專利名稱：：一株枯草芽孢桿菌及其在合成亞氨基二乙酸中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物化工領(lǐng)域，涉及一株新菌株——枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)KR2，以及該菌株在生物催化法合成亞氨基二乙酸中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：亞氨基二乙腈NH(CH^N)2，易溶于丙酮等有機(jī)溶劑，主要用于合成除草劑草甘膦。另外，作為一種重要的精細(xì)化工中間體，在染料、電鍍、水處理、合成樹脂等領(lǐng)域也有一定的應(yīng)用。亞氨基二乙酸NH(CH2C00H)2，比重1.56，溶于水，難溶于醇、丙酮和乙醚，熔點(diǎn)247.5°C(分解)，與酸堿生成鹽，還和多種金屬形成蟄合物。亞氨基二乙酸又名氨乙二酸，簡(jiǎn)稱IDA，是一種重要的精細(xì)化工產(chǎn)品，主要用于草甘膦等農(nóng)藥的制造，離子交換樹脂的原料及橡膠、電鍍等方面。目前亞氨基二乙酸主要采用化學(xué)法進(jìn)行生產(chǎn)，主要方法有亞氨基二乙腈水解法、氯乙酸法、二乙醇胺脫氫氧化法、氫氰酸法等。在其眾多的合成方法中，綜合考慮各方法的工藝收率、原料成本和經(jīng)濟(jì)效益，亞氨基二乙腈水解法最具有競(jìng)爭(zhēng)力，將逐漸成為國內(nèi)合成亞氨基二乙酸的主導(dǎo)工藝。目前亞氨基二乙腈水解法主要采用化學(xué)水解法，其工藝大致是在催化劑作用下，用強(qiáng)堿將亞氨基二乙腈水解后再經(jīng)過酸化處理制得亞氨基二乙酸，其工藝反應(yīng)原理如下/CH2CN,,/CH2COONaH;CN十2謹(jǐn)+叫—+羅3wCH2COONa—<CH2COOH+，^賊CH2COONa十CH2COOH化學(xué)水解法雖然是目前的主流工藝，但是本路線中需要消耗大量的強(qiáng)酸和強(qiáng)堿，同時(shí)需要高溫、高壓等反應(yīng)條件，副產(chǎn)物多，產(chǎn)量低，廢水量大，環(huán)境污染嚴(yán)重。近期也有利用生物催化法合成亞氨基二乙酸的報(bào)道，但均為在水相中反應(yīng)，雖然克服了化學(xué)法的眾多不足，但也存在底物溶解度低導(dǎo)致的傳質(zhì)效果差，產(chǎn)物濃度低，底物和產(chǎn)物分離難，裝置利用率不高，難于工業(yè)化等不利因素。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是為克服以上技術(shù)的局限，提供一株新的芽孢桿菌(Bacillussubtilis)KR2，本發(fā)明的另一目的是提供該細(xì)菌在生物催化法合成亞氨基二乙酸中的應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案是本發(fā)明所涉及的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)KR2(CGMCCNo.3242)是本公3司生物化工研究組成員從受腈類化合物污染達(dá)15年以上的的農(nóng)藥廠土壤中篩選得到。枯草芽孢桿菌KR2(CGMCCNo.3242)具有以下微生物學(xué)特征1.形態(tài)學(xué)特征在固體平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)48小時(shí)后出現(xiàn)圓形光滑的單菌落，灰白色，不透明，表面濕潤(rùn)，邊緣光滑，整個(gè)菌落凸起，易挑??；鏡檢成桿狀，大小長(zhǎng)為(0.50.8um)X(1.52.5um)，芽孢中生。2.培養(yǎng)學(xué)特征本菌在以下3種培養(yǎng)基中3(TC下培養(yǎng)4896小時(shí)后的培養(yǎng)特征見表1。表1枯草芽孢桿菌KR2(CGMCCNo.3242)在3種培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征培養(yǎng)基名稱菌落顏色及形狀營養(yǎng)瓊脂菌落凸起，表面濕潤(rùn)，邊緣光滑，不透明，呈乳白色至灰白色，無可溶性色素營養(yǎng)肉湯生長(zhǎng)旺盛，灰黃色，渾濁蛋白胨査氏瓊脂菌落平坦而厚，表面濕潤(rùn)，邊緣光滑，不透明，灰黃色，無可溶性色素3.生理生化特征表2枯草芽孢桿菌KR2(CGMCCNo.3242)生理生化性質(zhì)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>斜面培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖1030，酵母膏210，蛋白胨210，氯化鈉15，磷酸二氫鉀0.53，磷酸氫二鉀0.53，硫酸鎂0.22，瓊脂1520，pH:59，121。C滅菌20min?！?jí)、二級(jí)液體種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖1030，酵母膏210，蛋白胨2IO，氯化鈉15，磷酸二氫鉀0.53，磷酸氫二鉀0.53，硫酸鎂0.22，己內(nèi)酰胺0.5IO，異戊月青:0.15，氯化鈷:550卯m，pH:59，121。C滅菌20min。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖1050，酵母膏210，蛋白胨210，氯化鈉15，磷酸二氫鉀0.53，磷酸氫二鉀0.53，硫酸鎂0.22，己內(nèi)酰胺0.510，異戊腈0.15，氯化鈷550ppm，pH:59?？莶菅挎邨U菌(Bacillussubtilis)KR2(CGMCCNO.3242)在生物催化法合成亞氨基二乙酸中的應(yīng)用。所述的枯草芽孢桿菌KR2(CGMCCNO.3242)在生物催化法合成亞氨基二乙酸中應(yīng)用的具體方法是在水-水溶性有機(jī)溶劑組成的均相溶劑體系中，以亞氨基二乙腈為底物，以枯草芽孢桿菌KR2(CGMCCNO.3242)為生物催化劑，于溫度為535°C，100300rpm攪拌轉(zhuǎn)速下反應(yīng)1550小時(shí)得到亞氨基二乙酸。所述的生物催化反應(yīng)一般在攪拌釜中進(jìn)行，裝液量為攪拌釜體積的5070%(%:v/v)。反應(yīng)體系的溶劑系統(tǒng)為水-水溶性有機(jī)溶劑組成的均相系統(tǒng)，水與水溶性有機(jī)溶劑的體積比例為5:130:1，該水溶性溶劑可以為甲醇、乙醇、丙酮、二氧六環(huán)、甘油，優(yōu)選水_丙酮作為該均相體系。所述的枯草芽孢桿菌KR2(CGMCCNO.3242)制備成絮凝細(xì)胞作為生物催化劑進(jìn)行所述的生物催化反應(yīng)，反應(yīng)體系中絮凝細(xì)胞液的加入量為總反應(yīng)液體積的515%(%:v/v)。所述的亞氨基二乙腈的起始添加量為裝液量的0.55%(%:g/100mL)，采用分批補(bǔ)加的方式添加亞氨基二乙腈，亞氨基二乙腈的最終累積濃度不超過30%(%:g/100mL)。在溫度為535。C，攪拌轉(zhuǎn)速為100300rpm下催化水解1550小時(shí)。其中，絮凝細(xì)胞液的制備方法為將發(fā)酵罐內(nèi)的發(fā)酵液25003500rpm離心10分鐘，棄上清，所得沉淀用去離子水沖洗一遍后同樣轉(zhuǎn)速下繼續(xù)離心10分鐘，得沉淀濕菌體。或直接將發(fā)酵液用0.20.5um膜超濾后得濕菌體。將所得的濕菌體用去離子水沖洗下來后攪勻制得濕菌體濃度為1200g/L的菌懸液。向菌懸液中0.115%。(％。g/1000mL)的絮凝劑，優(yōu)選添加量為0.51.5%。(％。:g/1000mL)，在溫度為535°C，pH為48下，200500rpm攪拌10min即制得分散均勻的絮凝細(xì)胞液。該絮凝劑選自殼聚糖，甲殼素，聚谷氨酸，聚丙烯酸，聚丙烯酰胺，聚乙烯亞胺等高分子絮凝劑中的一種或幾種的組合，優(yōu)選殼聚糖。反應(yīng)結(jié)束后向轉(zhuǎn)化液中重新添加0.10.5%。(％。g/1000mL)的絮凝劑，攪勻，靜置1030min后過濾出絮凝菌團(tuán)，濾液經(jīng)25003500rpm離心或用0.20.5um膜超濾后，在508(TC以下先蒸餾、濃縮，后于4t:下冷凍結(jié)晶，可得到純度在96%以上的亞氨基二乙酸，亞氨基二乙腈的轉(zhuǎn)化率超過98%。蒸餾出的水溶性有機(jī)相和過濾出的絮凝菌團(tuán)均可套用到下批反應(yīng)中去。本發(fā)明中所涉及的過濾、蒸餾、濃縮、冷凍結(jié)晶均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的普通技術(shù)。本發(fā)明的有益效果1、本發(fā)明所提供的枯草芽孢桿菌KR2(CGMCCNO.3242)對(duì)有機(jī)溶劑的耐受性強(qiáng)，適用于含有機(jī)溶劑的生物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)；該菌用作亞氨基二乙腈生產(chǎn)亞氨基二乙酸的生物催化劑，亞氨基二乙酸的收率達(dá)90%以上。2、通常情況下細(xì)胞酶活的半衰期隨溫度的升高呈現(xiàn)遞減趨勢(shì)，為維持酶活的穩(wěn)定性，工業(yè)上一般采用低溫生物催化。亞氨基二乙腈在水中的溶解度小，25t:時(shí)在水中的溶解度僅為67克，現(xiàn)有技術(shù)采用單獨(dú)水相中低溫生物催化時(shí)，添加高濃度的底物亞氨基二乙腈易析出，不利于轉(zhuǎn)化的進(jìn)行。由于亞氨基二乙腈易溶于丙酮等有機(jī)溶劑，且低溫環(huán)境可有效防止系統(tǒng)中丙酮的揮發(fā)，本發(fā)明采用水-水溶性有機(jī)溶劑組成的均相系統(tǒng)作為生物催化合成亞氨基二乙酸的溶劑，能顯著提高底物在低溫反應(yīng)系統(tǒng)中的溶解度，有利于獲得較高的產(chǎn)物濃度，亞氨基二乙酸的收率達(dá)90%以上，產(chǎn)物純度大于96%，較現(xiàn)有技術(shù)更具工業(yè)價(jià)值。3、采用安全性高的絮凝劑對(duì)細(xì)胞絮凝化處理后進(jìn)行催化，分離過程簡(jiǎn)單易于操作，產(chǎn)品純度高，絮凝劑的使用有效的保護(hù)了細(xì)胞免受高濃度底物和溶劑的毒害作用，有利于工業(yè)化放大生產(chǎn)。4、產(chǎn)品分離純化階段回收的有機(jī)溶劑和絮凝細(xì)胞可套用到下一批反應(yīng)，節(jié)約成本的同時(shí)避免了有機(jī)溶劑對(duì)環(huán)境的污染。5、生物催化法生產(chǎn)亞氨基二乙酸較之化學(xué)法具有反應(yīng)過程廢水產(chǎn)量少，污染少，反應(yīng)條件溫和、能耗低；產(chǎn)品成本低，收率高，易于工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)。涉及的生物材料樣品的保藏本發(fā)明所要求保護(hù)的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)KR2保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)大屯路中國科學(xué)院微生物研究所，保藏號(hào)為CGMCCNO.3242，保藏日期為2009年8月19日。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1菌種篩選本發(fā)明中菌種的篩選方法如下從南京第一農(nóng)藥廠污水池不同角度取污泥樣100余批，分批富集培養(yǎng)后進(jìn)行篩選和鑒定稱取10克污泥，加無菌水50mL，用玻璃珠搖碎后取5mL懸濁液接種到45mL富集培養(yǎng)基中，放置3(TC搖床上，120rpm振蕩培養(yǎng)3天。之后取該培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋，取10一6、10—7、10—8的梯度稀釋液涂布到含初篩固體培養(yǎng)基的平板上，置3(TC恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)36天。挑取生長(zhǎng)出的單菌落接種到新的初篩固體培養(yǎng)基上擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同上。待菌長(zhǎng)出后刮取35環(huán)接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。在3(TC搖床上120rpm下振蕩培養(yǎng)3天，取15mL培養(yǎng)液3000rpm下離心10min，倒去上清液后用等體積的生理鹽水沖洗沉淀菌體，繼續(xù)離心得菌體。將所得菌體添加到含1%(%:g/100mL)亞氨基二乙腈的PBS緩沖液中轉(zhuǎn)化2小時(shí)，反應(yīng)體系中菌體濃度為0.5g/L。取5mL轉(zhuǎn)化液3000rpm下離心10min得上清液，HPLC法分析上清液。如果轉(zhuǎn)化液含有亞氨基二乙酸則說明該菌對(duì)亞氨基二乙腈具有轉(zhuǎn)化能力，選擇其中亞氨基二乙酸轉(zhuǎn)化率最高的一株，按《簡(jiǎn)明伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》第八版進(jìn)行鑒定為枯草芽孢桿菌。將該株枯草芽孢桿菌命名為KR2，保藏于中國微生物保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏號(hào)CGMCCNO.3242，保藏日期為2009年8月19日。本發(fā)明中的枯草芽孢桿菌KR2(CGMCCNO.3242)能同時(shí)在分別以丙烯腈、煙腈、乳腈、羥基乙腈，亞氨基二乙腈為唯一氮源的固體初篩培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，底物范圍廣，降解腈類化合物能力強(qiáng)，適合用作本發(fā)明中亞氨基二乙酸的生物催化合成。篩選方法中的所述的液體富集培養(yǎng)基、固體初篩培養(yǎng)基、液體復(fù)篩培養(yǎng)基分別如下富集培養(yǎng)基(g/100mL):葡萄糖3，酵母膏0.5，蛋白胨0.5，氯化鈉0.l，磷酸二氫鉀0.l，磷酸氫二鉀0.l，硫酸鎂0.05，pH:7，121。C滅菌20min。固體初篩培養(yǎng)基(g/100mL):葡萄糖3，亞氨基二乙腈(或丙烯腈、或煙腈、或乳腈、或羥基乙腈)l，氯化鈉0.l，磷酸二氫鉀0.l，磷酸氫二鉀0.l，硫酸鎂0.05，瓊脂2，pH:7，121。C滅菌20min。液體發(fā)酵培養(yǎng)基(g/100mL):葡萄糖3，酵母膏0.5，蛋白胨0.5，氯化鈉0.1，磷酸二氫鉀0.l，磷酸氫二鉀0.l，硫酸鎂0.05，尿素0.5，pH:7，121。C滅菌20min。實(shí)施例2游離細(xì)胞的制備在無菌超凈工作臺(tái)內(nèi)用接種環(huán)刮取枯草芽孢桿菌KR2(CGMCCNo.3242)斜面菌種3環(huán)，接種到一級(jí)液體種子培養(yǎng)基中(葡萄糖15，酵母膏5，蛋白胨5，氯化鈉2，磷酸二氫鉀l，磷酸氫二鉀l，硫酸鎂0.5，異戊腈0.15，己內(nèi)酰胺5，氯化鈷10卯m，pH:7.O，單位g/L)。在溫度為25t:，轉(zhuǎn)速為150rpm下振蕩培養(yǎng)48小時(shí)即可得一級(jí)枯草芽孢桿菌KR2(CGMCCNo.3242)種子液，將該一級(jí)種子液按照10%的接種量轉(zhuǎn)接到裝有同樣成分已滅菌的培養(yǎng)基中繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，48小時(shí)后可得枯草芽孢桿菌KR2(CGMCCNo.3242)二級(jí)種子液。將枯草芽孢桿菌KR2(CGMCCNo.3242)二級(jí)種子液按照10%的接種量接種到35L已滅菌的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，(葡萄糖30，酵母膏10，蛋白胨10，氯化鈉2，磷酸二氫鉀l，磷酸氫二鉀l，硫酸鎂0.5，異戊腈0.15，己內(nèi)酰胺5，氯化鈷10卯m，pH:7，單位g/U，發(fā)酵罐體積為50L，采用通空氣與攪拌聯(lián)用的方式控制溶氧不低于10%，通氣量0.2v/v.min，罐壓0.03MPa，溫度25。C，起始轉(zhuǎn)速100rpm，發(fā)酵過程中根據(jù)發(fā)酵液的溶氧水平有步驟的調(diào)節(jié)，最大轉(zhuǎn)速不超過400rpm，發(fā)酵72小時(shí)后即可制得枯草芽孢桿菌KR2(CGMCCNO.3242)細(xì)胞發(fā)酵液。實(shí)施例3酶活測(cè)定本實(shí)施例采用枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)CGMCCNO.3242的發(fā)酵液進(jìn)行酶活的測(cè)定。酶活的定義在25°CT，lmL發(fā)酵液與1微克亞氨基二乙腈催化反應(yīng)1小時(shí)后生成的亞氨基二乙酸的微克數(shù)，該微克數(shù)即為總酶活力單位數(shù)。亞氨基二乙酸采用液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)參數(shù)為SpherisorbSAX強(qiáng)陰離子交換柱，150mmX4.6mmI.D;流動(dòng)相0.005mol/L的磷酸二氫鉀緩沖液(pH2.5);流速1.OmL/min;柱溫室溫；檢測(cè)波長(zhǎng)UV210nm。在本發(fā)明條件下，每毫升發(fā)酵液中生物量最高可達(dá)47mg濕菌體，總酶活最高可達(dá)560U。實(shí)施例4絮凝細(xì)胞液的制備取3L枯草芽孢桿菌KR2(CGMCCNO.3242)發(fā)酵液3000rpm離心10min得沉淀細(xì)胞，用3L去離子水沖洗一遍后3000rpm下繼續(xù)離心10min，棄上清得沉淀濕菌體。枯草芽孢桿菌KR2(CGMCCNO.3242)沉淀濕菌體稱重后用去離子水將其沖洗下來制得濃度為35g/L的菌懸液。30。C下調(diào)菌懸液pH為6，向菌懸液中添加0.6%。(％。:g/1000mL)的殼聚糖，200rpm下攪拌10min即可制得枯草芽孢桿菌KR2(CGMCCNO.3242)絮凝化細(xì)胞液。實(shí)施例5均相體系下的催化反應(yīng)與產(chǎn)物分離在50L攪拌釜中，先添加27L去離子水和3L制備好的絮凝細(xì)胞液，調(diào)pH到7.0，反應(yīng)溫度為1(TC，攪拌均勻后向其中添加5L丙酮。將3千克純度為97%的亞氨基二乙腈采用多次間隙補(bǔ)加的方式進(jìn)行添加，每次1千克，每隔10小時(shí)一次，分3批添加進(jìn)反應(yīng)釜中，反應(yīng)40小時(shí)后檢測(cè)轉(zhuǎn)化液中底物亞氨基二乙腈的濃度為0.08%(%:g/100mL)。向上述催化反應(yīng)結(jié)束后的釜中重新添加0.2%。(％。g/1000mL)的殼聚糖，攪拌10min后靜置半小時(shí)后下料。將反應(yīng)液放出后壓濾，所得菌團(tuán)可繼續(xù)套用到下批反應(yīng)中。濾液先經(jīng)0.45um超濾膜過濾后再7(TC蒸餾出丙酮，濃縮后于4t:冷凍結(jié)晶得純度為98.6%的亞氨基二乙酸3.856kg，產(chǎn)物收率達(dá)93.4%。實(shí)施例6本實(shí)施例將反應(yīng)釜中的反應(yīng)溫度控制在25t:，其余反應(yīng)條件和操作方式均與實(shí)施例5保持一致。結(jié)果是在35小時(shí)后檢測(cè)到轉(zhuǎn)化液中底物亞氨基二乙腈的濃度為0.091%(%:g/100mL)。放料后以同樣方式精制亞氨基二乙酸，最終得純度為98.3%的亞氨基二乙酸3.796kg，收率達(dá)91.7%。實(shí)施例7本實(shí)施例操作方法、設(shè)備及其他工藝參數(shù)都與實(shí)施例5保持一致，不同之處在于添加亞氨基二乙腈的起始濃度不同，即將3千克純度為97%以上的亞氨基二乙腈每隔3小時(shí)補(bǔ)加一次，分10次完成，每次300克。反應(yīng)結(jié)束后按同樣的方法進(jìn)行產(chǎn)物分離，得到純度為99.2%的亞氨基二乙酸3.742千克，收率達(dá)91.2%。實(shí)施例8本實(shí)施例操作方法、設(shè)備及其他工藝參數(shù)都與實(shí)施例3保持一致，不同之處在于最終反應(yīng)系統(tǒng)中水與水溶性有機(jī)溶劑的比例不同。實(shí)施例5中水-水溶性有機(jī)溶劑的最終比例關(guān)系為(27+3):5，相當(dāng)于6:1。本實(shí)施例最終反應(yīng)系統(tǒng)中水-水溶性溶劑比例關(guān)系為(27+3):2，即反應(yīng)系統(tǒng)中添加丙酮的量由5L改為2L。反應(yīng)結(jié)束后按同樣的方法進(jìn)行產(chǎn)物分離，得到純度為98.8%的亞氨基二乙酸3.717千克，收率達(dá)90.2%。實(shí)施例9本實(shí)施例主要考查枯草芽孢桿菌KR2(CGMCCNO.3242)的遺傳穩(wěn)定性。將4t:冰箱中保藏的該枯草芽孢桿菌KR2(CGMCCNO.3242)放置3(TC恒溫培養(yǎng)箱中活化20分鐘后取出接種到新鮮的斜面培養(yǎng)基中，之后放置3(TC恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3天，待斜面上長(zhǎng)出新的劃線菌落后即為該枯草芽孢桿菌的子一代，命名為KR2-1;之后以KR2-1為出發(fā)菌種，以同樣的方式進(jìn)行接種傳代，培養(yǎng)出新劃線菌落后命名為子二代KR2-2;再以KR2-2為出發(fā)菌種，以同樣的方式轉(zhuǎn)接新斜面培養(yǎng)基，得子三代KR2-3。以此方式連續(xù)傳代30次，分別得到KR2-4、KR2-5......KR2-30。斜面培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖15，酵母膏5，蛋白胨2，氯化鈉l，磷酸二氫鉀0.5，磷酸氫二鉀0.5，硫酸鎂0.5，瓊脂20，pH:7。挑選以上傳代培養(yǎng)中所得到KR2-10、KR2-20、KR2-30三株子代，以原始KR2(CGMCCNO.3242)為對(duì)照，同時(shí)進(jìn)行一級(jí)液體種子、二級(jí)液體種子的制備，操作方法和培養(yǎng)基均與實(shí)施例1中相同。之后進(jìn)行游離細(xì)胞的制備，將所得的二級(jí)液體種子以10%的接種量接種到裝有已滅菌發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中，每500mL容量的搖瓶最終裝液量為lOOmL，接完種之后放置溫度為25t:的恒溫?fù)u床上振蕩培養(yǎng)3天，轉(zhuǎn)速為150rpm。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基與實(shí)施例1中相同。將以上所得的液體發(fā)酵液于3000rpm下冷凍離心10分鐘，棄上清液后用等體積的去離子水沖洗沉淀菌體一遍后繼續(xù)離心10分鐘等菌體，轉(zhuǎn)速不變。將所得的沉淀菌體用pH為7的去離子水制成35g/L的菌懸液后進(jìn)行轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。轉(zhuǎn)化試驗(yàn)在恒溫?fù)u床上進(jìn)行，轉(zhuǎn)化液置于搖瓶?jī)?nèi)，每500mL搖瓶最終裝轉(zhuǎn)化液的體積為100mL。底物亞氨基二乙腈的濃度為2%(X:g/100mL)，菌懸液的添加量為5%，轉(zhuǎn)化溫度為25°C，搖床轉(zhuǎn)速200rpm，轉(zhuǎn)化時(shí)間為10分鐘。轉(zhuǎn)化結(jié)束后添加5mol/L的鹽酸中止酶活，之后將轉(zhuǎn)化液3000rpm離心10分鐘后取上清液檢測(cè)。KR2、KR2-10、KR2-20、KR2-30四株菌所對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)化液中亞氨基二乙酸的濃度分別為2.38%、2.37%、2.32%、2.25%(%:g/100mL)。以上結(jié)果可見，該枯草芽孢桿菌KR2(CGMCCNO.3242)在傳代30次后仍然保持與親代KR2菌幾乎相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)化率，具有很好的遺傳穩(wěn)定性。實(shí)施例10本實(shí)施例主要進(jìn)行絮凝細(xì)胞套用的考察，其游離細(xì)胞的制備、絮凝細(xì)胞的制備、均相體系下的催化反應(yīng)方法都分別與實(shí)施例2、實(shí)施例4和實(shí)施例5保持一致。不同之處在于將第一批轉(zhuǎn)化反應(yīng)結(jié)束后的絮凝細(xì)胞菌團(tuán)過濾出來，用等量的去離子水沖洗兩遍，過濾后向絮凝細(xì)胞團(tuán)中添加去離子水，使絮凝細(xì)胞混合液的體積達(dá)到3L，將此3L絮凝細(xì)胞液套用到下一批轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中繼續(xù)反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后以同樣的方式繼續(xù)制備相同體積的絮凝細(xì)胞液，再連續(xù)套用6次。其中轉(zhuǎn)化液中底物亞氨基二乙腈的添加量與添加方式均與實(shí)施例3中相同，最終數(shù)據(jù)如表3所示。結(jié)果顯示，該絮凝細(xì)胞在循環(huán)套用到第4次時(shí)亞氨基二乙酸的收率和純度都出現(xiàn)明顯下降。套用3次時(shí)亞氨基二乙酸的收率達(dá)到90.0%，純度仍然保持在98%以上。因此，本專利中所述的絮凝細(xì)胞菌團(tuán)以套用3次為佳。表3絮凝細(xì)胞循環(huán)套用后的轉(zhuǎn)化數(shù)據(jù)套用次數(shù)亞氨基二乙酸的量(kg)收率純度o(起始)3.86194.0%99.1%13.84593.0%98.4%23.83493.6%99.4%33.71790.0%98.6%43.48782.9%96.8%10<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>本發(fā)明未涉及部分均與現(xiàn)有技術(shù)相同或可采用現(xiàn)有技術(shù)加以實(shí)現(xiàn)。1權(quán)利要求一種枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)KR2，保藏于中國微生物保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)CGMCCNo.3242。2.權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌KR2(CGMCCNo.3242)在生物催化法合成亞氨基二乙酸中的應(yīng)用。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用的具體方法為在水_水溶性有機(jī)溶劑組成的均相溶劑體系中，以亞氨基二乙腈為底物，以枯草芽孢桿菌KR2(CGMCCNO.3242)為生物催化劑，于溫度為535°C，攪拌轉(zhuǎn)速為100300rpm下催化反應(yīng)得到亞氨基二乙酸。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的枯草芽孢桿菌KR2(CGMCCNO.3242)制備成絮凝細(xì)胞液參與反應(yīng)，反應(yīng)體系中絮凝細(xì)胞液的加入量為總反應(yīng)液體積的515%。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于制備所述的絮凝細(xì)胞液所用的絮凝劑是殼聚糖、甲殼素、聚谷氨酸、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺或聚乙烯亞胺中的一種或幾種的組合，優(yōu)選殼聚糖，絮凝劑添加量為0.115%0。6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的水_水溶性有機(jī)溶劑組成的均相溶劑體系中水相與水溶性有機(jī)溶劑的體積比為5:130:1。7.根據(jù)權(quán)利要求3或6所述的應(yīng)用，其特征在于所述的水溶性有機(jī)溶劑為甲醇、乙醇、丙酮、二氧六環(huán)或甘油，優(yōu)選丙酮。8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的反應(yīng)體系中底物亞氨基二乙腈的起始添加量為裝液量的0.55%，采用間隙多次補(bǔ)加的方式使亞氨基二乙腈的累積濃度不超過30%。9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述生物催化反應(yīng)結(jié)束后向轉(zhuǎn)化液中重新添加0.10.5%。的絮凝劑，攪拌均勻后靜置，過濾出菌團(tuán)，濾液經(jīng)25003500rpm離心或用0.20.5咖膜超濾后，再經(jīng)蒸餾、濃縮、冷凍結(jié)晶即得純度在96%以上的亞氨基二乙酸。全文摘要本發(fā)明屬于生物化工領(lǐng)域，公布了一株枯草芽孢桿菌及其在合成亞氨基二乙酸中的應(yīng)用。應(yīng)用的具體方法為在水-水溶性溶劑組成的均相溶劑體系中，以亞氨基二乙腈為底物，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)KR2(CGMCCNO.3242)的絮凝細(xì)胞液為生物催化劑，于溫度為5～35℃，攪拌轉(zhuǎn)速為100～300rpm下反應(yīng)15～50小時(shí)得到亞氨基二乙酸。本發(fā)明工藝最終產(chǎn)物純度超過96％，收率達(dá)90.0％以上。本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫和，廢水量少，工藝適合規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)應(yīng)用。文檔編號(hào)C12R1/125GK101768561SQ20091026430公開日2010年7月7日申請(qǐng)日期2009年12月18日優(yōu)先權(quán)日2009年12月18日發(fā)明者劉善和,孔國平,楊壽海,王紅明,葛九敢申請(qǐng)人:南京第一農(nóng)藥集團(tuán)有限公司