專利名稱：：一種施氏假單胞菌菌株及其在降解高分子量多環(huán)芳烴中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種細(xì)菌的新菌株及該菌株在降解高分子多環(huán)芳烴的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：多環(huán)芳烴(PAHs)污染的微生物修復(fù)是指利用PAHs降解菌降解環(huán)境中的PAHs污染物或?qū)AHs轉(zhuǎn)化為無(wú)害物質(zhì)的過程，具有高效低耗、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)備受人們關(guān)注。這一技術(shù)的核心在于獲得高效降解PAHs的微生物菌種，因?yàn)榫N的優(yōu)劣直接影響修復(fù)時(shí)間和修復(fù)效果。迄今，在眾多已被分離和鑒定的PAHs降解菌中，大多數(shù)菌株只能降解低分子量PAHs，而具降解四環(huán)和四環(huán)以上高分子量PAHs能力的菌種極少。受高分子量PAHs降解菌缺乏的影響，現(xiàn)有微生物修復(fù)技術(shù)在修復(fù)效果方面常局限于去除環(huán)境中的低分子量PAHs，而對(duì)高分子量的PAHs去除效率極低。因此，進(jìn)一步研發(fā)高分子量PAHs高效降解菌的種質(zhì)資源，對(duì)促進(jìn)這一技術(shù)的發(fā)展具有重要意義。
發(fā)明內(nèi)容為解決高分子量PAHs的降解率低的問題，本發(fā)明的提供一種施氏假單胞菌的新菌株MT-5(Pseudomonasstutzeri)MT-5，該菌株以高分子量PAHs，如萘、菲、BAP及BGP等為唯一碳源且能對(duì)其進(jìn)行高效降解。該菌株于2009年5月7日保藏于"中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)"，保藏號(hào)為CCTCCM209101。該菌株源自長(zhǎng)期受在PAHs污染的碼頭底泥中，通過特定的培養(yǎng)方式和分離技術(shù)得到。細(xì)菌學(xué)特性革蘭氏染色陰性；細(xì)胞呈現(xiàn)直或彎曲桿狀，但不是螺旋狀，不成鏈；大小0.60.8X1.42.0ym;有極生鞭毛，能運(yùn)動(dòng)；不形成芽孢，無(wú)鞘或突起物；未觀察到聚-P羥丁酸顆粒。菌落特性圓形、邊緣不整齊、表面粗糙、隆起形狀不規(guī)則、白色、不透明。本發(fā)明還提供了施氏假單胞菌MT-5菌株在降解高分子量PAHs，BAP/BGP中的應(yīng)用，將(Pseudomonasstutzeri)MT-5菌株(CCTCCM209101)的培養(yǎng)液作用與含BAP或BGP的溶液本發(fā)明施氏假單胞菌MT-5在168h內(nèi)對(duì)BGP的降解效率達(dá)65。/。，對(duì)BAP的降解效率達(dá)59.6%，降解能力高于國(guó)內(nèi)外有關(guān)細(xì)菌對(duì)BAP/BGP降解的報(bào)道。據(jù)報(bào)道，現(xiàn)有細(xì)菌對(duì)BAP的降解率為1.4%-40%，降解時(shí)間為168h-70天；對(duì)BGP的降解效率為0-37。/。，降解時(shí)間為60h-7個(gè)月。圖lMT-5的菌落特征(反面掃描圖像)圖2菌株MT-5的菌落特征(正面掃描圖像)具體實(shí)施例方式實(shí)施例l施氏假單胞菌MT-5的制備SMS培養(yǎng)液成份(g/L)為(NH4)2S040.5，NaN030.5，CaCl20.02，MgS040.2，KH2P041.0，NaH2P04.H201.0，pH=7.5，化學(xué)試劑購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠，均為分析純。(l)富集培養(yǎng)利用底泥采樣器從中大碼頭底泥中取樣，并將底泥置于無(wú)菌采樣瓶中，送至實(shí)驗(yàn)室。4'C下保存?zhèn)溆?。取底泥樣?0g配制成20X懸浮液，以10%的接種量接種到含菲(0.05g/L)的SMS液體培養(yǎng)基中。恒溫3(TC，搖床培養(yǎng)七天。取1%菌液接入同樣培養(yǎng)基中，繼續(xù)搖床培養(yǎng)，如此反復(fù)多次，直到獲得有顯著降解性能的富集培養(yǎng)物。(2)菌株分離在獲得有顯著降解菲性能的富集培養(yǎng)物后，利用平板培養(yǎng)技術(shù)，將培養(yǎng)物接種到含有0.005g/L菲的SMS平板培養(yǎng)基中，3(TC條件下培養(yǎng)7-12天。(3)菌株純化待菌落長(zhǎng)好后，在平板上選取不同形態(tài)特征的菌落，重新轉(zhuǎn)接至含有0.005g/L菲的SMS培養(yǎng)液中，以驗(yàn)證其是否具有降解菲的能力。待培養(yǎng)液變渾濁后，重新分離、純化三次，最后將純化菌株劃線于固體培養(yǎng)基上，4"C條件下保存，用于進(jìn)一步的篩選。(4)BAP/BGP降解菌株的篩選將前述純化后的菌株，轉(zhuǎn)接至含有BAP/BGP(5g/L)的培養(yǎng)液中，進(jìn)一步篩選具有降解高分子量多環(huán)芳烴的微生物菌株。待培養(yǎng)液變渾濁后，重新分離、純化，最后將純化菌株劃線于固體培養(yǎng)基上，4。C下保存?zhèn)溆?，作為進(jìn)一步研究的目標(biāo)菌株。(5)施氏假單胞菌MT-5的鑒定1、形態(tài)觀察與生理生化試驗(yàn)根據(jù)細(xì)菌分類手冊(cè)的標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)分離到的高分子多環(huán)芳烴降降解菌株進(jìn)行了初步的形態(tài)觀察、革蘭氏染色及常規(guī)生理生化試驗(yàn)。菌株MT-5的菌落形態(tài)特征如圖1、圖2所示，生理生化試驗(yàn)，結(jié)果見表l。根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》，初步確定MT-5屬假單胞菌屬細(xì)菌。<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>2、16srRNA測(cè)序(1)模板DNA提取按TIANampBacteriaDNAKit細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)的操作步驟提取細(xì)菌基因組DNA。(2)引物采用細(xì)菌的16SrDNA通用引物上游引物F27(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')(序列2)和下游引物R1522(5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3')(序列3)。(3)PC財(cái)廣增PC財(cái)廣增體系總體積為50yL:超純水37.5yL，10XPCRBuffer5yL，2.5mmol/LdNTP4yL，10ymol/L上游弓l物lyL，10ymol/L下游弓l物l化5U/yLTaqDNAPolymerase0.5yL，模板DNA稀釋至適當(dāng)濃度(0.01nglng)后取lyL。另用lyL超純水代替模板DNA進(jìn)行空白試驗(yàn)。PCR反應(yīng)時(shí)，94.(TC變性4.5min后進(jìn)入循環(huán)94。C變性30s，60。C退火40s，72。C延伸2min。30個(gè)循環(huán)后延伸10min。采用細(xì)菌的16SrDNA通用引物，通過對(duì)供試菌株的16sRNA進(jìn)行測(cè)序，得到MT-5的16sRNA序列，MT-5的序列為1428bp。如序列1所示。由菌株長(zhǎng)1428bp的16SrRNA基因序列與Genbank中已登錄的基因序列進(jìn)行比對(duì)分析得知，該菌株與假單胞菌屬的施氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri)有99%的同源性。綜合樣品MT-5的菌落形態(tài)和生理生化特性以及16SrRNA基因序列的比對(duì)結(jié)果，鑒定菌株MT-5為施氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri)。實(shí)施例2施氏假單胞菌MT-5細(xì)菌懸液的制備將施氏假單胞菌MT-5接種于SMS培養(yǎng)液中，3CrC培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。離心收菌后，制成一定濃度的細(xì)菌懸液，懸液在600皿處的吸光度值即00600=0.68。實(shí)施例3施氏假單胞菌MT-5降解BAP/BGP的實(shí)驗(yàn)BAP、BGP均購(gòu)自美國(guó)Fisher試劑公司，純度為99%;SPME微萃取頭購(gòu)自SUPELC0(100ym)公司。實(shí)施例3-l:30。C時(shí)對(duì)BAP(9.125mg/L)的降解實(shí)驗(yàn)(1)BAP-SMS培養(yǎng)液配制與分裝將過濾滅菌的BAP溶液和經(jīng)高壓滅菌的SMS培養(yǎng)液按一定比例加入至裝有100ml的容量瓶中，定容，使培養(yǎng)液中BAP的濃度為9.125mg/L。在無(wú)菌條件下將BAP-SMS培養(yǎng)液分裝到25ml的培養(yǎng)瓶中(已滅菌)，每瓶10ml。(2)接種與培養(yǎng)在BAP-SMS培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中接種lml施氏假單胞菌MT-5懸液，用2-3層錫紙包裹培養(yǎng)瓶，并將其置于3(TC避光培養(yǎng)168h。(3)降解效果檢測(cè)利用SPME-GC-MS(固相微萃取-GC-MS)技術(shù)對(duì)培養(yǎng)168h的含菌培養(yǎng)液進(jìn)行分析，檢測(cè)溶液中BAP的濃度水平。(4)結(jié)果與分析結(jié)果表明，3(TC培養(yǎng)168h后，培養(yǎng)液中BAP濃度為3.695mg/L，即施氏假單胞菌MT-5對(duì)BAP的降解效率達(dá)59.56%。實(shí)施例3-2:15"C時(shí)對(duì)BAP(9.125mg/L)的降解實(shí)驗(yàn)(1)BAP-SMS培養(yǎng)液配制與分裝方法如實(shí)施例2-l中所述。(2)接種與培養(yǎng)在BAP-SMS培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中接種lml施氏假單胞菌MT-5懸液，用2-3層錫紙包裹培養(yǎng)瓶，并將其置于15°C避光培養(yǎng)168h。(4)降解效果檢測(cè)方法同實(shí)施例2-l(5)結(jié)果與分析結(jié)果表明，15。C培養(yǎng)168h后，培養(yǎng)液中BAP濃度為6.539mg/L，即施氏假單胞菌MT-5對(duì)BAP的降解效率達(dá)28.34%。實(shí)施例3-3:30。C時(shí)對(duì)BAP(18.25mg/L)的降解實(shí)驗(yàn)(1)BAP-SMS培養(yǎng)液配制與分裝將過濾滅菌的BAP溶液和經(jīng)高壓滅菌的SMS培養(yǎng)液按一定比例加入至裝有100ml的容量瓶中，定容，使培養(yǎng)液中BAP的濃度為18.25mg/L。在無(wú)菌條件下將BAP-SMS培養(yǎng)液分裝到25ml的培養(yǎng)瓶中(已滅菌)，每瓶10ml。(3)接種與培養(yǎng)在BAP-SMS培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中接種lml施氏假單胞菌MT-5懸液，用2-3層錫紙包裹培養(yǎng)瓶，一瓶置于3(TC條件下避光培養(yǎng)168h，另一瓶置于15。C避光培養(yǎng)168h(4)降解效果檢測(cè)。(5)結(jié)果與分析結(jié)果表明，經(jīng)168h培養(yǎng)后(3(TC條件下)，培養(yǎng)液中BAP濃度為10.705mg/L，即施氏假單胞菌MT-5對(duì)BAP的降解效率達(dá)41.37%。實(shí)施例3-4:30。C時(shí)對(duì)BGP(7.5mg/L)的降解效果(1)BAP-SMS培養(yǎng)液配制與分裝將過濾滅菌的BGP溶液和經(jīng)高壓滅菌的SMS培養(yǎng)液按一定比例加入至裝有100ml的容量瓶中，定容，使培養(yǎng)液中BGP的濃度為7.5mg/L。在無(wú)菌條件下將BAP-SMS培養(yǎng)液分裝到25ml的培養(yǎng)瓶中(已滅菌)，每瓶10ml。(2)接種與培養(yǎng)接種lml施氏假單胞菌MT-5懸液(0D600=0.68)至分裝有BGP-SMS培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中后，用2-3層錫紙包裹培養(yǎng)瓶，并將其置于3(TC條件下避光培養(yǎng)168h。(4)降解效果檢測(cè)利用SPME-GC-MS(固相微萃取-GC-MS)技術(shù)對(duì)培養(yǎng)168h的含菌培養(yǎng)液進(jìn)行分析，檢測(cè)溶液中BGP的濃度水平。(5)結(jié)果與分析結(jié)果表明，經(jīng)168h培養(yǎng)后(3(TC條件下)，培養(yǎng)液中BGP濃度為2.618mg/L，即施氏假單胞菌MT-5對(duì)BAP的降解效率達(dá)65.09%。實(shí)施案例3-5:(3(TC條件下對(duì)BGP(15mg/L)的降解效果)(1)BAP-SMS培養(yǎng)液配制與分裝將過濾滅菌的BGP溶液和經(jīng)高壓滅菌的SMS培養(yǎng)液按一定比例加入至裝有100ml的容量瓶中，定容，使培養(yǎng)液中BGP的濃度為15mg/L。在無(wú)菌條件下將BAP-SMS培養(yǎng)液分裝到25ml的培養(yǎng)瓶中(已滅菌)，每瓶10ml。(2)接種與培養(yǎng)接種lml施氏假單胞菌MT-5懸液(OD600=0.68)至分裝有BGP-SMS培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中后，用2-3層錫紙包裹培養(yǎng)瓶，并將其置于3(TC條件下避光培養(yǎng)168h。(3)降解效果檢測(cè)利用SPME-GC-MS(固相微萃取-GC-MS)技術(shù)對(duì)培養(yǎng)168h的含菌培養(yǎng)液進(jìn)行分析，檢測(cè)溶液中BGP的濃度水平。(4)結(jié)果與分析結(jié)果表明，經(jīng)168h培養(yǎng)后(3(TC條件下)，培養(yǎng)液中BGP濃度為9.746mg/L，即施氏假單胞菌MT-5對(duì)BAP的降解效率達(dá)35.03%。SEQUENCELISTING〈110>環(huán)境保護(hù)部華南環(huán)境科學(xué)研究所〈120>—種施氏假單胞菌菌株及其在降解高分子量多環(huán)芳烴中的應(yīng)用〈130>None〈160>3〈170>Patentlnversion3.5〈210>1〈211>1428〈212>DNA〈213>PseudomonasstutzeriMT-5〈400>1gcagtcgagcggcagcgggtccttcgggatgccggcgagcggcggacgggtgagtaatgcctaggaatctgcctggtagtgggggataactcggggaaactcgagctaataccgcatacg120tcctacgggagaaagcgggggatcttcggacctcgcgctaccagatgagcctaggtcgga180ttagctagttggtgaggtaaaggctcaccaaggcgacgatccgtagctggtctgagagga240tgatcagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtgggga300atattggacaatgggcgaaagcctgatccagccatgccgcgtgtgtgaagaaggtcttcg360gattgtaaagcactttaagttgggaggaaggacagtaagttaataccttgctgttttgac420gttaccgacagaataagcaccggctaacttcgtgccagcagccgcggtaatacgaagggt480gcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcgcgtaggtggtttgataagttggat540gtgaaagccccgggctcaacctgggaattgcatccaaaactgtctgactagagtatggca600gagggtggtggaatttcctgtgtagcggtgaaatgcgtagatataggaaggaacaccagt660ggcgaaggcgaccacctgggctaatactgacactgaggtgcgaaagcgtggggagcaaac720aggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtcgactagccgttgggatcctt了80gagatcttagtggcgcagctaacgcattaagtcgaccgcctggggagtacggccgcaagg840ttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcg900aagcaacgcgaagaaccttaccaggccttgacatgcagagaactttccagagatggattg%0gtgccttcgggaactctgacacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagat1020gttgggtt肌gtcccgt肌cgagcgc肌cccttgtccttagttaccagcacgtt肌ggtg1080ggcactctaaggagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcat1140catggcccttacggcctgggctacacacgtgctacaatggtcggtacaaagggttgccaa1200gccgcgaggtggagctaatcccataaaaccgatcgtagtccggatcgcagtctgcaactc1260gactgcgtgaagtcggaatcgctagtaatcgtgaatcagaatgtcacggtgaatacgttc1320ccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgctccagaagtagctag1380tctaaccttcggggggacggttaccacggagtgattcatgactggggt1428〈210>2〈211>20〈212>DNA〈213>人工序列〈400>2agagtttgatcctggctcag20〈210>3〈211>20〈212>DNA〈213>人工序列〈400>3aaggaggtgatccagccgca20權(quán)利要求1.一種施氏假單胞菌菌株(Pseudomonasstutzeri)MT-5CCTCCM209101，該菌株的細(xì)菌學(xué)特性為革蘭氏染色陰性；細(xì)胞呈現(xiàn)直或彎曲桿狀，但不是螺旋狀，不成鏈；大小0.6～0.8×1.4～2.0μm；有極生鞭毛，能運(yùn)動(dòng)；不形成芽孢，無(wú)鞘或突起物；未觀察到聚-β羥丁酸顆粒。菌落特性為圓形、邊緣不整齊、表面粗糙、隆起形狀不規(guī)則、白色、不透明。2.權(quán)利要求l所述一種施氏假單胞菌MT-5菌株在降解高分子量多環(huán)芳烴中的應(yīng)用。3.權(quán)利要求2所述應(yīng)用，其特征在于所述高分子量環(huán)芳烴為BAP、BGP。全文摘要本發(fā)明涉及一種細(xì)菌的新菌株及該菌株在降解高分子多環(huán)芳烴的應(yīng)用。該菌株被鑒定并命名為施氏假單胞菌MT-5菌株，細(xì)菌學(xué)特性革蘭氏染色陰性；細(xì)胞呈現(xiàn)直或彎曲桿狀，但不是螺旋狀，不成鏈；大小0.6～0.8×1.4～2.0μm；有極生鞭毛，能運(yùn)動(dòng)；不形成芽孢，無(wú)鞘或突起物；未觀察到聚-β羥丁酸顆粒，菌落圓形、邊緣不整齊、表面粗糙、隆起形狀不規(guī)則、白色、不透明。施氏假單胞菌MT-5菌株在降解高分子量PAHs，BAP/BGP中的應(yīng)用，本發(fā)明施氏假單胞菌MT-5在168h內(nèi)對(duì)BGP的降解效率達(dá)65％，對(duì)BAP的降解效率達(dá)59.6％，降解能力高于國(guó)內(nèi)外有關(guān)細(xì)菌對(duì)BAP/BGP降解的報(bào)道。文檔編號(hào)C12R1/38GK101603022SQ20091030304公開日2009年12月16日申請(qǐng)日期2009年6月8日優(yōu)先權(quán)日2009年6月8日發(fā)明者徐亞幸,芳朱,李開明,鄭政偉申請(qǐng)人:環(huán)境保護(hù)部華南環(huán)境科學(xué)研究所