專利名稱：用于檢測人甲型流感病毒的核苷酸序列、方法及試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種用于檢測人甲型流感病毒的核苷酸序列、方法和試劑盒，具體講 涉及一組利用多重熒光PCR對人甲型流感病毒進行檢測的引物對和探針，以及檢測方法的
試齊U盒。
背景技術：
流感是一種由流感病毒引起的、通過呼吸道傳播的傳染性疾病。流感病毒 (Influenzavirus)屬正粘液病毒科，流感病毒屬，根據(jù)病毒抗原特性及其基因特性的不同， 流感病毒分為甲、乙、丙三型。甲型流感病毒根據(jù)H和N抗原不同，又分為許多亞型，H可分 為15個亞型(HI H15)，N有9個亞型(附 N9)。其中僅H1、H3、H9主要感染人類，其它 許多亞型的自然宿主是多種禽類和動物。一般情況下，禽流感病毒不會感染鳥類和豬以外 的動物。但1997年香港首次報道發(fā)生18例H5W人禽流感感染病例，其中6例死亡，引起全 球廣泛關注。1997年以后，世界上又先后幾次發(fā)生了禽流感病毒感染人的事件。具有高致 病性的H5W等禽流感病毒，一旦發(fā)生變異而具有人與人的傳播能力，會導致人間禽流感流 行，預示著禽流感病毒對人類已具有很大的潛在威脅。歷史上流感的大流行曾經(jīng)給人類造 成過很嚴重的后果，例如1918年爆發(fā)的由Hmi亞型流感病毒引起的“西班牙流感”。它是 20世紀最具災難性的流感病毒，在不到一年時間里感染了全世界一半的人口，導致數(shù)千萬 人死亡。流感大流行通常是由一種新出現(xiàn)的或者以前人未曾感染過的病毒引起的，人體對 這種新病毒沒有免疫力，再加上其傳播范圍廣、速度快，而疫苗的研制和生產(chǎn)又很難立即跟 上，所以容易造成許多人感染甚至死亡。近年來，隨著全球經(jīng)濟發(fā)展的一體化程度的不斷加 深，世界各國之間的人員往來和流動日益頻繁和密切，從而使流感病毒在全球的播散和蔓 延速率進一步加快，一旦某個國家或地區(qū)流感爆發(fā)，疫情將會在短時間內(nèi)迅速播散至世界 各地。2009年發(fā)生的新型甲型Hmi型流感疫情正是如此。2009年4月，墨西哥確診了首例新型甲型Hmi型流感病例。在隨后的4月至5月 期間，新型甲型Hmi型流感疫情在世界范圍內(nèi)迅速蔓延，僅僅一個多月的時間內(nèi)，全球多 個國家和地區(qū)均發(fā)生了新型甲型Hmi型流感疫情。以疫情最為嚴重的墨西哥和美國為例， 截至2009年5月14日，墨西哥全國確診新型甲型Hmi流感病例上升至2720例，其中死亡 人數(shù)上升至64人；而在美國五十個州中，已有四十七個州宣布發(fā)現(xiàn)新型甲型Hmi流感病 例，患者總數(shù)也上升至4298人，比前一天增加946人。我國內(nèi)地也于5月11日確診了首例 新型甲型Hmi流感病例，截至2009年5月19日，已經(jīng)出現(xiàn)4例新型甲型Hmi流感病例， 均為輸入性流感病例。世界衛(wèi)生組織已于2009年4月29日宣布全球流感大流行警告級別 為5級，并且隨著新型甲型Hmi流感疫情在世界范圍內(nèi)的不斷蔓延，爆發(fā)全球流感大流行 的風險日益提升，世界衛(wèi)生組織已于5月初明確表示不排除把警告級別升至6級，即宣布流 感大流行到來的可能性。此次新型甲型Hmi型流感疫情發(fā)生后，世界各國的科學家們立即展開了相關的 科學研究工作。最新的調(diào)查和研究結(jié)果顯示，每個感染新型甲型Hmi型流感的墨西哥患者
5都會導致增加1. 2至1. 6個新病例，證明流感病毒的人際傳播在不斷發(fā)生。這一流感病毒 的傳染率，到目前為止是1/3，全球范圍內(nèi)可能會有20億人受到這種流感病毒的感染，一場 全球性大流感現(xiàn)在已經(jīng)初見端倪。但是由于目前尚不能確定新型甲型Hmi型流感病毒的 毒性、可傳播性和病毒的起源，并且該病毒的潛伏期和傳染期也不是很明確，因此科學家們 還無法判斷其在世界范圍內(nèi)擴散的程度。盡管目前新型甲型Hmi流感病毒仍在擴散，而且如何演變尚不可預知，但只要全 球通力合作，充分做好疫情的監(jiān)控和防范工作，就可以最大限度地減少流感病毒對人類的 危害。早期確診新型甲型Hmi流感病毒感染病例，及時進行病例的隔離和治療，是阻止流 感疫情蔓延的重要措施。然而，隨著流感病毒不斷地在人際之間傳播，其發(fā)生變異以及毒力 由弱變強的可能性都是存在的，特別是病毒血凝素(HA)基因和神經(jīng)氨酸酶(NA)基因的具 有高度的變異性和變異的不確定性的特點，使得流感病毒的診斷和分型方法一直滯后于其 疫情的爆發(fā)。因此，在較短的時間內(nèi)研制出快速、特異、靈敏的檢測方法和診斷試劑，是對抗 新型甲型mm流感病毒的首要任務。由于單克隆抗體技術的普遍應用，許多以單抗為基礎、針對甲型流感病毒的ELISA 和膠體金診斷試劑盒已研制成功，例如甲型流感病毒膠體金診斷試劑對來自疫區(qū)飛機的乘 客進行快速篩查，不失為一種有價值的方法。隨著現(xiàn)代生物技術的發(fā)展，分子生物學技術已被大量應用于甲型流感病毒的快速 診斷。此次疫情爆發(fā)后世界衛(wèi)生組織陸續(xù)公布的流感病毒快速檢測方法，均是基于新型甲 型Him流感病毒核酸的熒光定量RT PCR檢測技術。該技術設計的試劑易于制備，且具有快 速、靈敏、易于在基層推廣的優(yōu)點。但是這些方法還存在一定的缺陷，如所使用的引物和探 針的序列特異性低，難以對當前新型甲型Him流感病毒的基因組散在的多處變異進行特 異性診斷，易于與以往的季節(jié)性甲型Him流感病毒產(chǎn)生交叉反應或不能擴增出在引物或 探針位置出現(xiàn)變異的新型甲型Him流感病毒株，從而導致假陽性或假陰性結(jié)果。所以WHO 不將其作為確診的診斷方法。因此，人們迫切需要一種準確、快速、易于操作的甲型流感病 毒的分型檢測的檢測方法，相關的確診方法也成為各國爭相研究的重點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明目的在于提出一種檢測人甲型流感病毒的引物和探針。本發(fā)明的又一發(fā)明目的在于提出一種檢測人甲型流感病毒的方法。本發(fā)明的再一發(fā)明目的在于提出一種檢測人甲型流感病毒的試劑盒。為了完成本發(fā)明的發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術方案為本發(fā)明涉及一種用于檢測人甲型流感病毒的核苷酸序列，包含由SEQ ID NO 1至 SEQ IDN0 12所示的任一核苷酸序列的部分序列或全序列。本發(fā)明的第一優(yōu)選方案為本發(fā)明的用于檢測人甲型流感病毒的核苷酸序列選自 用于擴增人甲型流感病毒靶核酸序列的通用引物對和探針、用于擴增甲型HI流感病毒靶 核酸序列的通用引物對和探針和用于擴增新型甲型Hmi流感病毒靶核酸序列的引物對和 探針中的至少一組以及用于擴增人內(nèi)參基因核酸序列的引物對和探針，其中用于擴增人甲型流感病毒靶核酸序列的通用引物對和探針為第一引物的序列為 由SEQID NO :1所示核苷酸序列的部分序列或全序列，第二引物的序列為由SEQ ID NO :2所示核苷酸序列的部分序列或全序列，探針的序列為由SEQ ID NO :3所示核苷酸序列的部分 序列或全序列；用于擴增甲型HI流感病毒靶核酸序列的通用引物對和探針為第一引物的序列 為由SEQID NO :4所示核苷酸序列的部分序列或全序列，第二引物的序列為由SEQ ID NO 5 所示核苷酸序列的部分序列或全序列，探針的序列為由SEQ ID NO :6所示核苷酸序列的部 分序列或全序列；用于擴增新型甲型Hmi流感病毒靶核酸序列的引物對和探針為第一引物的序 列為由SEQ ID NO :7所示核苷酸序列的部分序列或全序列，第二引物的序列為由SEQ ID NO :8所示核苷酸序列的部分序列或全序列，探針的序列為由SEQ ID NO :9所示核苷酸序列 的部分序列或全序列；用于擴增人內(nèi)參基因核酸序列的引物對和探針為第一引物的序列為由SEQ ID NO 10所示核苷酸序列的部分序列或全序列，第二引物的序列為由SEQ ID NO 11所示核 苷酸序列的部分序列或全序列，探針的序列為由SEQ ID NO: 12所示核苷酸序列的部分序列 或全序列。本發(fā)明的第二優(yōu)選方案為本發(fā)明的用于檢測人甲型流感病毒的核苷酸序列選自 用于擴增人甲型流感病毒靶核酸序列的通用引物對和探針、用于擴增甲型HI流感病毒靶 核酸序列的通用引物對和探針和用于擴增新型甲型Hmi流感病毒靶核酸序列的引物對和 探針中的至少一組以及用于擴增人內(nèi)參基因核酸序列的引物對和探針，其中用于擴增人甲型流感病毒靶核酸序列的通用引物對和探針為第一引物的序列為 由SEQID N0 :1所示核苷酸序列的至少15個連續(xù)核苷酸，第二引物的序列為由SEQ ID NO 2所示核苷酸序列的至少15個連續(xù)核苷酸，探針的序列為由SEQ ID NO 3所示核苷酸序列 的至少15個連續(xù)核苷酸；用于擴增甲型HI流感病毒靶核酸序列的通用引物對和探針為第一引物的序列 為由SEQID NO :4所示核苷酸序列的至少15個連續(xù)核苷酸，第二引物的序列為由SEQ ID NO :5所示核苷酸序列的至少15個連續(xù)核苷酸，探針的序列為由SEQ ID NO :6所示核苷酸 序列的至少15個連續(xù)核苷酸；用于擴增新型甲型Hmi流感病毒靶核酸序列的引物對和探針為第一引物的序 列為由SEQ ID NO :7所示核苷酸序列的至少15個連續(xù)核苷酸，第二引物的序列為由SEQ ID NO 8所示核苷酸序列的至少15個連續(xù)核苷酸，探針的序列為由SEQ ID NO 9所示核苷酸 序列的至少15個連續(xù)核苷酸；用于擴增人內(nèi)參基因核酸序列的引物對和探針為第一引物的序列為由SEQ ID NO :10所示核苷酸序列的至少15個連續(xù)核苷酸，第二引物的序列為由SEQ ID N0:11所示 核苷酸序列的至少15個連續(xù)核苷酸，探針的序列為由SEQ ID NO: 12所示核苷酸序列的至 少15個連續(xù)核苷酸。本發(fā)明的第三優(yōu)選方案為本發(fā)明的用于檢測人甲型流感病毒的核苷酸序列選自 用于擴增人甲型流感病毒靶核酸序列的通用引物對和探針、用于擴增甲型HI流感病毒靶 核酸序列的通用引物對和探針和用于擴增新型甲型Hmi流感病毒靶核酸序列的引物對和 探針中的至少一組以及用于擴增人內(nèi)參基因核酸序列的引物對和探針，其中用于擴增人甲型流感病毒靶核酸序列的通用引物對和探針為第一引物的序列為
7由SEQ ID NO :1所示核苷酸序列，第二引物的序列為由SEQ ID NO :2所示核苷酸序列，探針 的序列為由SEQ ID NO 3所示核苷酸序列；用于擴增甲型HI流感病毒靶核酸序列的通用引物對和探針為第一引物的序列 為由SEQID NO :4所示核苷酸序列，第二引物的序列為由SEQ ID NO :5所示核苷酸序列，探 針的序列為由SEQ ID NO 6所示核苷酸序列；用于擴增新型甲型Hmi流感病毒靶核酸序列的引物對和探針為第一引物的序 列為由SEQ ID NO :7所示核苷酸序列，第二引物的序列為由SEQ ID NO :8所示核苷酸序列， 探針的序列為由SEQ ID NO 9所示核苷酸序列；用于擴增人內(nèi)參基因核酸序列的引物對和探針為第一引物的序列為由SEQ ID NO :10所示核苷酸序列，第二引物的序列為由SEQ ID NO :11所示核苷酸序列，探針的序列 為由SEQ ID NO 12所示核苷酸序列。本發(fā)明的第四優(yōu)選方案為本發(fā)明的用于檢測人甲型流感病毒的核苷酸序列選自 用于擴增人甲型流感病毒靶核酸序列的通用引物對和探針、用于擴增甲型HI流感病毒靶 核酸序列的通用引物對和探針、用于擴增新型甲型Hmi流感病毒靶核酸序列的引物對和 探針和用于擴增人內(nèi)參基因核酸序列的弓I物對和探針，其中用于擴增人甲型流感病毒靶核酸序列的通用引物對和探針為第一引物的序列為 由SEQID N0 1所示核苷酸序列，第二引物的序列為由SEQ ID NO 2所示核苷酸序列，探針 的序列為由SEQ ID NO 3所示核苷酸序列；用于擴增甲型HI流感病毒靶核酸序列的通用引物對和探針為第一引物的序列 為由SEQID NO :4所示核苷酸序列，第二引物的序列為由SEQ ID NO :5所示核苷酸序列，探 針的序列為由SEQ ID NO 6所示核苷酸序列；用于擴增新型甲型Hmi流感病毒靶核酸序列的引物對和探針為第一引物的序 列為由SEQ ID NO :7所示核苷酸序列，第二引物的序列為由SEQ ID NO :8所示核苷酸序列， 探針的序列為由SEQ ID NO 9所示核苷酸序列；用于擴增人內(nèi)參基因核酸序列的引物對和探針為第一引物的序列為由SEQ ID NO :10所示核苷酸序列，第二引物的序列為由SEQ ID NO :11所示核苷酸序列，探針的序列 為由SEQ ID NO 12所示核苷酸序列。本發(fā)明的第五優(yōu)選方案為本發(fā)明的用于檢測人甲型流感病毒的核苷酸序列選自 用于擴增甲型Hi流感病毒靶核酸序列的通用引物對和探針、用于擴增新型甲型mm流感 病毒靶核酸序列的引物對和探針和用于擴增人內(nèi)參基因核酸序列的引物對和探針，其中用于擴增甲型HI流感病毒靶核酸序列的通用引物對和探針為第一引物的序列 為由SEQID NO :4所示核苷酸序列，第二引物的序列為由SEQ ID NO :5所示核苷酸序列，探 針的序列為由SEQ ID NO 6所示核苷酸序列；用于擴增新型甲型Hmi流感病毒靶核酸序列的引物對和探針為第一引物的序 列為由SEQ ID NO :7所示核苷酸序列，第二引物的序列為由SEQ ID NO :8所示核苷酸序列， 探針的序列為由SEQ ID NO 9所示核苷酸序列；用于擴增人內(nèi)參基因核酸序列的引物對和探針為第一引物的序列為由SEQ ID NO :10所示核苷酸序列，第二引物的序列為由SEQ ID NO :11所示核苷酸序列，探針的序列 為由SEQ ID NO 12所示核苷酸序列。
本發(fā)明的引物和探針的核苷酸序列為
SEQ ID NO 1GACCRATCYTGTCACCTCTGACSEQ ID NO 2AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTASEQ ID NO 3R0X II GCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-BHQ2SEQ ID NO 4TGAGATATTCCCCAAGACAAGTTCSEQ ID NO 5TTTGTAGAAGCTTTTTGCTCCAGSEQ ID NO 6FAM-TCATGACTCGAACAAAGGTGTAACGG-BHQ1SEQ ID NO 7CAGATYYTGGCGATCTATTCAACSEQ ID NO 8CCCATTRGARCACATCCAGAASEQ ID NO 9HEX-TCTCCCTGGGGGCAATC-BHQ1SEQ ID NO 10AGATTTGGACCTGCGAGCGSEQ ID NO 11GAGCGGCTGTCTCCACAAGTSEQ ID NO 12CY5-TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG-BHQ3本發(fā)明還涉及一種檢測人甲型流感病毒的方法，包括以下步驟(1)提取核酸樣本；(2)以步驟(1)提取的核酸為模板，用本發(fā)明所述的為引物對和探針，多重熒光 PCR擴增病原體的靶核酸序列；(3)采用熒光檢測儀對擴增產(chǎn)物進行分析，并分析結(jié)果。其中，本發(fā)明檢測方法采用的多重熒光PCR的反應體系為50mL反應體系中含有
9 本發(fā)明的檢測方法中的PCR擴增條件為48 53°C 25 35分鐘、90 92°C 3 分鐘預變性；90 92°C 10秒、58 60°C 30秒、重復35 40個循環(huán)；最后37°C保溫。本發(fā)明檢測方法的PCR擴增條件優(yōu)選為50°C 30分鐘、92°C 3分鐘預變性； 92°C 10秒、60°C 30秒、重復40個循環(huán)；最后37°C保溫。本發(fā)明還涉及一種檢測人甲型流感病毒的試劑盒，含有本發(fā)明所述的引物對和探針。本發(fā)明的試劑盒包括逆轉(zhuǎn)錄PCR反應液800 1000重量份，體積比為1 3的逆轉(zhuǎn)錄酶和熱啟動DNA聚合 酶的混合物40 50重量份，陽性對照15重量份，陰性對照500 600重量份，DEPC水500 600 重量份，半數(shù)組織培養(yǎng)感染量(TCID5Q)為1X10—4的新型甲型H1N1定量參比品15重量份，半數(shù)組 織培養(yǎng)感染量為1X10—3的新型甲型H1N1定量參比品15重量份，半數(shù)組織培養(yǎng)感染量為1X10_2 的新型甲型H1N1定量參比品15重量份和半數(shù)組織培養(yǎng)感染量為1X10—1的新型甲型H1N1定量 參比品15重量份；其中，逆轉(zhuǎn)錄-PCR反應液的組成為10X逆轉(zhuǎn)錄-PCR反應液100重量份，10mM dNTP 40重量份，5 X逆轉(zhuǎn)錄增強液200重量份，RNA酶抑制劑10重量份，20 y M弓丨物和探針20重 量份，水430重量份；陽性對照品為含有質(zhì)粒pMD19A、pMD19Hl和pMD19RnaseP的溶液，新型甲型 H1N1定量參比品為含有質(zhì)粒PMD19H1N1的溶液，陰性對照品為正常人的口腔分泌物。本發(fā)明的試劑盒優(yōu)選為逆轉(zhuǎn)錄PCR反應液800重量份，體積比為1 3的逆轉(zhuǎn)錄酶和熱啟動DNA聚合酶的 混合物40重量份，陽性對照15重量份，陰性對照500重量份，DEPC水500重量份，半數(shù)組織 培養(yǎng)感染量為1X 10_4的新型甲型Hmi定量參比品15重量份，半數(shù)組織培養(yǎng)感染量為1X 10_3 的新型甲型Hmi定量參比品15重量份，半數(shù)組織培養(yǎng)感染量為1X 10_2的新型甲型Hmi定量 參比品15重量份和半數(shù)組織培養(yǎng)感染量為1X1CT1的新型甲型Hmi定量參比品15重量份； 其中，逆轉(zhuǎn)錄-PCR反應液的組成為10 X逆轉(zhuǎn)錄-PCR反應液100重量份，lOmM dNTP 40重量 份，5X逆轉(zhuǎn)錄增強液200重量份，RNA酶抑制劑10重量份，20 u M引物和探針20重量份，水 430重量份；陽性對照品為含有質(zhì)粒pMD19A、pMD19Hl和pMD19RnaseP的溶液，新型甲型Hmi 定量參比品為含有質(zhì)粒pMD19Hmi的溶液，陰性對照品為正常人的口腔分泌物。疫情爆發(fā)后世界衛(wèi)生組織陸續(xù)公布的流感病毒快速檢測方法，就是基于新型甲型
10H1N1流感病毒核酸的熒光定量RT-PCR檢測技術。但由于當時所獲得的新型甲型Hmi流 感病毒的序列有限，所以WHO推薦的引物和探針與當前新型甲型mm流感病毒的基因組相 比，出現(xiàn)幾處變異，造成擴增敏感度低，甚至漏診。基于這些實際問題，我們根據(jù)以往的流感 病毒和最新公布的新型Hmi流感病毒基因組序列，設計特異的引物和探針，以區(qū)別甲型流 感、甲型HI型流感及此次流行的新型甲型Hmi流感病毒。從而可以在一個體系內(nèi)區(qū)分并 鑒定這三類病毒。與世界衛(wèi)生組織提供的探針引物相比，我們的靈敏度提高了 一個數(shù)量級。 我們對WHO設計的和本發(fā)明設計的針對新型甲型Hmi流感病毒的引物探針擴增體系比較。 我們選取了此次流行的新型甲型Hmi流感病毒的CDNA為模板，對WHO設計的(圖1)和本 發(fā)明設計的(圖2)針對新型甲型Hmi流感病毒的引物探針擴增體系進行比較，結(jié)果顯示， 用WHO設計的引物和探針，獲得的靈敏度是l(T3TCID50(Tissue culture infective dose, 半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量)，而本發(fā)明設計的弓I物和探針，其靈敏度可達到10_4TCID50。此外，該發(fā)明的整個檢測體系采用多重熒光PCR系統(tǒng)，即采用多重熒光PCR檢測技 術，在同一個熒光PCR反應體系中分別檢測甲型流感、甲型HI型流感及此次流行的新型甲 型Hmi流感病毒，同時使用內(nèi)標，以質(zhì)控核酸抽提及PCR反應過程，消除假陰性的產(chǎn)生，使 整個檢測過程實驗準確可靠，對于提高早期檢出率，減少醫(yī)務人員的操作時間，降低成本， 減輕病人經(jīng)濟負擔等都具有重要的影響。


圖1為WHO設計的引物和探針在比較實驗結(jié)果中的實驗結(jié)果；圖2為本發(fā)明設計的引物和探針(SEQ ID NO 4 6)在比較實驗中的實驗結(jié)果；圖3為多重熒光PCR檢測儀“R0X”通道分析結(jié)果，其中1為豬HI型流感病毒樣本， 2為新型甲型Hmi型流感病毒樣本，3為季節(jié)性甲型HI型流感病毒樣本，4季節(jié)性甲型H3 型流感病毒樣本，5為季節(jié)性甲型H9型流感病毒樣本，6為高致病性H5W禽流感病毒樣本， 7為高致病性H5W禽流感樣本；圖4為多重熒光PCR檢測儀“HEX/VIC”通道分析結(jié)果，其中1為豬HI型流感病毒 樣本，2為新型甲型Hmi型流感病毒樣本，3為季節(jié)性甲型HI型流感病毒樣本；圖5為多重熒光PCR檢測儀“FAM”通道分析結(jié)果:3為季節(jié)性甲型HI型流感病毒樣本；圖6為多重熒光PCR檢測儀“CY5”通道分析結(jié)果1為豬HI型流感，2為新型甲型 H1N1型流感，3為季節(jié)性甲型HI型流感，4為季節(jié)性甲型H3型流感，5為季節(jié)性甲型H9型 流感，6為高致病性H5W禽流感病毒。
具體實施例方式本發(fā)明提出的具體實施方式
，僅限于對本發(fā)明的技術方案做進一步的解釋和說 明，并不對本發(fā)明的技術方案做出限制。實施例1甲型流感病毒、季節(jié)性甲型流感病毒和新型甲型Hmi流感病毒分型檢 測方法和試劑盒1 材料1. 1病毒標本1份甲型豬流感病毒樣本(病毒樣本來自中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所)；
1份此次新型流行的甲型Hmi流感病毒樣本(病毒樣本來自香港瑪麗醫(yī)院)；3份甲型季節(jié)性流感病毒樣本1份季節(jié)性甲型HI型流感、1份季節(jié)性甲型H3型 流感、1份季節(jié)性甲型H9型流感(病毒樣本來自廣州疾病預防控制中心)；1份高致病性H5W禽流感病毒樣(病毒樣本來自香港瑪麗醫(yī)院)；1份乙型流感病毒(病毒樣本來自中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所)。2.方法2. 1毒株總RNA的獲取采用Qiagen公司的RNA試劑盒，處理樣本，抽提并純化總RNA，整個操作步驟按照 廠家的說明書進行。2. 2引物合成由上海超世生物科技有限公司完成(合成方法參考現(xiàn)代分子生物 學實驗技術(第二版)盧圣棟主編)2. 3本發(fā)明應用多重PCR熒光原理，采用多重熒光PCR檢測技術，在同一反應管內(nèi) 加入各自的引物與探針，由于四種探針的5’端分別標記不同波長的報告熒光(Fam，Hex, Rox, Cy5)，PCR反應進行時，不同的報告熒光基團釋放熒光，熒光測定儀器分別讀取四種波 長的熒光信號進行分析，可在同一個熒光PCR反應體系中分別檢測甲型流感、甲型HI型流 感及此次流行的新型甲型Hmi流感病毒。對反應的條件進行優(yōu)化，最終確定的反應體系及反應條件如下(1)多重熒光PCR反應體系(50mL反應體系)50mL反應體系中含有 其中，引物和探針中包含SEQ ID 1-12。
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(2)多重熒光PCR擴增條件本發(fā)明采用的PCR熒光檢測儀型號ABI系列多重熒光PCR擴增條件50°C 30分鐘、92°C 3分鐘預變性；92°C 10秒、60°C 30 秒重復40個循環(huán)；最后37°C保溫。在PCR循環(huán)第二步60°C時收集熒光信號。檢測通道為、HEX(VIC)、R0X*CY5。參 比熒光定為none。3.實驗結(jié)果3. 1選擇檢測通道“R0X”對甲型流感病毒樣本進行分析，如圖3所示，可檢測到豬 Hl型流感(1)、新型甲型Hmi型流感(2)、季節(jié)性甲型Hl型流感(3)、季節(jié)性甲型H3型流 感(4)、季節(jié)性甲型H9型流感(5)、高致病性H5W禽流感病毒(6)。3. 2選擇檢測通道“HEX/VIC”對季節(jié)性甲型Hl流感病毒樣本進行分析，如圖4所 示，可檢測到豬Hl型流感(1)、新型甲型Hmi型流感(2)、季節(jié)性甲型Hl型流感(3)；3. 3選擇檢測通道“FAM”對新型甲型流感病毒樣本進行分析，如圖5所示，可檢測 到新型甲型Hmi型流感⑵；3. 4選擇檢測通道“CY5”對內(nèi)參品進行分析，如圖6所示，可檢測到豬Hl型流感 (1)、新型甲型Hmi型流感(2)、季節(jié)性甲型Hl型流感(3)、季節(jié)性甲型H3型流感(4)、季節(jié) 性甲型H9型流感(5)、高致病性H5W禽流感病毒(6)。實施例2試劑盒 本試劑盒規(guī)格為20人份，試劑盒組成
其中，RT-PCR反應液取 10X 逆轉(zhuǎn)錄 PCR 反應液 100 μ 1，IOmMWdNTP 40 μ 1,5Χ 逆轉(zhuǎn)錄增強液200ml，RNA酶抑制劑10 μ 1，20 μ M的引物和探針20 μ 1(SEQ ID NO: 1-12)， 至800ml，充分混勻?；旌厦敢?0 μ 1的逆轉(zhuǎn)錄酶和30 μ 1的熱啟動DNA聚合酶。陽性對照品為含有質(zhì)粒pMD19A、pMD19Hl和pMD19RnaseP的溶液，新型甲型Hmi定量參比品為含有質(zhì)粒pMD19Hmi的溶液，陰性對照品為正常人的口腔分泌物。實施例3試劑盒的使用方法試劑準備1. 1試劑開管前完全解凍后充分混勻并短暫離心1. 2配制按每個反應取RT PCR反應液43ml、混合酶2ml計算，乘以所需的反應管 數(shù)(建議酌情可多配一個反應量)，加于一總的無菌離心管中，振蕩混勻。1. 3分裝用微量加樣器在每一 PCR反應管內(nèi)加入45ml上述混勻的反應液，存于 4°C。注意最好在RNA提取結(jié)束后配制反應液。2.標本RNA提取采用Qiagen公司的RNA試劑盒，處理樣本，抽提并純化總RNA， 溶解在50ulDEPC水中，整個操作步驟按照廠家的說明書進行。3.加樣在上述準備的裝有RT-PCR混合反應液的PCR反應管中加入標本5ul、陰 性對照RNA或陽性對照DNA 5ml。4. PCR 反應PCR熒光檢測儀型號ABI系列在PCR熒光檢測儀上設定程序為 在PCR循環(huán)第二步60°C時收集熒光信號。檢測通道為FAM、HEX(VIC)、R0X和CY5。 參比熒光定為none。5.反應完畢，存儲結(jié)果以便進行數(shù)據(jù)處理。6.實驗結(jié)果計算(1)基線設定根據(jù)實驗的具體情況，調(diào)節(jié)基線的起止點。一般選擇曲線波動較小，較穩(wěn)定的那段 作為基線，用戶可根據(jù)實際情況自行調(diào)整。起點要避開開始幾個循環(huán)由于高溫導致的信號 增高，設在信號已經(jīng)降到背景高度且能維持平穩(wěn)的地方，終點要避免覆蓋信號已經(jīng)開始有 明顯增長的地方。依據(jù)實驗曲線走勢的不同，一般start值可選擇在3-12之間；stop值選 擇以起點與終點之間最好能間隔8個循環(huán)以上為原則，以更好滿足統(tǒng)計基線標準偏差的數(shù) 學要求。(2)閾值設定以高于無擴增增長曲線的最高點，且陰性對照品未檢出為原則，確定起始閾值。(3)熒光檢測儀根據(jù)輸入的基線和閾值自動計算出定量結(jié)果。7.分析檢驗結(jié)果7. 1結(jié)果分析在進行RT-PCR反應檢測中，選擇“FAM”對新型甲型Hmi流感進行 分析。選擇“HEX/VIC”對季節(jié)性甲型Hl流感進行分析。選擇“R0X”對A型流感進行分析。 選擇“ CY5 ”對內(nèi)參品進行分析。
7. 2結(jié)果判定(1)當標本檢測中的CT值小于或等于36.00，則判為陽性。(2)當標本檢測中的CT值大于或等于38. 00，則判為低于最低檢出極限或陰性。(3)當標本檢測中的CT值在36. 00 38. 00之間，可能是被檢標本的DNA滴度較 低，或由于熒光的不穩(wěn)定，易造成漏檢，因此需重新測定以獲得可靠結(jié)果。重新測定后，若結(jié) 果小于38. 00，則判為陽性，大于或等于38，則判為低于最低檢出極限或陰性。 3.實驗有效條件(I)PCR 擴增實驗a.陰性對照的0￥5通道(^值必須<36，？411、昍乂作10和ROX通道CT值必須彡38 或顯示“Undet”。b.陽性對照的FAM通道CT值必須< 36，HEX (VIC)、ROX和CY5通道CT值必須彡38 或顯示“Undet”。c.對在RT PCR擴增反應中其檢測的四個通道CT值均彡38或顯示“Undet”的標 本，建議重新進行檢測實驗，并且在原來的標本液中加入本試劑盒中的陰性對照100ml，進 行RNA的抽提和相關的PCR實驗。
1權利要求
一種用于檢測人甲型流感病毒的核苷酸序列，其特征在于，包含由SEQ ID NO1至SEQ ID NO12所示的任一核苷酸序列的部分序列或全序列。
2.根據(jù)權利要求1所述的用于檢測人甲型流感病毒的核苷酸序列，其特征在于，所述 核苷酸序列選自用于擴增人甲型流感病毒靶核酸序列的通用引物對和探針、用于擴增甲型 HI流感病毒靶核酸序列的通用引物對和探針和用于擴增新型甲型mm流感病毒靶核酸 序列的引物對和探針中的至少一組以及用于擴增人內(nèi)參基因核酸序列的引物對和探針，其 中用于擴增人甲型流感病毒靶核酸序列的通用引物對和探針為第一引物的序列為由 SEQID NO :1所示核苷酸序列的部分序列或全序列，第二引物的序列為由SEQ ID N0:2所示 核苷酸序列的部分序列或全序列，探針的序列為由SEQ ID NO :3所示核苷酸序列的部分序 列或全序列；用于擴增甲型HI流感病毒靶核酸序列的通用引物對和探針為第一引物的序列為由 SEQID NO :4所示核苷酸序列的部分序列或全序列，第二引物的序列為由SEQ ID N0:5所示 核苷酸序列的部分序列或全序列，探針的序列為由SEQ ID NO :6所示核苷酸序列的部分序 列或全序列；用于擴增新型甲型Hmi流感病毒靶核酸序列的引物對和探針為第一引物的序列為 由SEQ ID NO :7所示核苷酸序列的部分序列或全序列，第二引物的序列為由SEQ ID NO 8 所示核苷酸序列的部分序列或全序列，探針的序列為由SEQ ID NO :9所示核苷酸序列的部 分序列或全序列；用于擴增人內(nèi)參基因核酸序列的引物對和探針為第一引物的序列為由SEQ ID NO 10 所示核苷酸序列的部分序列或全序列，第二引物的序列為由SEQ ID NO :11所示核苷酸序列 的部分序列或全序列，探針的序列為由SEQ ID NO :12所示核苷酸序列的部分序列或全序 列。
3.根據(jù)權利要求2所述的檢測人甲型流感病毒的核苷酸序列，其特征在于，其中用于擴增人甲型流感病毒靶核酸序列的通用引物對和探針為第一引物的序列為由SEQID NO :1所示核苷酸序列的至少15個連續(xù)核苷酸，第二引物的序列為由SEQ ID NO 2 所示核苷酸序列的至少15個連續(xù)核苷酸，探針的序列為由SEQ ID NO :3所示核苷酸序列的 至少15個連續(xù)核苷酸；用于擴增甲型HI流感病毒靶核酸序列的通用引物對和探針為第一引物的序列為由 SEQID NO :4所示核苷酸序列的至少15個連續(xù)核苷酸，第二引物的序列為由SEQ ID NO 5 所示核苷酸序列的至少15個連續(xù)核苷酸，探針的序列為由SEQ ID NO :6所示核苷酸序列的 至少15個連續(xù)核苷酸；用于擴增新型甲型Hmi流感病毒靶核酸序列的引物對和探針為第一引物的序列為 由SEQ ID N0:7所示核苷酸序列的至少15個連續(xù)核苷酸，第二引物的序列為由SEQ ID NO 8所示核苷酸序列的至少15個連續(xù)核苷酸，探針的序列為由SEQ ID NO :9所示核苷酸序列 的至少15個連續(xù)核苷酸；用于擴增人內(nèi)參基因核酸序列的引物對和探針為第一引物的序列為由SEQ ID NO 10 所示核苷酸序列的至少15個連續(xù)核苷酸，第二引物的序列為由SEQ ID N0:11所示核苷酸 序列的至少15個連續(xù)核苷酸，探針的序列為由SEQ ID NO :12所示核苷酸序列的至少15個連續(xù)核苷酸。
4.根據(jù)權利要求3所述的檢測人甲型流感病毒引物和探針，其特征在于，用于擴增人甲型流感病毒靶核酸序列的通用引物對和探針為第一引物的序列為由 SEQ ID N0:1所示核苷酸序列，第二引物的序列為由SEQ ID NO :2所示核苷酸序列，探針的 序列為由SEQ ID NO 3所示核苷酸序列；用于擴增甲型HI流感病毒靶核酸序列的通用引物對為第一引物的序列為由SEQ IDN0:4所示核苷酸序列，第二引物的序列為由SEQ ID NO :5所示核苷酸序列，探針的序列 為由SEQ ID NO 6所示核苷酸序列；用于擴增新型甲型Hmi流感病毒靶核酸序列的引物對和探針為第一引物的序列為 由SEQ ID NO :7所示核苷酸序列，第二引物的序列為由SEQ ID NO :8所示核苷酸序列，探針 的序列為由SEQ ID NO 9所示核苷酸序列；用于擴增人內(nèi)參基因核酸序列的引物對和探針為第一引物的序列為由SEQ ID NO 10 所示核苷酸序列，第二引物的序列為由SEQ ID NO :11所示核苷酸序列，探針的序列為由SEQ ID NO: 12所示核苷酸序列。
5.根據(jù)權利要求1所述的用于檢測人甲型流感病毒核苷酸序列，其特征在于，所述引 物選自用于擴增人甲型流感病毒靶核酸序列的通用引物對和探針、用于擴增甲型HI流感 病毒靶核酸序列的通用引物對和探針、用于擴增新型甲型Hmi流感病毒靶核酸序列的引 物對和探針和用于擴增人內(nèi)參基因核酸序列的引物對和探針，其中用于擴增人甲型流感病毒靶核酸序列的通用引物對和探針為第一引物的序列為由 SEQID NO :1所示核苷酸序列，第二引物的序列為由SEQ ID NO :2所示核苷酸序列，探針的 序列為由SEQ ID NO 3所示核苷酸序列；用于擴增甲型HI流感病毒靶核酸序列的通用引物對和探針為第一引物的序列為由 SEQID NO :4所示核苷酸序列，第二引物的序列為由SEQ ID NO :5所示核苷酸序列，探針的 序列為由SEQ ID NO 6所示核苷酸序列；用于擴增新型甲型Hmi流感病毒靶核酸序列的引物對和探針為第一引物的序列為 由SEQ ID NO :7所示核苷酸序列，第二引物的序列為由SEQ ID NO :8所示核苷酸序列，探針 的序列為由SEQ ID NO 9所示核苷酸序列；用于擴增人內(nèi)參基因核酸序列的引物對為和探針第一引物的序列為由SEQ ID NO 10 所示核苷酸序列，第二引物的序列為由SEQ ID NO: 11所示核苷酸序列，探針的序列為由SEQ ID NO 12所示核苷酸序列。
6.一種檢測人甲型流感病毒的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)提取核酸樣本；(2)以步驟(1)提取的核酸為模板，用權利要求1至5任意一項所述的引物和探針序 列，多重熒光PCR擴增病原體的靶核酸序列；(3)采用熒光檢測儀對擴增產(chǎn)物進行分析，并分析結(jié)果。
7.根據(jù)權利要求6所述的檢測人甲型流感病毒的方法，其特征在于，所述的多重熒光 PCR的反應體系為50mL反應體系中含有提取的RNA樣本5 yl ；10 X逆轉(zhuǎn)錄-PCR反應液5 ill ；引物和探針(20iiM)liil ； dNTPs(10mM)2u 1 ； 5X逆轉(zhuǎn)錄增強液10ml ； 逆轉(zhuǎn)錄酶0. ； 熱啟動DNA聚合酶2iU ； RNA酶抑制劑0. 5 ill ； 水 24 ii 1。
8.根據(jù)權利要求6所述的檢測人甲型流感病毒的方法，其特征在于，所述的PCR擴增 條件為48 53°C 25 35分鐘、90 92°C 3分鐘預變性；90 92°C 10秒、58 60°C 30 秒，重復35 40個循環(huán)；最后37°C保溫。
9.根據(jù)權利要求8所述的檢測人甲型流感病毒的方法，其特征在于，所述的PCR擴增條 件為50°C 30分鐘、92°C 3分鐘預變性；92°C 10秒、60°C 30秒，重復40個循環(huán)；最后37°C保
10.一種檢測人甲型流感病毒的試劑盒，其特征在于，含有權利要求1 5任一所述的 引物和探針。
11.根據(jù)權利要求10所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的組成為逆轉(zhuǎn)錄-PCR 反應液800重量份，體積比為1 3的逆轉(zhuǎn)錄酶和熱啟動DNA聚合酶的混合物40重量份， 陽性對照15重量份，陰性對照500重量份，DEPC水500重量份，半數(shù)組織培養(yǎng)感染量為 IX 10-4的新型甲型Hmi定量參比品15重量份，半數(shù)組織培養(yǎng)感染量為IX 10-3的新型甲 型Hmi定量參比品15重量份，半數(shù)組織培養(yǎng)感染量為1X10-2的新型甲型Hmi定量參比 品15重量份，和半數(shù)組織培養(yǎng)感染量為IX 10-1的新型甲型Hmi定量參比品15重量份；其中，逆轉(zhuǎn)錄-PCR反應液的組成為10X逆轉(zhuǎn)錄-PCR反應液100重量份，10mM dNTP40 重量份，5 X逆轉(zhuǎn)錄增強液200重量份，RNA酶抑制劑10重量份，20 u M引物和探針20重量 份，水430重量份；陽性對照品為含有質(zhì)粒pMD19A、pMD19Hl和pMD19RnaseP的溶液，新型甲型Hmi定量 參比品為含有質(zhì)粒pMD19Hmi的溶液，陰性對照品為正常人的口腔分泌物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于檢測人甲型流感病毒的核苷酸序列、方法以及試劑盒，本發(fā)明可分型檢測人甲型流感病毒、甲型H1流感和新型甲型H1N1流感病毒，其引物和探針包含由SEQID NO1至SEQ ID NO12所示的任一核苷酸序列。本發(fā)明可在同一個熒光PCR反應體系中分別檢測甲型流感、甲型H1型流感及新型甲型H1N1流感病毒，同時使用內(nèi)標以質(zhì)控核酸抽提及PCR反應過程，消除假陰性的產(chǎn)生，使整個檢測過程實驗準確可靠，可提高早期檢出率，減少醫(yī)務人員的操作時間，降低成本，減輕病人經(jīng)濟負擔。
文檔編號C12Q1/68GK101921870SQ200910303328
公開日2010年12月22日 申請日期2009年6月17日 優(yōu)先權日2009年6月17日
發(fā)明者丁國徽, 嚴安, 李輝, 熊慧, 董輝, 袁國勇, 謝立群, 趙國屏, 車小燕, 金維榮, 陳嘉錚 申請人:上海人類基因組研究中心;上海生物芯片有限公司;銘源醫(yī)療發(fā)展有限公司