)狀的雙鏈DNA環(huán)，另外的DNA片斷可以連接 到所述的環(huán)上。另一種載體的類型是病毒載體，其中，另外的DNA片斷可以連接到病毒基因 組中。某些載體能在其被引入的宿主細(xì)胞中進(jìn)行自主復(fù)制(例如，具有細(xì)菌的復(fù)制起點(diǎn)的 細(xì)菌載體)。其它載體在被引入宿主細(xì)胞之后就被整合進(jìn)宿主細(xì)胞的基因組中，因此它們與 宿主基因組一同復(fù)制。此外，某些載體能指導(dǎo)可操作地連接到其上的基因的表達(dá)。此類載體在本文中被 稱為“表達(dá)載體”。一般而言，在重組DNA技術(shù)中用到的表達(dá)載體通常是質(zhì)粒的形式。在本 文中術(shù)語(yǔ)“質(zhì)?！焙汀拜d體”可以互換使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是最常用到的載體形式。然而，本發(fā)明 也將包括其它形式的表達(dá)載體，例如病毒載體(例如，復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺 伴隨病毒)，它們能提供等同的功能。本發(fā)明的重組表達(dá)載體包含本發(fā)明的核酸，所述核酸存在的形式適合于該核酸在 宿主細(xì)胞中的表達(dá)，這意味著該重組表達(dá)載體包括一段或多段調(diào)控序列，所述調(diào)控序列是 基于將用于表達(dá)的宿主細(xì)胞來(lái)選擇的，其被可操作地連接到將要表達(dá)的核酸序列上。在重 組表達(dá)載體中，“可操作地連接”被用來(lái)表示人們感興趣的核苷酸序列被連接到調(diào)控序列 上，所述的連接以允許該核苷酸序列表達(dá)(例如，在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中表達(dá)，或者當(dāng)載 體被引入宿主細(xì)胞中時(shí)，在該宿主細(xì)胞中的表達(dá))的方式進(jìn)行。術(shù)語(yǔ)“調(diào)控序列”將包括啟 動(dòng)子、增強(qiáng)子和其它表達(dá)控制元件(例如，弱化子)。例如，在Goeddel ；Gene Expression Technology :Methods inEnzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)中對(duì)此類 調(diào)控序列進(jìn)行了描述。調(diào)控序列包括在很多種宿主細(xì)胞中指導(dǎo)核苷酸序列的組成型或誘導(dǎo) 型表達(dá)的調(diào)控序列，也包括僅在某些宿主細(xì)胞中指導(dǎo)核苷酸序列表達(dá)的調(diào)控序列(例如， 組織特異性調(diào)控序列)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將意識(shí)到，對(duì)表達(dá)載體的設(shè)計(jì)可能取決于以下因 素例如對(duì)將被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇，期望獲得的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平等。本發(fā)明的表達(dá) 載體可以被引入宿主細(xì)胞，由此生產(chǎn)本文所述的核酸編碼的蛋白質(zhì)或肽，其包括但不限于 本文所述的核酸編碼的突變體蛋白、其片段、其變體或功能等同物以及融合蛋白，例如，SMS 43蛋白、SMS 43蛋白的突變體形式、融合蛋白等。為了在合適的微生物中表達(dá)SMS 43蛋白，可對(duì)本發(fā)明的重組表達(dá)載體加以 設(shè)計(jì)。例如，根據(jù)本發(fā)明的蛋白可在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)，例如，在屬于Gluconobacter、 Gluconacetobacter或Acetobacter屬的菌株中表達(dá)。在本發(fā)明中有用的表達(dá)載體包括源 自染色體、游離體和病毒的載體，例如源自細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體的載體和源自上述物質(zhì)的組合 的載體，例如源自質(zhì)粒和噬菌體遺傳元件的載體，例如粘粒和噬菌粒(phagemid)。
DNA插入應(yīng)當(dāng)被可操作地連接到合適的啟動(dòng)子上，啟動(dòng)子可以是組成型啟動(dòng)子或 可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。技術(shù)人員知道如何選擇合適的啟動(dòng)子。表達(dá)構(gòu)建體可以含有用于轉(zhuǎn)錄起 始、終止的位點(diǎn)，還可在轉(zhuǎn)錄區(qū)域含有核糖體結(jié)合位點(diǎn)，以用于翻譯。由構(gòu)建體表達(dá)的成熟 轉(zhuǎn)錄本的編碼部分可優(yōu)選包括處于起點(diǎn)的起始密碼子，以及恰當(dāng)?shù)囟ㄎ挥诖g的多肽末 尾的終止密碼子?？赏ㄟ^(guò)傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)將載體DNA引入合適的宿主細(xì)胞。本文中使用的術(shù) 語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”、“轉(zhuǎn)橋聯(lián)(transconjugation) ”和“轉(zhuǎn)染”意指本領(lǐng)域內(nèi)已知的、用于將外源核酸 (例如DNA)引入到宿主細(xì)胞中的多種技術(shù)，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖介導(dǎo) 的轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、感染、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、陽(yáng)離子脂介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或電穿孔。用于對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化和 轉(zhuǎn)染的合適方法可在Sambrook, et al.(上文所述的)，Davis et al.，Basic Methods in Molecular Biology(1986)及其它實(shí)驗(yàn)手冊(cè)中找到。為對(duì)已將外源DNA整合進(jìn)它們基因組的細(xì)胞進(jìn)行鑒定和選擇，通常，將編碼選擇 標(biāo)記(例如，對(duì)抗生素的抗性)的基因與感興趣的基因一起引入宿主細(xì)胞。優(yōu)選的選擇標(biāo) 記包括賦予對(duì)藥物(例如卡納霉素、四環(huán)素、氨芐青霉素和鏈霉素)抗性的那些。編碼選擇 標(biāo)記的核酸優(yōu)選在與編碼根據(jù)本發(fā)明的蛋白的載體相同的載體上引入宿主細(xì)胞，或者其可 在單獨(dú)的載體上引入，該載體例如是自殺性載體，其不能在宿主細(xì)胞中復(fù)制?？赏ㄟ^(guò)藥物選 擇鑒定出經(jīng)過(guò)引入的核酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(例如，已合并有選擇標(biāo)記基因的細(xì)胞將存活， 而其它細(xì)胞會(huì)死亡)。本發(fā)明還提供了經(jīng)分離的多肽，其具有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列或可通過(guò) 在合適的宿主中表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸(例如，SEQ IDNO :1所示的多核苷酸序列)獲得的
氨基酸序列。根據(jù)本發(fā)明的多肽可僅含對(duì)SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸 的保守取代，或?qū)Ψ顷P(guān)鍵氨基酸的取代、插入或缺失。因此，非關(guān)鍵氨基酸是SEQ ID NO 2 所示的氨基酸序列中可被改變、且不會(huì)對(duì)生物功能造成實(shí)質(zhì)性影響的殘基。例如，在本發(fā)明 的蛋白質(zhì)之間保守的氨基酸殘基被預(yù)計(jì)為對(duì)改變特別不敏感。此外，在根據(jù)本發(fā)明的蛋白 質(zhì)和其它SMS 43蛋白之間保守的氨基酸也對(duì)改變不太敏感。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及經(jīng)修飾的微生物，其中所述修飾導(dǎo)致從如本文所 述的底物直接生產(chǎn)維生素C和/或2-KGA的提高的產(chǎn)率、產(chǎn)量和/或效率，這尤其通過(guò)提高 本文所述的SMS 43基因的活性來(lái)進(jìn)行，并且其中所述微生物還包含選自下組的多核苷酸 或其互補(bǔ)鏈，所述組由以下組成(a)編碼包含根據(jù)SEQ ID NO 10的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(b)包含根據(jù)SEQ ID NO 9的核苷酸序列的多核苷酸；(c)包含下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列能夠使用來(lái)自微生物的基 因組DNA作為模板，并使用根據(jù)SEQ ID N0:17和SEQID NO 18的引物組，通過(guò)核酸擴(kuò)增(例 如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))來(lái)獲得；(d)多核苷酸，其包含編碼被(a)至(c)中任一項(xiàng)的多核苷酸編碼的多肽的片段或 衍生物的核苷酸序列，其中，在所述衍生物中，一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基較之所述多肽被保守 取代，并且，所述片段或衍生物具有氧化還原酶[EC 1]的活性，優(yōu)選地具有L-山梨糖酮脫 氫酶的活性；
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(e)編碼氧化還原酶[EC 1]，優(yōu)選地編碼L-山梨糖酮脫氫酶的多核苷酸，且其互 補(bǔ)鏈能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(a)至(d)中任一項(xiàng)所定義的多核苷酸雜交；以及(f)編碼氧化還原酶[EC 1]，優(yōu)選地編碼L-山梨糖酮脫氫酶的多核苷酸，且其與 (a)至(d)中任一項(xiàng)所定義的多核苷酸至少60%相同，例如70%、85%、90%或95%相同；構(gòu)成。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及經(jīng)修飾的微生物，其中所述修飾導(dǎo)致從如本文所 述的底物直接生產(chǎn)維生素C和/或2-KGA的提高的產(chǎn)率、產(chǎn)量和/或效率，這尤其通過(guò)提高 本文所述的SMS 43基因的活性來(lái)進(jìn)行，并且其中所述微生物還包含選自下組的多核苷酸 或其互補(bǔ)鏈，所述組由以下組成(a)編碼包含根據(jù)SEQ ID NO 14的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(b)包含根據(jù)SEQ ID NO 13的核苷酸序列的多核苷酸；(c)包含下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列能夠使用來(lái)自微生物的基 因組DNA作為模板，并使用根據(jù)SEQ ID N0:15和SEQID NO 16的引物組，通過(guò)核酸擴(kuò)增(例 如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))來(lái)獲得；(d)多核苷酸，其包含編碼被(a)至(C)中任一項(xiàng)的多核苷酸編碼的多肽的片段或 衍生物的核苷酸序列，其中，在所述衍生物中，一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基較之所述多肽被保守 取代，并且，所述片段或衍生物具有轉(zhuǎn)移酶[EC 2]的活性，優(yōu)選地具有轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)的磷 酸轉(zhuǎn)移酶[EC 2. 7]的活性；(e)編碼轉(zhuǎn)移酶[EC 2]，優(yōu)選地編碼轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)的磷酸轉(zhuǎn)移酶[EC2. 7]的多核 苷酸，且其互補(bǔ)鏈能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(a)至(d)中任一項(xiàng)所定義的多核苷酸雜交；以及(f)編碼轉(zhuǎn)移酶[EC 2]，優(yōu)選地編碼轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)的磷酸轉(zhuǎn)移酶[EC2. 7]多肽的 多核苷酸，且其與(a)至(d)中任一項(xiàng)所定義的多核苷酸至少60%相同，例如70%、85%、 90%或95%相同；構(gòu)成。術(shù)語(yǔ)“保守取代”用于表示下述取代，其中，氨基酸殘基被具有相似側(cè)鏈的氨基酸 殘基所取代。這些家族是本領(lǐng)域已知的，其包括具有堿性側(cè)鏈(例如，賴氨酸、精氨酸和組 氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如，天冬氨酸和谷氨酸)、不帶電荷的極性側(cè)鏈(例如，甘氨酸、天冬酰 胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮 氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、帶beta支鏈側(cè)鏈(例如，蘇氨酸、纈 氨酸、異亮氨酸)和芳香族側(cè)鏈(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。如上所述，本發(fā)明的多核苷酸可用于對(duì)合適的宿主細(xì)胞進(jìn)行遺傳工程改造，使其 在發(fā)酵中更好且更有效，例如，在對(duì)維生素C和/或2-KGA的直接發(fā)酵工藝中更好且更有 效。還可通過(guò)修飾SMS 43基因獲得提高的基因表達(dá)，例如，通過(guò)將一處或多處突變引 入SMS 43基因來(lái)實(shí)現(xiàn)，其中，所述突變導(dǎo)致較之野生型蛋白而言功能顯著提高的SMS 43蛋 白。因此，在另一種實(shí)施方式中，從SEQ ID NO 1所示的多核苷酸或其等同物獲得攜帶 至少一處突變的多核苷酸。本文中使用的突變可以是導(dǎo)致功能更強(qiáng)或更穩(wěn)定的多肽(例如，功能更強(qiáng)或更穩(wěn)定的SMS 43基因產(chǎn)物)的任何突變。這可包括，例如，在微生物基因組中的下述改變其提 高了 SMS 43的合成，或者導(dǎo)致SMS 43蛋白以改變的氨基酸序列表達(dá)，該改變使得該蛋白的 功能較之具有未被改變的氨基酸序列的野生型副本而言被提高和/或增強(qiáng)。提高可在轉(zhuǎn)錄 水平、翻譯水平或翻譯后水平上發(fā)生。微生物基因組中的改變可例如通過(guò)單交叉重組或多交叉重組用含有改變的DNA 序列替換野生型DNA序列來(lái)進(jìn)行。為了能方便地選擇出基因組被改變的微生物轉(zhuǎn)化子，該 改變可以例如是編碼抗生素抗性基因的DNA序列，或者編碼補(bǔ)足微生物可能的營(yíng)養(yǎng)缺陷型 的基因的DNA序列。突變可包括但不限于缺失-插入突變。還可通過(guò)下述方法獲得微生物基因組中導(dǎo)致功能更強(qiáng)的多肽的改變使用例如化 學(xué)誘變劑、輻射或轉(zhuǎn)座子對(duì)微生物基因組進(jìn)行隨機(jī)誘變，以及選擇或篩選出是一種或多種 發(fā)酵產(chǎn)物的更好的或更有效的生產(chǎn)菌株的突變體。用于篩選和選擇的標(biāo)準(zhǔn)方法是技術(shù)人員 已知的。用于SMS 43蛋白的上述誘變策略可導(dǎo)致想要的化合物(特別是維生素C和/或 2-KGA)的產(chǎn)率增加。這些策略的列出并不意味著限制；對(duì)這些誘變策略的變化對(duì)于本領(lǐng)域 普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將是顯而易見(jiàn)的?？赏ㄟ^(guò)這些機(jī)制，用本發(fā)明的核酸和蛋白質(zhì)分子產(chǎn)生 出微生物，例如表達(dá)經(jīng)突變SMS 43核酸和蛋白分子的Gluconobacter oxydans或細(xì)菌的相 關(guān)菌株，使得對(duì)想要的化合物(例如維生素C和/或2-KGA)的生產(chǎn)的產(chǎn)率、生產(chǎn)能力和/ 或產(chǎn)量被提高。本文所述的核酸分子、多肽、載體、引物和重組微生物可用于下述方法中的一種或 多種鑒定Gluconobacter oxydans以及相關(guān)的生物；繪制與Gluconobacter oxydans相 關(guān)的生物的基因組圖譜；對(duì)感興趣的Gluconobacter oxydans序列進(jìn)行鑒定和定位；進(jìn)化 研究；測(cè)定功能所需的SMS 43蛋白區(qū)域；調(diào)節(jié)SMS 43蛋白活性或功能；調(diào)節(jié)RCS途徑的活 性；以及調(diào)節(jié)對(duì)想要的化合物(例如，維生素C和/或2-KGA)的細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)。本發(fā)明提供了篩選能調(diào)節(jié)SMS 43蛋白活性的分子的方法，這種調(diào)節(jié)或者通過(guò)與 蛋白本身或底物或SMS 43蛋白的結(jié)合伴侶的相互作用或者通過(guò)調(diào)節(jié)本發(fā)明的SMS 43核酸 分子的轉(zhuǎn)錄或翻譯來(lái)實(shí)現(xiàn)。在此類方法中，將表達(dá)一種或多種本發(fā)明的SMS 43蛋白的微生 物與一種或多種測(cè)試化合物接觸，并評(píng)估每種測(cè)試化合物對(duì)于SMS 43蛋白表達(dá)水平或活 性的影響。本發(fā)明提供了通過(guò)直接發(fā)酵生產(chǎn)維生素C和/或2-KGA的工藝。具體地，本發(fā)明提 供了用于直接生產(chǎn)維生素C和/或2-KGA的工藝，包括將底物轉(zhuǎn)化為維生素C和/或2-KGA。若干種底物可在本發(fā)明的工藝(即，用于將給定的底物直接轉(zhuǎn)化為維生素C和/ 或2-KGA的工藝，例如上文提到的)中用作為碳源。特別適用的碳源是可以容易地從D-葡 萄糖或D-山梨糖醇代謝途徑獲得的那些，例如，D-葡萄糖、D-山梨糖醇、L-山梨糖、L-山 梨糖酮、2-酮基-L-古洛糖酸鹽/酯、D-葡萄糖酸鹽/酯、2-酮基-D-葡萄糖酸鹽/酯，或 2，5-二酮基-葡萄糖酸鹽/酯。優(yōu)選地，底物選自，例如，D-葡萄糖、D-山梨糖醇、L-山梨 糖或L-山梨糖酮，最優(yōu)選地，選自D-山梨糖醇、L-山梨糖或L-山梨糖酮。在涉及使用微 生物進(jìn)行上述工藝時(shí)，術(shù)語(yǔ)“底物”和“生產(chǎn)底物”在本文中可互換使用。在本文中用于使用微生物進(jìn)行的上述工藝的培養(yǎng)基可以是用于生產(chǎn)維生素C和/ 或2-KGA的任何合適的培養(yǎng)基。典型地，該培養(yǎng)基是包含例如鹽和(多種)底物，并具有一
20定PH的水性培養(yǎng)基。其中底物被轉(zhuǎn)化為維生素C和/或2-KGA的培養(yǎng)基也被稱為生產(chǎn)培養(yǎng)基。本文中使用的“發(fā)酵”或“生產(chǎn)”或“發(fā)酵工藝”可以是利用技術(shù)人員已知的培養(yǎng) 基、條件和方案，使用生長(zhǎng)中的細(xì)胞或非生長(zhǎng)中的所謂靜止細(xì)胞，這在適合于將合適的底物 轉(zhuǎn)化為想要的產(chǎn)物(例如維生素C)的條件下，使用技術(shù)人員已知的培養(yǎng)基、條件和方案對(duì) 所述靜止細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)之后進(jìn)行。優(yōu)選地，用靜止細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)維生素C。用于生產(chǎn)維生素C 的這類方法的一個(gè)例子描述于WO 2005/017159中。優(yōu)選地，使用生長(zhǎng)中的細(xì)胞，例如分批、 補(bǔ)料分批或連續(xù)模式培養(yǎng)的細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)2-KGA (參閱例如EP 518136)。術(shù)語(yǔ)“直接發(fā)酵”、“直接生產(chǎn)”、“直接轉(zhuǎn)化”等意指微生物能通過(guò)一個(gè)或多個(gè)生物 轉(zhuǎn)化步驟將某底物轉(zhuǎn)化為特定的產(chǎn)物，而無(wú)需任何額外的化學(xué)轉(zhuǎn)化步驟。例如，術(shù)語(yǔ)“將 D-山梨糖醇直接轉(zhuǎn)化為維生素C”意在描述下述過(guò)程，其中，微生物生產(chǎn)維生素C，并且，其 中，D-山梨糖醇作為碳源提供，而無(wú)需中間產(chǎn)物化學(xué)轉(zhuǎn)化步驟。能直接發(fā)酵維生素C的單 種微生物是優(yōu)選的。在允許本文定義的從底物開(kāi)始的此類轉(zhuǎn)化進(jìn)行的條件下培養(yǎng)所述微生 物。本文中使用的靜止細(xì)胞指下述微生物的細(xì)胞，所述微生物例如是存活但不能活 躍生長(zhǎng)的，或者是以低的比生長(zhǎng)速率生長(zhǎng)的，例如，低于0. 021Γ1的生長(zhǎng)速率，優(yōu)選地，低于 0. Oir10顯示出上述生長(zhǎng)速率的細(xì)胞被稱為“靜止細(xì)胞模式”。如上所述使用微生物來(lái)進(jìn)行的本發(fā)明的工藝可以以不同的步驟或階段來(lái)進(jìn)行優(yōu) 選地，在第一個(gè)步驟(也被稱為步驟(a)或生長(zhǎng)階段)中，于能夠生長(zhǎng)的條件下對(duì)微生物進(jìn) 行培養(yǎng)。通過(guò)改變條件來(lái)終止該階段，其中，所述條件改變使得微生物的生長(zhǎng)速率降低，導(dǎo) 致靜止細(xì)胞產(chǎn)生，這也被稱為步驟(b)，接著是用(b)的靜止細(xì)胞從底物來(lái)生產(chǎn)維生素C，這 也被稱為生產(chǎn)階段。使用微生物的上述工藝中進(jìn)行的生長(zhǎng)階段和生產(chǎn)階段可在同樣的容器中進(jìn)行， 即，僅有一種容器，或在兩種或更多的不同容器中進(jìn)行，在兩個(gè)階段之間具有可選的分離步 驟?？赏ㄟ^(guò)任何合適的手段從細(xì)胞中回收得到產(chǎn)生的維生素C?！盎厥铡敝?，例如，可將維生 素C從生產(chǎn)培養(yǎng)基中分離出來(lái)?？蛇x地，可對(duì)由此產(chǎn)生的維生素C進(jìn)行進(jìn)一步加工。就關(guān)于使用微生物進(jìn)行上述工藝的本發(fā)明的目的而言，術(shù)語(yǔ)“生長(zhǎng)階段”、“生長(zhǎng)步 驟”和“生長(zhǎng)時(shí)期”在本文中可互換使用。這同樣適用于“生產(chǎn)階段”、“生產(chǎn)步驟”、“生產(chǎn)時(shí) 期”。進(jìn)行本發(fā)明的使用微生物的上述工藝的一種途徑可以是下述工藝，其中微生物 生長(zhǎng)于第一容器(所謂的生長(zhǎng)容器)中，它們作為靜止細(xì)胞的來(lái)源，細(xì)胞中的至少一部分被 轉(zhuǎn)移到第二容器(所謂的生產(chǎn)容器)中。生產(chǎn)容器中的條件可以是使得從生長(zhǎng)容器中轉(zhuǎn) 移出的細(xì)胞變?yōu)樯衔亩x的靜止細(xì)胞的條件。維生素C在第二容器中產(chǎn)生，并從其中被回 收。在關(guān)于使用微生物進(jìn)行上述工藝的方面，在一個(gè)方面，生長(zhǎng)步驟可在水性培養(yǎng)基 中進(jìn)行，即，補(bǔ)充有用于在需氧條件下生長(zhǎng)的合適營(yíng)養(yǎng)物的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。培養(yǎng)可以以，例如， 分批、補(bǔ)料分批、半連續(xù)或連續(xù)模式來(lái)進(jìn)行。培養(yǎng)時(shí)間可以例如隨所用的宿主、PH、溫度和營(yíng) 養(yǎng)培養(yǎng)基而變化，其可以為例如以分批或補(bǔ)料分批模式進(jìn)行時(shí)，大約10小時(shí)至大約10天 之間，優(yōu)選為大約1天至大約10天之間，更優(yōu)選地，大約1至大約5天，這取決于所述微生物。如果細(xì)胞以連續(xù)模式被培養(yǎng)，駐留時(shí)間可以例如為大約2至大約100小時(shí)，優(yōu)選地，大 約2至大約50小時(shí)，這取決于所述微生物。如果微生物選自細(xì)菌，培養(yǎng)可進(jìn)行于大約3. 0至 大約9. 0的pH下，優(yōu)選為大約4. 0至大約9. 0，更優(yōu)選地，大約4. 0至大約8. 0，進(jìn)一步更優(yōu) 選地，大約5. 0至大約8. 0。如果使用了藻類或酵母，培養(yǎng)可進(jìn)行于低于大約7. 0的pH下， 優(yōu)選低于大約6. 0，更優(yōu)選低于大約5. 5，最優(yōu)選地，低于大約5. 0。用于使用細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng) 的合適的溫度范圍可以為，例如，大約13°C至大約40°C，優(yōu)選地，大約18°C至大約37°C，更 優(yōu)選地，大約13°C至大約36°C，最優(yōu)選地，大約18°C至大約33°C。如果使用藻類或酵母，用 于進(jìn)行培養(yǎng)的合適的溫度范圍可以例如為，大約15°C至大約40°C，優(yōu)選地，大約20°C至大 約45°C，更優(yōu)選地，大約25°C至大約40°C，進(jìn)一步更優(yōu)選地，大約25°C至大約38°C，最優(yōu)選 地，大約30°C至大約38°C。用于進(jìn)行培養(yǎng)的培養(yǎng)基通?？梢院邢率鰻I(yíng)養(yǎng)物作為可被吸收 的碳源，例如，甘油、D-甘露醇、D-山梨糖醇、L-山梨糖、赤藻糖醇、核糖醇、木糖醇、阿糖醇、 肌糖、半乳糖醇、D-核糖、D-果糖、D-葡萄糖、蔗糖和乙醇，優(yōu)選地，L-山梨糖、D-葡萄糖、 D-山梨糖醇、D-甘露醇、甘油和乙醇；以及含有可消化的氮源，例如，有機(jī)物質(zhì)，例如，蛋白 胨、酵母提取物和氨基酸。所述培養(yǎng)基可以含有或不含有尿素和/或玉米浸出液和/或面 包酵母。多種無(wú)機(jī)物質(zhì)也可被用作為氮源，例如，硝酸鹽和銨鹽。此外，生長(zhǎng)培養(yǎng)基通常含 有無(wú)機(jī)鹽，例如，硫酸鎂、硫酸錳、磷酸鉀和碳酸鈣。然后可在與上文所述大致相同的模式、 溫度和PH條件下，存在例如D-山梨糖醇、L-山梨糖或D-葡萄糖等底物時(shí)，進(jìn)一步溫育使 用上述方案獲得的細(xì)胞，以使得所述細(xì)胞將底物直接轉(zhuǎn)化為維生素C和/或2-KGA。溫育可 在富含氮的培養(yǎng)基中進(jìn)行，培養(yǎng)基中含有，例如，有機(jī)氮源，例如，蛋白胨、酵母提取物、面包 酵母、尿素、氨基酸和玉米浸出液，或無(wú)機(jī)氮源，例如硝酸鹽和銨鹽，這種情況下，細(xì)胞將能 夠在產(chǎn)生維生素C和/或2-KGA的同時(shí)進(jìn)一步生長(zhǎng)。或者，溫育可在氮貧乏的培養(yǎng)基中進(jìn) 行，在這種情況下，細(xì)胞將基本不生長(zhǎng)，其將處于靜止細(xì)胞模式，或生物轉(zhuǎn)化模式。在所有情 況下，溫育培養(yǎng)基還可含有無(wú)機(jī)鹽，例如硫酸鎂、硫酸錳、磷酸鉀和氯化鈣。在關(guān)于使用微生物進(jìn)行上述工藝的方面，在生長(zhǎng)階段中，比生長(zhǎng)速率例如為至少 0. 021Γ1。對(duì)于以分批、補(bǔ)料分批或半連續(xù)模式生長(zhǎng)的細(xì)胞而言，生長(zhǎng)速率取決于，例如，生長(zhǎng) 培養(yǎng)基的組成、pH、溫度等。通常，生長(zhǎng)速率可以例如在大約0.05至大約OJtT1的范圍內(nèi)， 優(yōu)選地，在大約0. 06至大約0. 151Γ1的范圍內(nèi)，最優(yōu)選地，在大約0. 07至大約0. 131Γ1的范 圍內(nèi)。在使用微生物進(jìn)行的上述方法的另一個(gè)方面，可通過(guò)在瓊脂平板(作為生長(zhǎng)容 器)上對(duì)個(gè)別微生物進(jìn)行培養(yǎng)來(lái)提供靜止細(xì)胞，其中使用了基本上相同的條件，例如，如上 所述的培養(yǎng)時(shí)間、PH、溫度、營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，并添加有瓊脂。在使用微生物進(jìn)行上述工藝的方面，如果生長(zhǎng)和生產(chǎn)階段進(jìn)行于兩種不同的容器 中，那么來(lái)自生長(zhǎng)階段的細(xì)胞可被收獲或濃縮，并轉(zhuǎn)移至第二容器(所謂的生產(chǎn)容器)中。 該容器可以含有補(bǔ)充有任何適用的生產(chǎn)底物(可通過(guò)細(xì)胞被轉(zhuǎn)化為維生素C)的水性培養(yǎng) 基?？赏ㄟ^(guò)任何合適的操作來(lái)收獲或濃縮來(lái)自生長(zhǎng)容器的細(xì)胞，所述操作例如，離心、膜橫 流(membrane crossflow)超濾或微濾、過(guò)濾、傾析、絮凝。由此獲得的細(xì)胞還可以以原始培 養(yǎng)液的形式從生長(zhǎng)容器轉(zhuǎn)移至生產(chǎn)容器中，而不用被收獲、濃縮或洗滌，即，以細(xì)胞懸浮液 的形式被轉(zhuǎn)移。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，細(xì)胞以細(xì)胞懸浮液的形式從生長(zhǎng)容器被轉(zhuǎn)移至 生產(chǎn)容器，在它們之間沒(méi)有任何洗滌或分離步驟。
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因此，在使用微生物進(jìn)行的上述工藝的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，上文所述的本發(fā) 明方法的步驟(a)和(c)不被任何洗滌和/或分離步驟分開(kāi)。在使用微生物進(jìn)行上述工藝的方面，如果生長(zhǎng)和生產(chǎn)階段進(jìn)行于同樣的容器中， 細(xì)胞可以生長(zhǎng)于適當(dāng)?shù)臈l件下，以達(dá)到理想的細(xì)胞密度，接著用含有生產(chǎn)底物的生產(chǎn)培養(yǎng) 基來(lái)替換生長(zhǎng)培養(yǎng)基。此類替換可以例如是，在從容器中收回或收獲上清液的同時(shí)，并以與 之相同的速度，將生產(chǎn)培養(yǎng)基補(bǔ)入到容器中。為將靜止細(xì)胞保留于容器中，可以使用用于細(xì) 胞回收或駐留的操作，例如，細(xì)胞回收步驟。此類回收步驟，例如包括但不限于如下的方法 使用離心機(jī)、過(guò)濾器、超濾步驟的膜橫流微濾、膜反應(yīng)器、絮凝或在合適的多孔、非多孔或聚 合物基質(zhì)上的細(xì)胞固定。在轉(zhuǎn)移階段之后，對(duì)容器應(yīng)用下述工藝條件在此條件下，細(xì)胞以 如上文定義的靜止細(xì)胞模式存在，并且，生產(chǎn)底物能有效地轉(zhuǎn)化為維生素C。在使用微生物進(jìn)行上述工藝的方面，用于生產(chǎn)步驟中的生產(chǎn)容器中的水性培養(yǎng)基 在下文中被稱為生產(chǎn)培養(yǎng)基，其可以僅含有將被轉(zhuǎn)化為維生素C的生產(chǎn)底物，或可以含有 額外的無(wú)機(jī)鹽，例如，氯化鈉、氯化鈣、硫酸鎂、硫酸錳、磷酸鉀、磷酸鈣和碳酸鈣。生產(chǎn)培養(yǎng) 基還可以含有可消化的氮源，例如有機(jī)物質(zhì)，例如，蛋白胨、酵母提取物、尿素、氨基酸和玉 米浸出液；以及無(wú)機(jī)物質(zhì)，例如，氨、硫酸銨和硝酸鈉，其濃度為使得細(xì)胞被保持為上文定義 的靜止細(xì)胞模式的濃度。培養(yǎng)基可以含有或不含有尿素和/或玉米浸出液和/或烘焙酵母。 生產(chǎn)步驟可以，例如，以分批、補(bǔ)料分批、半連續(xù)或連續(xù)模式進(jìn)行。在補(bǔ)料分批、半連續(xù)或連 續(xù)模式下，來(lái)自生長(zhǎng)容器和生產(chǎn)培養(yǎng)基的兩種細(xì)胞都可以以合適的補(bǔ)料速率被連續(xù)或間歇 地補(bǔ)入到生產(chǎn)容器中?；蛘?，僅生產(chǎn)培養(yǎng)基可被連續(xù)或間歇補(bǔ)入到生產(chǎn)容器中，而來(lái)自生長(zhǎng) 容器的細(xì)胞被同時(shí)轉(zhuǎn)移至生產(chǎn)容器。來(lái)自生長(zhǎng)容器的細(xì)胞可在生產(chǎn)容器中用作為細(xì)胞懸浮 液，或者可被用作為例如，在任何固相(例如，多孔或聚合物基質(zhì))上絮凝或固定的細(xì)胞。 生長(zhǎng)時(shí)期被定義為從底物進(jìn)入到生產(chǎn)容器中開(kāi)始，到收獲含有維生素C的上清液(即所謂 的收獲流)之間的時(shí)期，該時(shí)期可根據(jù)，例如，使用的細(xì)胞的濃度和種類、PH、溫度和營(yíng)養(yǎng)培 養(yǎng)基而變動(dòng)，其優(yōu)選在大約2至大約100小時(shí)之間。pH和溫度可與生長(zhǎng)步驟中的pH和溫度 不同，但應(yīng)與生長(zhǎng)步驟中的基本上相同。在使用微生物進(jìn)行上述工藝的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，生產(chǎn)步驟可以以連續(xù)模式 進(jìn)行，這意味著，含有來(lái)自生長(zhǎng)容器的細(xì)胞的第一種補(bǔ)料流和含有底物的第二種補(bǔ)料流被 連續(xù)或間歇補(bǔ)入到生產(chǎn)容器中。第一種流可以僅含有從生長(zhǎng)培養(yǎng)基中分離/分開(kāi)的細(xì)胞， 或可以含有直接來(lái)自生長(zhǎng)步驟的細(xì)胞懸浮液，即，懸浮于生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的細(xì)胞，而沒(méi)有任何 中間的細(xì)胞分離、洗滌和/或分離步驟。在本文中定義的第二種補(bǔ)料流可以包括生產(chǎn)步驟 的操作所需要的所有其它補(bǔ)料流，例如，以一種或多種不同的流的形式存在的包含底物的 生產(chǎn)培養(yǎng)基、用于稀釋的水以及用于控制pH的堿。在關(guān)于使用微生物進(jìn)行上述工藝的方面，當(dāng)兩種流都連續(xù)補(bǔ)料時(shí)，第一種流的補(bǔ) 料速率與第二種流的補(bǔ)料速率之比可在大約0. 01至大約10之間變動(dòng)，優(yōu)選地，在大約0. 01 至大約5之間變動(dòng)，最優(yōu)選地，在大約0. 02至大約2之間變動(dòng)。該比例取決于第一種和第 二種流中各自的細(xì)胞和底物的濃度。進(jìn)行本發(fā)明的使用微生物的上述工藝的另一種途徑可以是在生長(zhǎng)容器中使用一 定細(xì)胞密度的靜止細(xì)胞的工藝。通過(guò)技術(shù)人員已知的方法，于600nm處，細(xì)胞密度作為吸收 單位(光學(xué)密度)被測(cè)得。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，生產(chǎn)步驟中的細(xì)胞密度為至少大約
2310，更優(yōu)選地，大約10至大約200之間，進(jìn)一步更優(yōu)選地，大約15至大約200之間，進(jìn)一步 更優(yōu)選地，大約15至大約120之間，最優(yōu)選地，大約20至大約120之間。在關(guān)于使用微生物進(jìn)行上述工藝的方面，為在生產(chǎn)階段期間(例如，以連續(xù)或半 連續(xù)模式進(jìn)行的)，以想要的細(xì)胞密度將細(xì)胞保持于生產(chǎn)容器中，本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何手段 都可以使用，例如，通過(guò)離心、過(guò)濾、微濾的膜橫流超濾、傾析、絮凝進(jìn)行的細(xì)胞再利用，通過(guò) 膜設(shè)備進(jìn)行的細(xì)胞駐留，或細(xì)胞固定。此外，在生產(chǎn)步驟以連續(xù)或半連續(xù)模式進(jìn)行的情況 下，從生長(zhǎng)容器中連續(xù)或間歇補(bǔ)入細(xì)胞，生產(chǎn)容器中的細(xì)胞密度可被保持于恒定的水平，這 例如，通過(guò)從生產(chǎn)容器中收獲一定量的細(xì)胞來(lái)進(jìn)行，所述的量對(duì)應(yīng)于從生長(zhǎng)容器中補(bǔ)入的 細(xì)胞的量。在關(guān)于使用微生物進(jìn)行上述工藝的方面，從生產(chǎn)容器中回收/收獲在所謂的收獲 流中含有的產(chǎn)生出的維生素C。收獲流可以包括，例如，來(lái)自生產(chǎn)容器的不含細(xì)胞的水溶液 或含有細(xì)胞的水溶液，其中含有通過(guò)生產(chǎn)容器中的靜止細(xì)胞從生產(chǎn)底物轉(zhuǎn)化得到的維生素 C?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何操作，將仍處于收獲流中的細(xì)胞與維生素C分開(kāi)，例如，過(guò) 濾、離心、傾析、膜橫流超濾或微濾、切線流超濾或微濾或死端(dead end)過(guò)濾。在該細(xì)胞 分離操作之后，收獲流中基本不含細(xì)胞。在關(guān)于使用微生物進(jìn)行上述工藝的一個(gè)方面，本發(fā)明的工藝導(dǎo)致維生素C的產(chǎn)率 通常為至少約高于 5. 7g/l，例如，10g/l、20g/l、50g/l、100g/l、200g/l、300g/l、400g/l 或 者超過(guò)600g/l。在一種實(shí)施方式中，通過(guò)本發(fā)明的工藝生產(chǎn)的維生素C的產(chǎn)率在大約高于 5. 7g/l至大約600g/l的范圍內(nèi)。維生素C的產(chǎn)率指直接來(lái)自生產(chǎn)容器的收獲流(即包含 維生素C的不含細(xì)胞上清液)中維生素C的濃度。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及生產(chǎn)維生素C和/或2-KGA的方法，其中， 將根據(jù)本發(fā)明的核苷酸或上文所述的經(jīng)修飾多核苷酸序列引入如本文所述合適的微生物， 在允許以高生產(chǎn)能力、產(chǎn)率和/或效率生產(chǎn)維生素C和/或2-KGA的條件下培養(yǎng)重組微生 物，從培養(yǎng)基中分離產(chǎn)生的發(fā)酵產(chǎn)物，以及可選地，進(jìn)一步純化。在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了能從合適的碳源(例如D-山梨糖醇和/或L-山 梨糖)直接生產(chǎn)維生素C的微生物(特別是Gluconobacter、Gluconacetobacter和 Acetobacter屬的)。當(dāng)例如以靜止細(xì)胞方法在20小時(shí)的溫育期之后測(cè)量時(shí)，發(fā)現(xiàn)這些生 物能以分別高至280mg/l和670mg/l的水平從D-山梨糖醇或L-山梨糖直接生產(chǎn)維生素C。 在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了下述微生物，當(dāng)從D-山梨糖醇起始時(shí)，其能以300mg/l或更 多的量直接生產(chǎn)維生素C，或者當(dāng)從L-山梨糖起始時(shí)，其能以800mg/l或更多的量直接生產(chǎn) 維生素C，所述的量是例如以靜止細(xì)胞方法在20小時(shí)的溫育期之后測(cè)量的。這可以通過(guò)增 加SMS多肽(優(yōu)選地，SMS 43多肽)的活性來(lái)獲得。從D-山梨糖醇產(chǎn)生的維生素C的產(chǎn) 率甚至可以高達(dá)400、600、1000mg/l，或者甚至超過(guò)1. 5、2、4、10、20、50g/l。從L-山梨糖產(chǎn) 生的維生素C的產(chǎn)率甚至可以高達(dá)1000mg/l，或者甚至超過(guò)1.5、2、4、10、20、50g/l。優(yōu)選 地，維生素C的這些量可以是例如以靜止細(xì)胞方法在20小時(shí)的溫育期之后測(cè)量獲得的。本文中使用的以“靜止細(xì)胞方法”進(jìn)行的測(cè)量包括(i)通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知 的任何方法培養(yǎng)細(xì)胞，(ii)從生長(zhǎng)培養(yǎng)基收獲細(xì)胞，以及(iii)在含有將被轉(zhuǎn)化為想要的 產(chǎn)物(例如維生素C)的培養(yǎng)基中，于其中細(xì)胞不再生長(zhǎng)的條件下，溫育收獲的細(xì)胞(即，在 該所謂的轉(zhuǎn)化步驟期間，生物質(zhì)沒(méi)有量上的增加)。靜止細(xì)胞方法的更一般的說(shuō)明描述于例如TO 2005/017159和之前的段落中。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，提供了能夠從合適的碳源(例如D-山梨糖醇和/或L-山 梨糖)直接生產(chǎn)2-KGA的微生物(尤其是來(lái)自Gluconobacter、Gluconacetobacter和 Acetobacter屬)。例如通過(guò)實(shí)施例6的方法測(cè)量時(shí)，發(fā)現(xiàn)這些生物能夠以約至少500mg/ 1，例如約至少700、900、1000、2000mg/l，優(yōu)選地約0. 5到約0. 7g/l的量從D-山梨糖醇或 L-山梨糖直接生產(chǎn)2-KGA。在本發(fā)明的另一方面中，提供了從L-山梨糖開(kāi)始時(shí)能夠以約7、 8、9、10g/l或更多或甚至約50、60、70、80、90、100g/l的量直接生產(chǎn)2-KGA的微生物。這可 通過(guò)提高SMS多肽(優(yōu)選地為G. oxydans DSM17078中的SMS 43多肽)的活性來(lái)實(shí)現(xiàn)。攜帶有例如經(jīng)修飾的SMS 43基因并且能以顯著更高的產(chǎn)率、生產(chǎn)能力和/或效率 生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物的重組微生物可在上文所述的需氧條件下被培養(yǎng)于補(bǔ)充有合適營(yíng)養(yǎng)物的水 性培養(yǎng)基中。在另一個(gè)方面，本發(fā)明的工藝可組合有將產(chǎn)生的維生素C和/或2-KGA與收獲流 中含有的其它組分分離和/或純化的額外步驟，即，所謂的下游加工步驟。這些步驟可包括 技術(shù)人員已知的任何手段，例如，濃縮、結(jié)晶、沉淀、吸附、離子交換、電滲析、兩極膜電滲析 和/或反滲透。維生素C可作為游離酸形式或其已知的任何鹽的形式被進(jìn)一步純化，這是 通過(guò)下述操作手段來(lái)進(jìn)行的，例如，用活性炭進(jìn)行處理、離子交換、吸附和洗脫、濃縮、結(jié)晶、 過(guò)濾和干燥。特別地，將維生素C與收獲流中其它組分的第一次分離可通過(guò)例如下述方法 的任何合適的組合或重復(fù)來(lái)進(jìn)行，所述方法例如兩區(qū)室或三區(qū)室電滲析、兩極膜電滲析、 反滲透或吸附(其進(jìn)行于，例如，離子交換樹(shù)脂上或非離子樹(shù)脂上)。如果獲得的維生素C 的形式為L(zhǎng)-抗壞血酸的鹽，將該鹽形式轉(zhuǎn)化為游離酸形式可通過(guò)例如，兩極膜電滲析、離 子交換、模擬移動(dòng)床色譜技術(shù)等來(lái)進(jìn)行。上述步驟的組合也可使用，例如，將電滲析和兩極 膜電滲析組合為一個(gè)步驟，以及使用模擬移動(dòng)床色譜方法的多個(gè)離子交換步驟的組合。上 述任何方案單獨(dú)或組合就構(gòu)成了用于分離和純化產(chǎn)物(即維生素C)的方便的手段。由此 獲得的產(chǎn)物還可被進(jìn)一步分離(例如，通過(guò)濃縮、結(jié)晶、沉淀、對(duì)晶體的洗滌和干燥的方式 來(lái)進(jìn)行)和/或進(jìn)一步純化(用活性炭處理、離子交換和/或重結(jié)晶)。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過(guò)一系列上述下游加工步驟來(lái)從收獲流中純化維生 素C，而不必在該加工中的任何時(shí)刻將其轉(zhuǎn)移到非水性溶液中，S卩，所有步驟都在水性環(huán)境 中進(jìn)行。此類優(yōu)選的下游加工方案可以包括，例如，通過(guò)兩區(qū)室或三區(qū)室電滲析對(duì)來(lái)自生產(chǎn) 容器的收獲流進(jìn)行濃縮，通過(guò)兩極膜電滲析和/或離子交換將濃縮溶液中以其鹽的形式存 在的維生素C轉(zhuǎn)化為其酸的形式，通過(guò)例如用活性炭、離子交換或非離子樹(shù)脂進(jìn)行處理等 方法來(lái)進(jìn)行純化，接著進(jìn)行進(jìn)一步的濃縮步驟和結(jié)晶。這些晶體可被分離、洗滌和干燥。如 果必要的話，晶體還可被重新溶解于水中，用活性炭和/或離子交換樹(shù)脂對(duì)其進(jìn)行處理，并 重結(jié)晶。然后可對(duì)上述晶體進(jìn)行分離、洗滌和干燥。在一個(gè)尤其優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)維生素C和/或2-KGA的工 藝，其中使用本文所述底物之一在靜止細(xì)胞條件下溫育如本文所述的重組G. oxydans菌株 (尤其是G. oxydans DSM 17078)，尤其是使用2% D-山梨糖醇在30°C和220rpm下溫育20 小時(shí)，并且其中關(guān)于下述(1)和(2)對(duì)所述菌株進(jìn)行遺傳修飾，所述(1)為優(yōu)選地在高度嚴(yán) 謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO :1(SMS 43基因)所示序列雜交的核苷酸序列編碼的SMS 43多肽， (2)為優(yōu)選地在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID N0:9(sndhai基因)所示序列雜交的核苷酸序列編碼的本文所述的SNDHai多肽，并且其中所述修飾導(dǎo)致各個(gè)基因的提高的活性。如果如 本文所述使用除G. oxydans DSM17078之外的其它菌株例如G. oxydans IFO 3293，則所述重 組菌株優(yōu)選地在優(yōu)選地在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO :11中所示序列雜交的核苷酸序列 編碼的如本文所述的SMS 44多肽中帶有突變，尤其是位于對(duì)應(yīng)于SEQID N0:12第563位的 氨基酸位置上的突變，優(yōu)選地是用1563置換T563。從上述描述中可顯而易見(jiàn)根據(jù)本發(fā)明的方法的發(fā)酵產(chǎn)物可不僅限于維生素C。 本文中使用的“想要的化合物”或“發(fā)酵產(chǎn)物”可以是Gluconobacter oxydans的任何天然 產(chǎn)物，其包括生物合成途徑的終產(chǎn)物和中間產(chǎn)物，例如，L-山梨糖、L-山梨糖酮、D-葡萄糖 酸鹽/酯、2-酮基-D-葡萄糖酸鹽/酯、5-酮基-D-葡萄糖酸鹽/酯、2，5- 二酮基-葡萄糖 酸鹽/酯和2-酮基-L-古洛糖酸鹽/酯(2-KGA)，特別是對(duì)維生素C的生物合成生產(chǎn)。因此，本發(fā)明涉及本文所述的多核苷酸、多肽、載體、引物和重組微生物在生產(chǎn)維 生素C(即將碳源直接轉(zhuǎn)化為維生素C)中的用途。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，本文所述的 經(jīng)修飾的多核苷酸、多肽、載體和重組微生物用于提高對(duì)維生素C生產(chǎn)的產(chǎn)率、生產(chǎn)能力和 /或效率。術(shù)語(yǔ)“產(chǎn)量”或“生產(chǎn)能力”是本領(lǐng)域已知的，其包括給定的時(shí)間和給定的發(fā)酵體 積中形成的發(fā)酵產(chǎn)物(例如維生素C)的濃度(例如，每升每小時(shí)的kg產(chǎn)物)。術(shù)語(yǔ)“生產(chǎn) 效率”包括獲得的特定水平的生產(chǎn)所需要的時(shí)間(例如，細(xì)胞達(dá)到發(fā)酵產(chǎn)物的特定速率輸 出所需時(shí)間有多長(zhǎng))。術(shù)語(yǔ)“產(chǎn)率”是本領(lǐng)域已知的，其包括碳源向產(chǎn)物(例如，維生素C) 轉(zhuǎn)化的效率。這通常寫作，例如，kg產(chǎn)物/kg碳源?！霸黾印被衔锏摹爱a(chǎn)率和/或產(chǎn)量和 /或生產(chǎn)能力”表示，給定的時(shí)間中給定量的培養(yǎng)物中回收的該化合物分子或回收的該化合 物有用分子的量增加。術(shù)語(yǔ)“生物合成”或“生物合成途徑”是本領(lǐng)域已知的，其包括通過(guò) 細(xì)胞，以可能是多步驟且被高度調(diào)控的過(guò)程，從中間產(chǎn)物化合物對(duì)化合物(優(yōu)選地，有機(jī)化 合物)的合成。措辭“代謝”是本領(lǐng)域已知的，其包括對(duì)生物中發(fā)生的生化反應(yīng)的總稱。然 后，特定化合物的代謝(例如，氨基酸(例如甘氨酸)的代謝)包含細(xì)胞中與該化合物相關(guān) 的總的生物合成、修飾和降解途徑。措辭“轉(zhuǎn)運(yùn)”或“運(yùn)入”是本領(lǐng)域已知的，其包括一種或 多種分子在協(xié)助下移動(dòng)經(jīng)過(guò)該分子本來(lái)不能經(jīng)過(guò)或不能高效經(jīng)過(guò)的細(xì)胞膜。本文中使用的維生素C可以是水溶液中發(fā)現(xiàn)的L-抗壞血酸的任何化學(xué)形式，例如 未離解的、以其游離酸形式存在的或離解為陰離子的。L-抗壞血酸的溶解的鹽形式的特征 為在通常發(fā)現(xiàn)于發(fā)酵上清液中的任何種類的陽(yáng)離子(例如，鉀、鈉、銨或鈣)存在時(shí)的陰 離子。還包括在內(nèi)的可以有L-抗壞血酸的游離酸形式的經(jīng)過(guò)分離的晶體。另一方面，用其 相應(yīng)的鹽的名稱來(lái)命名L-抗壞血酸的鹽形式的經(jīng)過(guò)分離的晶體，即抗壞血酸鈉、抗壞血酸 鉀、抗壞血酸鈣等。在本文中使用時(shí)，2-KGA可以是存在于水性溶液中的2-酮古洛酸的任何化學(xué)形 式，例如未解離的形式、游離酸形式或解離的離子形式。2-酮古洛酸的溶解鹽形式可以被表 征為存在發(fā)酵上清液中通常存在的任何種類陽(yáng)離子(例如鉀、鈉或鈣)時(shí)的陰離子。還可 包括在內(nèi)的是游離酸形式2-酮古洛酸的經(jīng)分離的結(jié)晶。另一方面，鹽形式2-酮古洛酸的 經(jīng)分離的結(jié)晶通過(guò)它們相應(yīng)鹽的名稱來(lái)命名，即2-酮古洛酸鈉、2-酮古洛酸鉀、2-酮古洛 酸鈣等等。本發(fā)明的有利的實(shí)施方式通過(guò)從屬權(quán)利要求而顯而易見(jiàn)。根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將明白本發(fā)明的上述和其它方面以及上述和其它實(shí)施方式。將通過(guò)下述實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明，所述實(shí)施例不應(yīng)被理解為起限制作用。本 文提到的所有參考文獻(xiàn)、專利申請(qǐng)、專利和公開(kāi)的專利申請(qǐng)(尤其是WO 2005/017159、WO 2006/084719和EP 518136)的內(nèi)容都通過(guò)引用并入本文。實(shí)施例1制備染餼體SMS 43 DNA以及通過(guò)PCR擴(kuò)增DNA片段在由25g/l甘露糖醇、5g/l酵母提取物(Difco)和3g/l細(xì)菌蛋白胨(Difco)構(gòu)成 的液體甘露糖醇培養(yǎng)基(MB)中，于30°C對(duì)Gluconobacter oxydans DSM 17078的細(xì)胞進(jìn)
一$的.#， Sambrooket al (1989) “ Molecular Cloning :A Laboratory Manual/ Second Edition" ， ColdSpring Harbor Laboratory Press fffi^^iTj^, JA^n^f^MMM 備 Gluconobacter oxydans DSM 17078 的染色體 DNA。使用按照上文所述制備的染色體DNA以及一組引物——Pf (SEQ IDNO 3)和 Pr (SEQ ID NO :4)，通過(guò)PCR來(lái)制備DNA片段。按照廠商說(shuō)明書，用Expand High Fidelity PCR試劑盒(Roche Diagnostics)和IOng染色體DNA以10 μ 1的總體積來(lái)進(jìn)行反應(yīng)，獲得 了含有SMS 43 DNA序列(SEQ ID NO 1)的PCR產(chǎn)物。從反應(yīng)體系中回收PCR產(chǎn)物，并驗(yàn)證 了其正確序列。實(shí)施例2 在其它牛物中鑒定和克降SMS 43基因和等同物可通過(guò)簡(jiǎn)單的DNA雜交實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)定其它生物(而非本文前面公開(kāi)的那些，例如表 1中提到的生物)中SEQ ID NO :1和/或等同物的存在。在含有5g/l細(xì)菌蛋白胨(Difco)、5g/l酵母提取物(Difco)、5g/l葡萄糖、5g/ 1甘露糖醇、lg/1 MgSO4 · 7H20、5ml/l乙醇和15g/l瓊脂的No. 350培養(yǎng)基上，于27°C，對(duì) 菌株 Acetobacter aceti subsp. xylinum IF013693 和 IFO 13773 進(jìn)行 3 天的培養(yǎng)。在 含有25g/l甘露糖醇、5g/l酵母提取物(Difco)、3g/l細(xì)菌蛋白胨(Difco)和18g/l瓊 脂(Difco)的甘露糖醇培養(yǎng)基(MB)型瓊脂培養(yǎng)基上，于27°C，對(duì)所有其它Acetobacter、 Gluconacetobacter菌株禾口所有Gluconobacter菌株進(jìn)行3天的培養(yǎng)。在Luria Broth瓊 脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)E. coli K-12。在廠商推薦的培養(yǎng)基上或者按照本領(lǐng)域已知的方法培養(yǎng)其 它菌株。按照例如 Sambrook et al, 1989, ‘‘ Molecular Cloning :A Laboratory Manual/ Second Edition" ,Cold SpringHarbor Laboratory Press 所述，從合適的生物(例如表 1 提到的)提取基因組DNA。用限制性酶EcoRI或HindIII消化基因組DNA制備物，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳(1% 瓊脂糖)分離出Iyg的DNA片段。用0.25N HCl對(duì)凝膠進(jìn)行15分鐘的處理，接著再用 0. 5N NaOH處理30分鐘，然后按照廠商說(shuō)明書，用Vacuum Blotter Model 785 (BIO-RAD Laboratories AG, Switzerland)將凝膠印到硝酸纖維素或尼龍膜上。然后用得到的印跡 與含有探針(例如具有SEQ ID NO :1序列的DNA片段，或含有SEQ IDNO :1序列的部分或全 部的DNA片段)的溶液接觸或雜交，以從測(cè)試生物中探測(cè)陽(yáng)性DNA片段。按照實(shí)施例1，用 PCR-DIG 標(biāo)記試劑盒(RocheDiagnostics)和引物組 SEQ ID NO 3 禾口 SEQ ID NO :4 來(lái)制備 DIG標(biāo)記的探針，例如SEQ ID NO :1。此印跡雜交結(jié)果示于表1中。雜交在嚴(yán)謹(jǐn)條件或高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下進(jìn)行。在嚴(yán)謹(jǐn)條件下的雜交是在6x氯化鈉/ 檸檬酸鈉(SSC)中，大約45°C下進(jìn)行，隨后在lxSSC、0. 1% SDS中，50°C下至少洗滌一次，其 中洗滌溫度可以高達(dá)約55°C，甚至高達(dá)約60°C或65°C。高度嚴(yán)格條件下的雜交在含或不含100 μ g/ml 的鮭魚精 DNA 的 DigEasyHyb 溶液(Roche Diagnostics GmbH)中，或包含 50% 甲酰胺、5x SSC(150mM NaCl、15mM檸檬酸三鈉)、0. 02%十二烷基磺酸鈉、0. 1 % N-月桂酰 肌氨酸和2%封閉試劑(Roche Diagnostics GmbH)的溶液中，于42°C溫育2小時(shí)至4天， 接著在2x SSC和0. 1% SDS中，于室溫下，洗兩次膜，每次5至15分鐘，然后在65-68 °C，于 0. 5x SSC和0. SDS或0. Ix SSC和0. 1 % SDS中洗兩次，每次15-30分鐘。為檢測(cè)出與 探針DNA具有較低相同性的DNA片段，最后的洗滌步驟可在較低溫度(例如50-65°C)進(jìn)行 較短的洗滌時(shí)間(例如1-15分鐘)。此實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如表1 (信號(hào)1)所示。可通過(guò)本領(lǐng)域公知的PCR方法，對(duì)表1所示各生物中陽(yáng)性信號(hào)對(duì)應(yīng)的基因加以克 隆，這使用此生物的基因組DNA與合適的引物組(例如，SEQ ID NO :3和SEQ ID NO 4)在 實(shí)施例1所述條件下進(jìn)行，或者按照這樣進(jìn)行每個(gè)反應(yīng)使用5至IOOng基因組DNA (總體 積 50μ1)。使用 Expand High Fidelity PCR 系統(tǒng)(Roche Diagnostics)，采用下述反應(yīng) 條件94°C 2分鐘；30個(gè)循環(huán)的⑴94°C 15秒的變性步驟，(ii)60°C 30秒的退火步驟， (iii)72°C 0.5至5分鐘(取決于目標(biāo)DNA長(zhǎng)度，1分鐘/lkb)的合成步驟；72°C延伸7分 鐘。此實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如表1 (信號(hào)2)所示?；蛘?，用簡(jiǎn)并引物來(lái)進(jìn)行PCR，對(duì)簡(jiǎn)并引物的設(shè)計(jì)可基于SEQ IDNO 2或基于作為 共有序列的氨基酸序列(通過(guò)對(duì)由序列搜索程序(例如BLASTP，或當(dāng)核苷酸序列被用作“查 詢序列”時(shí)，BLASTX)獲得的若干氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)選出的)，以找到與SEQ ID NO 2的 蛋白相似的蛋白。對(duì)使用簡(jiǎn)并引物進(jìn)行的PCR而言，第二個(gè)退火步驟的溫度(見(jiàn)上文)被 降低至55°C，或者甚至50-45°C。此實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如表1(信號(hào)3)所示。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳來(lái)分離PCR反應(yīng)的樣品，在用例如溴化乙啶染色后，用透照 器(transilluminator)來(lái)觀察條帶，從凝膠對(duì)條帶進(jìn)行分離，驗(yàn)證正確的序列。表1 其它生物中SMS 43基因的等同物。
菌株信號(hào)1信號(hào)2信號(hào)3G.oxydans DSM 17078+++++++++G. oxydans IFO 3293+++++++++G. oxydans IFO 3292++++++G.oxydans ATCC 62IH+++++++++G. oxydans IFO 12528+++++++++G.oxydans G 624++++++G. oxydans T-100++++++
28
權(quán)利要求
選自下組的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈，所述組由(a)編碼包含根據(jù)SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(b)包含根據(jù)SEQ ID NO1的核苷酸序列的多核苷酸；(c)包含下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列能夠使用來(lái)自微生物的基因組DNA作為模板，并使用根據(jù)SEQ ID NO3和SEQ IDNO4的引物組，通過(guò)核酸擴(kuò)增(例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))來(lái)獲得；(d)多核苷酸，其包含編碼被(a)至(c)中任一項(xiàng)的多核苷酸編碼的多肽的片段或衍生物的核苷酸序列，其中，在所述衍生物中，一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基較之所述多肽被保守取代，并且，所述片段或衍生物具有轉(zhuǎn)移酶[EC 2]的活性，優(yōu)選地具有轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)的磷酸轉(zhuǎn)移酶[EC 2.7]的活性；(e)編碼轉(zhuǎn)移酶[EC 2]，優(yōu)選地編碼轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)的磷酸轉(zhuǎn)移酶[EC2.7]的多核苷酸，且其互補(bǔ)鏈能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(a)至(d)中任一項(xiàng)所定義的多核苷酸雜交；以及(f)編碼轉(zhuǎn)移酶[EC 2]，優(yōu)選地編碼轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)的磷酸轉(zhuǎn)移酶[EC2.7]多肽的多核苷酸，且其與(a)至(d)中任一項(xiàng)所定義的多核苷酸至少60％相同，例如70％、85％、90％或95％相同；構(gòu)成。
2.含有如權(quán)利要求1所述的多核苷酸的載體。
3.如權(quán)利要求2所述的載體，其中所述多核苷酸與允許在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá) 的表達(dá)控制序列可操作地連接。
4.用如權(quán)利要求1所述的多核苷酸或權(quán)利要求2或3的載體遺傳工程改造的微生物。
5.如權(quán)利要求4所述的微生物，其能以300mg/l或更多的量從D-山梨糖醇直接生產(chǎn)維 生素C，所述的量是在20小時(shí)溫育之后以靜止細(xì)胞方法測(cè)量的。
6.如權(quán)利要求5所述的微生物，其能以800mg/l或更多的量從L-山梨糖直接生產(chǎn)維生 素Co
7.如權(quán)利要求4所述的微生物，其能以至少500mg/l的量從D-山梨糖醇或L-山梨糖 生產(chǎn)2-KGA。
8.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸編碼的多肽。
9.用于生產(chǎn)能表達(dá)權(quán)利要求8所述的多肽的細(xì)胞的工藝，其包括下述步驟用權(quán)利要 求2或3所述的載體或用權(quán)利要求1所述的多核苷酸對(duì)細(xì)胞進(jìn)行遺傳工程改造。
10.權(quán)利要求1所述的多核苷酸或權(quán)利要求2或3所述的載體或權(quán)利要求4到7中任 一項(xiàng)所述的微生物用于生產(chǎn)維生素C和/或2-KGA的用途。
11.如權(quán)利要求10所述的用途，其中所述多核苷酸與表達(dá)控制序列可操作地連接，并 被引入微生物。
12.如權(quán)利要求11所述的用途，其中，所述表達(dá)控制序列包含調(diào)控序列和/或啟動(dòng)子序 列和/或終止子序列，并且，這些序列中的至少一種被改變，所述改變以使得所述微生物對(duì) 維生素C和/或2-KGA的生產(chǎn)的產(chǎn)率和/或效率提高的方式進(jìn)行。
13.如權(quán)利要求12所述的用途，其中，所述表達(dá)控制序列包含調(diào)控序列和/或啟動(dòng)子 序列和/或終止子序列，并且，這些序列中的至少一種被改變，所述改變以使得轉(zhuǎn)移酶[EC 2]，優(yōu)選地編碼轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)的磷酸轉(zhuǎn)移酶[EC 2.7]的活性增加和/或提高的方式進(jìn)行。
14.如權(quán)利要求4到7中任一項(xiàng)所述的微生物或含有包含權(quán)利要求1所述的多核苷酸 的基因的微生物，所述微生物經(jīng)過(guò)遺傳改變，所述改變以使得所述微生物對(duì)維生素C和/或 2-KGA的生產(chǎn)的產(chǎn)率和/或效率提高的方式進(jìn)行。
15.如權(quán)利要求14所述的微生物，其生產(chǎn)出具有增加的和/或提高的轉(zhuǎn)移酶[EC2]活 性的、權(quán)利要求8所述的多肽，所述轉(zhuǎn)移酶[EC 2]優(yōu)選地是轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)的磷酸轉(zhuǎn)移酶[EC 2. 7]。
16.如權(quán)利要求4-7、14或15中任意一項(xiàng)所述的微生物，其中，根據(jù)權(quán)利要求1所述的 多核苷酸被過(guò)量表達(dá)。
17.如權(quán)利要求4到7或14到16中任意一項(xiàng)所述的微生物，所述微生物選自由 Pseudomonas> Pantoea、Escherichia、Ketogulonicigenium 禾口乙酸細(xì)菌組成的組。
18.如權(quán)利要求17所述的微生物，其中所述乙酸細(xì)菌選自Gluconobacter、 Acetobacter 或 Gluconacetobacter,優(yōu)選地是 Acetobactersp.、Acetobacter aceti、 Gluconobacter frateurii、Gluconobacter cerinus、Gluconobacter thailandicus、 Gluconobacter oxydans,更優(yōu)選地是Gluconobacter oxydans,最優(yōu)選地是Gluconobacter oxydans DSM 17078。
19.在微生物中生產(chǎn)增強(qiáng)的轉(zhuǎn)移酶[EC2]基因的工藝，所述微生物包含權(quán)利要求1所 述的多核苷酸，所述轉(zhuǎn)移酶[EC 2]優(yōu)選是轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)的磷酸轉(zhuǎn)移酶[EC 2. 7]，所述工藝 包括如下步驟以使得所述微生物對(duì)維生素C和/或2-KGA的生產(chǎn)的產(chǎn)率和/或效率提高 的方式來(lái)改變所述多核苷酸。
20.用于生產(chǎn)能產(chǎn)生維生素C和/或2-KGA的微生物的工藝，所述工藝包括如下步驟 改變所述微生物，使得所述微生物生產(chǎn)出具有增加的和/或提高的轉(zhuǎn)移酶[EC 2]活性的多 肽，優(yōu)選地，具有轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)的磷酸轉(zhuǎn)移酶[EC 2.7]活性的多肽，導(dǎo)致所述微生物對(duì)維 生素C和/或2-KGA的生產(chǎn)產(chǎn)率和/或效率提高。
21.用于生產(chǎn)含有下述內(nèi)源基因的微生物的工藝，所述內(nèi)源基因包含權(quán)利要求1的多 核苷酸，所述工藝包括如下步驟改變所述微生物，使得所述內(nèi)源基因被過(guò)量表達(dá)，導(dǎo)致所 述微生物對(duì)維生素C和/或2-KGA的生產(chǎn)產(chǎn)率和/或效率提高。
22.用于生產(chǎn)含有如權(quán)利要求1所述的多核苷酸的微生物的工藝，所述工藝包括如下 步驟向所述微生物中引入一個(gè)或多個(gè)拷貝的如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，導(dǎo)致所述微 生物對(duì)維生素C和/或2-KGA的生產(chǎn)產(chǎn)率和/或效率提高。
23.如權(quán)利要求22所述的工藝，其還包括下述步驟改變所述微生物使得被引入的多 核苷酸過(guò)量表達(dá)，導(dǎo)致所述微生物對(duì)維生素C和/或2-KGA的生產(chǎn)產(chǎn)率和/或效率提高。
24.如權(quán)利要求20到23中任一項(xiàng)所述的工藝，其用于生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求14至18中任 意一項(xiàng)所述的微生物。
25.用根據(jù)權(quán)利要求14至18或權(quán)利要求4至7中任意一項(xiàng)所述的微生物生產(chǎn)維生素 C和/或2-KGA的工藝，其中，在水性培養(yǎng)基中，在允許從D-山梨糖醇或L-山梨糖對(duì)維生 素C和/或2-KGA進(jìn)行直接生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)所述微生物，以及，可選地，維生素C和/或 2-KGA作為發(fā)酵產(chǎn)物被分離。
全文摘要
本發(fā)明涉及新鑒定出的基因，其編碼L-抗壞血酸(下文中也稱為維生素C)和/或2-酮-L-古洛酸(下文中也稱為2-KGA)合成中涉及的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還涉及包含該新穎基因的全長(zhǎng)多核苷酸序列的多核苷酸及其片段，所述多核苷酸編碼的新穎的多肽及其片段，以及它們的功能等同物。本發(fā)明還涉及所述多核苷酸和多肽作為生物技術(shù)工具在從微生物生產(chǎn)維生素C和/或2-KGA中的用途，其中對(duì)所述多核苷酸和/或被編碼的多肽的修飾對(duì)所述微生物中生產(chǎn)所述發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)率、產(chǎn)量和/或效率有著直接或間接的影響。本發(fā)明還包括使用多核苷酸和經(jīng)修飾的多核苷酸序列轉(zhuǎn)化宿主微生物的方法/工藝。本發(fā)明還涉及經(jīng)過(guò)遺傳工程改造的微生物及其用于直接生產(chǎn)維生素C和/或2-KGA的用途。
文檔編號(hào)C12N9/12GK101952419SQ200980102071
公開(kāi)日2011年1月19日 申請(qǐng)日期2009年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月10日
發(fā)明者奈杰爾·約翰·芒希亞, 巴斯蒂恩·切弗雷克斯 申請(qǐng)人:帝斯曼知識(shí)產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司