專利名稱：一株枯草芽孢桿菌及其在生物催化生產(chǎn)l-乳酸中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物化工領(lǐng)域，涉及一株枯草芽孢桿菌及其在生物催化生產(chǎn)L-乳酸中的應(yīng)用。 乳酸(Lactic Acid，LA)，又名a-羥基丙酸，分子式為CH3CH(0H) C00H，是一種天然有機(jī)酸，為三大有機(jī)酸之一。乳酸分子中含有一個不對稱碳原子，故具有旋光異構(gòu)性，左旋的稱為L-乳酸，右旋的稱為D-乳酸，兩者混合的則稱為D，L-乳酸。其中只有L-乳酸能被人體所吸收和代謝，具有良好的生物活性。隨著環(huán)保意識的加強(qiáng)，世界對生物可降解塑料的需求越來越大，由L-乳酸單體加工生產(chǎn)得到的聚合物(聚乳酸)是當(dāng)前最具有前途的高分子材料之一，它既具有聚苯乙烯相似的光澤度、透明性和加工性能，又具有良好的生物降解性能，需求量巨大，剌激了 L-乳酸的需求增長。我國的L-乳酸只占乳酸產(chǎn)量的2 5% ，且每年需要進(jìn)口數(shù)萬噸優(yōu)質(zhì)的L-乳酸，可見該產(chǎn)品的市場發(fā)展前景廣闊，頗具開發(fā)潛力。
目前乳酸的生產(chǎn)主要有化學(xué)合成法和生物發(fā)酵法。化學(xué)合成法生產(chǎn)乳酸可通過多種途徑進(jìn)行，其中具有現(xiàn)實(shí)意義的是乳腈法。該法是乙醛與氫氰酸經(jīng)堿性催化劑作用生成乳腈，再經(jīng)過酯化，蒸餾后用酸水解制得乳酸。該法副產(chǎn)物較多，產(chǎn)品主要是D， L-乳酸，需要經(jīng)過昂貴的化學(xué)試劑拆分才能制得具有光學(xué)活性的L-乳酸，純度偏低，環(huán)境壓力大。
生物發(fā)酵法是世界上目前生產(chǎn)乳酸的主流工藝，大多采用玉米、大米、薯干等淀粉質(zhì)原料，經(jīng)過液化，糖化后用微生物發(fā)酵制得。工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)乳酸的菌種目前還主要是乳桿菌、根霉菌和鏈霉菌等。對于不同的菌株，其代謝途徑和酶系組成也有差異，形成的最終產(chǎn)物也有所不同。在我國，L-乳酸生產(chǎn)菌種的工業(yè)化開發(fā)和應(yīng)用研究還處于起步階段，傳統(tǒng)發(fā)酵所得的產(chǎn)品大多還是外消旋體乳酸。目前，國際上較為先進(jìn)的L-乳酸生產(chǎn)工藝是以玉米等谷類為碳源，采用的是細(xì)菌(嗜熱乳酸桿菌)，采用厭氧高溫發(fā)酵模式。生物發(fā)酵法生產(chǎn)乳酸較化學(xué)合成法而言條件溫和，操作安全，但也存在周期長，發(fā)酵污水量大，發(fā)酵液中乳酸含量低，雜質(zhì)多，下游的純化成本高等問題。 乳酸純化的方法很多，傳統(tǒng)的乳酸分離方法大多采用乳酸鈣_酸解工藝。用強(qiáng)酸將乳酸置換出來，再經(jīng)活性炭脫色和離子交換純化，從而得到產(chǎn)品，但該方法的缺點(diǎn)是乳酸鈣結(jié)晶顆粒小，結(jié)晶過程不易控制，產(chǎn)生大量的廢渣廢液等。直接蒸餾需要較高的真空度，否則會使乳酸分解，產(chǎn)品收率下降。酯化法需要對高濃度廢水進(jìn)行處理，生產(chǎn)成本較高且能耗較大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為克服以上技術(shù)的局限，提供一株新的枯草芽孢桿菌(Baci 1 lussubti 1 is) KR2，本發(fā)明的另一 目的是提供該細(xì)菌在生物催化生產(chǎn)L-乳酸中的應(yīng)用。
本發(fā)明的具體實(shí)施方式
如下
背景技術(shù)：
本發(fā)明所涉及的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) KR2 (CGMCC No. 3242)是本公司生物化工研究組成員從受腈類化合物污染達(dá)15年以上的農(nóng)藥廠土壤中篩選得到。其篩選方法如下 從南京第一農(nóng)藥廠污水池不同角度取污泥樣100余批，分批富集培養(yǎng)后進(jìn)行篩選和鑒定 稱取10克污泥，加無菌水50mL，用玻璃珠搖碎后取5mL懸濁液接種到45mL富集培養(yǎng)基中，放置3(TC搖床上，120rpm振蕩培養(yǎng)3天。之后取該培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋，取IO一6、10—7、 10—8的梯度稀釋液涂布到含初篩固體培養(yǎng)基的平板上，置3(TC恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 6天。挑取生長出的單菌落接種到新的初篩固體培養(yǎng)基上擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同上。待菌長出后刮取3 5環(huán)接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。在3(TC搖床上120rpm下振蕩培養(yǎng)3天，取15mL培養(yǎng)液3000rpm下離心10min，倒去上清液后用等體積的生理鹽水沖洗沉淀菌體，繼續(xù)離心得菌體。將所得菌體添加到含1% (%:g/100mL)亞氨基二乙腈的PBS緩沖液中轉(zhuǎn)化2小時，反應(yīng)體系中菌體濃度為0. 5g/L。取5mL轉(zhuǎn)化液3000rpm下離心10min得上清液，HPLC法分析上清液。如果轉(zhuǎn)化液含有亞氨基二乙酸則說明該菌對亞氨基二乙腈具有轉(zhuǎn)化能力，選擇其中亞氨基二乙酸轉(zhuǎn)化率最高的一株，按《簡明伯杰細(xì)菌鑒定手冊》第八版進(jìn)行鑒定為枯草芽孢桿菌。將該株枯草芽孢桿菌命名為KR2，保藏于中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號CGMCC No. 3242，保藏日期為2009年8月19日。
本發(fā)明中的枯草芽孢桿菌KR2(CGMCCNo. 3242)能同時在分別以乳腈、丙烯腈、煙腈、羥基乙腈，亞氨基二乙腈為唯一氮源的固體初篩培養(yǎng)基上生長，底物范圍廣，降解腈類化合物能力強(qiáng)，適合用作本發(fā)明中L-乳酸的生產(chǎn)應(yīng)用。 篩選方法中的所述的液體富集培養(yǎng)基、固體初篩培養(yǎng)基、液體復(fù)篩培養(yǎng)基分別如下 富集培養(yǎng)基(g/100mL):葡萄糖3，酵母膏0. 5，蛋白胨0. 5，氯化鈉0. 1，磷酸二氫鉀0. l，磷酸氫二鉀0. l，硫酸鎂0. 05， pH 7。 固體初篩培養(yǎng)基(g/100mL):葡萄糖3，亞氨基二乙腈(或丙烯腈、或煙腈、或乳腈、或羥基乙腈)l，氯化鈉0. l，磷酸二氫鉀0. l，磷酸氫二鉀0. l，硫酸鎂0. 05，瓊脂
2， pH :7。 液體發(fā)酵培養(yǎng)基(g/100mL):葡萄糖3，酵母膏0. 5，蛋白胨0. 5，氯化鈉0. 1，磷酸二氫鉀0. l，磷酸氫二鉀0. l，硫酸鎂0. 05，尿素0. 5， pH :7。 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) KR2 (CGMCC No. 3242)具有以下微生物學(xué)特征 1.形態(tài)學(xué)特征 在固體平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)48小時后出現(xiàn)圓形光滑的單菌落，灰白色，不透明，表面濕潤，邊緣光滑，整個菌落凸起，易挑??；鏡檢成桿狀，大小長為(0. 5 0. 8um) X (1. 5 2. 5um)，芽孢中生。
2.培養(yǎng)學(xué)特征 本菌株在以下3種培養(yǎng)基中3(TC下培養(yǎng)48 96小時后的培養(yǎng)特征見表1。
表1枯草芽孢桿菌KR2 (CGMCC No. 3242)在3種培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征
培養(yǎng)基名稱菌落顏色及形狀
營養(yǎng)瓊脂菌落凸起，表面濕潤，邊緣光滑，不透明，呈乳白色至灰白色，無
可溶性色素
營養(yǎng)肉湯生長旺盛，灰黃色，渾濁
蛋白胨查氏瓊脂菌落平坦而厚，表面濕潤，邊緣光滑，不透明，灰黃色，無可溶性
色素 3.生理生化特征 表2.枯草芽孢桿菌KR2 (CGMCC No. 3242)生理生化性質(zhì)
項(xiàng)目生理生化特征項(xiàng)目生理生化特征
需氧試驗(yàn)好氧H202酶實(shí)驗(yàn)+
V.P.反應(yīng)+氧化酶實(shí)驗(yàn)_
M.R.試驗(yàn)一脲酶+
油脂水解+明膠液化+
酪素水解+石蕊牛奶反應(yīng)+
酪氨酸水解一從甘油產(chǎn)二羥丙酮—
淀粉水解+碳源產(chǎn)酸馬尿酸鹽水解—葡萄糖+
纖維素分解—蔗糖+
耐鹽濃度7%木糖—
生長pH范圍5-9乳糖+
最高生長溫度50 °C甘露醇+
革蘭氏染色+鼠李糖+
形成n引哚—麥芽糖+
檸檬酸鹽利用—阿拉伯糖+(注表中"+ "表示陽性，"-"表示陰性。) 枯草芽孢桿菌KR2 (CGMCC No. 3242)的培養(yǎng)方法如下 (1)種子液制備先進(jìn)行枯草芽孢桿菌KR2(CGMCC No. 3242)斜面種子制備，將枯草芽孢桿菌KR2(CGMCC No. 3242)接種到已滅菌的斜面后在20 35。C下培養(yǎng)3 7天，刮取3 5環(huán)菌種接種到裝有已滅菌的液體培養(yǎng)基的三角瓶中，在溫度為20 35°C，轉(zhuǎn)速為100 300rpm的條件下振蕩培養(yǎng)30 120小時，即可作為枯草芽孢桿菌KR2 (CGMCCNo. 3242) —級種子。同樣培養(yǎng)條件下，將一級種子按3 10% (%:v/v)的接種量轉(zhuǎn)接第二批裝有同樣培養(yǎng)基的三角瓶中，同樣條件下培養(yǎng)30 72小時后作為枯草芽孢桿菌KR2(CGMCC No. 3242) 二級種子。 (2)擴(kuò)大培養(yǎng)將枯草芽孢桿菌KR2(CGMCC No. 3242) 二級種子以3 10% (%:v/v)的接種量接種到7 300L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為裝液量60 80% (%:v/v)，通氣量0. 1 1 (v/v. min)，罐壓0. 02 0. 05MPa，溫度20 35。C，轉(zhuǎn)速100 400rpm，發(fā)酵時間30 120小時。發(fā)酵完成后將發(fā)酵罐內(nèi)的發(fā)酵液于3000rpm離心10分鐘，棄上清，所得沉淀用去離子水沖洗一遍后3000rpm離心10分鐘，棄上清，得沉淀濕菌體。
所涉及的培養(yǎng)基成分如下 斜面培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖10 30，酵母膏2 10，蛋白胨2 10，氯化鈉1
5，磷酸二氫鉀0. 5 3，磷酸氫二鉀0. 5 3，硫酸鎂0. 2 2，瓊脂10 20，pH :5 9，121。C滅菌20min。 —級、二級液體種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖10 30，酵母膏2 10，蛋白胨2 IO，氯化鈉1 5，磷酸二氫鉀0. 5 3，磷酸氫二鉀0. 5 3，硫酸鎂0. 2 2，己內(nèi)酰胺
0. 5 IO，異戊腈0. 1 5，氯化鈷5 50ppm， pH :5 9。
發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖10 50，酵母膏2 10，蛋白胨2 10，氯化鈉1
5，磷酸二氫鉀0. 5 3，磷酸氫二鉀0. 5 3，硫酸鎂0. 2 2，己內(nèi)酰胺0. 5 10，異戊月青0. 1 5，氯化鈷:5 50卯m， pH :5 9， 121。C滅菌20min。 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) KR2 (CGMCC No. 3242)在生物催化生產(chǎn)L-乳酸中的應(yīng)用。 所述的枯草芽孢桿菌KR2(CGMCC No. 3242)可以為游離細(xì)胞、固定化細(xì)胞或絮凝細(xì)胞，優(yōu)選固定化細(xì)胞或絮凝細(xì)胞。 —種枯草芽孢桿菌KR2 (CGMCC No. 3242)固定化細(xì)胞生物催化法生產(chǎn)L_乳酸的方法為 將獲得的固定化細(xì)胞加入到去離子水或純凈水或pH7. 0 8. 0的磷酸鹽緩沖液中，固定化細(xì)胞的濃度維持在1 10% (w/v)，反應(yīng)溫度控制在20 5(TC之間，攪拌速度控制在50 500rpm之間。反應(yīng)方式是批式反應(yīng)或者連續(xù)反應(yīng)，在批式反應(yīng)中底物可一次性加入，或者間歇分多次加入，或者流加，底物濃度控制在10 50% (g/100ml)。連續(xù)反應(yīng)中，底物可一次性加入，或者間歇分多次加入，或者流加。在此過程中始終保持底物的加入量使反應(yīng)液中的底物濃度《50X，當(dāng)?shù)孜餄舛鹊陀?0ppm時即可結(jié)束反應(yīng)，一次性出灌。反應(yīng)結(jié)束后反應(yīng)液靜止10 30min后進(jìn)行過濾。過濾出的濾液先經(jīng)過降膜式薄膜蒸發(fā)器脫水處理，使濾液中的乳酸濃度不低50%，然后在預(yù)熱溫度為40 5(TC，壓力在0. 1 lKPa的條件下進(jìn)入分子蒸餾裝置進(jìn)行蒸餾脫水，系統(tǒng)的蒸餾溫度為50 8(TC，真空度10 100Pa，進(jìn)料速度120 180mL/h，刮膜器轉(zhuǎn)子的轉(zhuǎn)速100 130rpm。 其中游離細(xì)胞的制備見前文"枯草芽孢桿菌KR2 (CGMCC No. 3242)的培養(yǎng)方法"，此處不累述。 其中，枯草芽孢桿菌KR2(0GMCC No. 3242)固定化細(xì)胞可按如下方法制備按O. 5 1. 5%的海藻酸鈉溶液與8 12%的聚乙烯醇溶液的質(zhì)量比為1 : 8 15的比例，在容器中將兩者混
6合并攪拌均勻，制備出載體材料溶液;然后將枯草芽 包桿菌KR2(0GMCC No. 3242)濕菌體加入載體 材料溶液中，制備出微生物混合溶液，其中枯草芽 包桿菌KR2(0GMCC No. 3242)濕菌體與載體材料 的質(zhì)量比為1 : 4 6 ;將該微生物混合液，滴加入pH值為6. 0 7. 0質(zhì)量濃度為1 5%的氯 化牽丐溶液中進(jìn)行第一步固化反應(yīng)，固化時間為20 120min ;取出第一步固化后的微生物球，用蒸 餾水洗滌2 3次，再放入飽和硫酸鈉溶液中進(jìn)行第二步固化，固化時間為1 4小時;取出第二 步固化后的微生物球，用蒸餾水洗滌2 3次，備用，以上操作都是在室溫下進(jìn)行。
—種利用枯草芽孢桿菌KR2 (CGMCC No. 3242)絮凝細(xì)胞作為生物催化劑生產(chǎn)L_乳 酸的方法，該方法以乳腈為底物，添加5 15% (v/v)的枯草芽孢桿菌KR2(CGMCCNo. 3242) 絮凝細(xì)胞液為生物催化劑，于15 35°C， 100 300rpm反應(yīng)15 50小時得到L-乳酸。
其中，所述的底物乳腈的起始濃度為1 5% (w/v， g/100ml)，采用流加方式使反 應(yīng)體系中乳腈的最終濃度不超過30%。 其中，絮凝細(xì)胞制備方法為將所得的濕菌體用去離子水沖洗下來后攪勻制得濕菌 體濃度為1 200g/L的菌懸液。在5 35°C， pH5 9的條件下向菌懸液中添加0. 1 15%。 (％。g/1000mL)比例的絮凝齊U，200rpm下攪拌10min制得絮凝細(xì)胞液。添加的絮凝劑 可以為殼聚糖，甲殼素，聚谷氨酸，聚丙烯酸，聚丙烯酰胺，聚乙烯亞胺等高分子絮凝劑，優(yōu) 選殼聚糖，添加量優(yōu)選為0. 5 5%。 (％。 :g/1000mL)。 反應(yīng)結(jié)束后向轉(zhuǎn)化液中重新添加裝液量0. 1 0. 5%。 (％。 g/1000mL)的絮凝劑， 攪勻，靜置10 30min后過濾。過濾后先經(jīng)薄膜蒸發(fā)器脫水得濃度不低于50%的粗乳酸， 然后在分子蒸餾裝置內(nèi)繼續(xù)蒸餾脫水，系統(tǒng)參數(shù)如下蒸餾溫度50 8(TC，真空度10 100Pa，進(jìn)料速度120 180mL/h，刮膜器轉(zhuǎn)子的轉(zhuǎn)速100 130rpm。
本發(fā)明中所述％和％。如未經(jīng)說明均為質(zhì)量體積百分比。
本發(fā)明的有益效果 本發(fā)明另辟蹊徑，采用乳腈為原料，利用枯草芽孢桿菌KR2 (CGMCC No. 3242)生物
催化的方式來生產(chǎn)L-乳酸，所得乳酸的產(chǎn)品純度在95%以上，且均為單一具有光學(xué)活性的
卜乳酸，乳腈的轉(zhuǎn)化率超過98%。本發(fā)明所提供的方法既回避了化學(xué)法的生產(chǎn)中污染大，
產(chǎn)品光學(xué)純度差等缺點(diǎn)，又克服了生物發(fā)酵法中污水量大，產(chǎn)品濃度低，雜質(zhì)高不利純化等
因素。采用絮凝細(xì)胞和固定化細(xì)胞催化的方式保護(hù)了細(xì)胞免受高濃度底物和產(chǎn)物的抑制作
用，有利于工業(yè)化放大生產(chǎn)，同時絮凝細(xì)胞或固定化細(xì)胞的使用簡化了下游的純化工藝，分
離過程簡單易于操作，產(chǎn)品純度高，設(shè)備投資少，有效的提高了分離效率，降低了生產(chǎn)成本。
后期純化階段采用分子蒸餾法分離乳酸，工藝步驟少，產(chǎn)品純度較高，色澤好。 綜上所述，本發(fā)明工藝操作簡單，反應(yīng)條件溫和，底物利用程度高，能耗低，產(chǎn)品純
度高，安全環(huán)保，具有廣闊的應(yīng)用前景。 涉及的生物材料樣品的保藏 本發(fā)明所要求保護(hù)的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)KR2保藏于中國微生物
菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)大屯路中國科學(xué)院微生物研究 所，保藏號為CGMCC NO. 3242，保藏日期為2009年8月19日。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1游離細(xì)胞的制備
在無菌超凈工作臺內(nèi)用接種環(huán)刮取枯草芽孢桿菌KR2(CGMCC No. 3242)斜面菌
種3環(huán)，接種到一級液體種子培養(yǎng)基中(葡萄糖15，酵母膏5，蛋白胨5，氯化鈉2，磷酸 二氫鉀1，磷酸氫二鉀l，硫酸鎂0. 5，己內(nèi)酰胺5，異戊腈1，氯化鈷10卯m， pH :7. 0，
單位g/U 。在溫度為25t:，轉(zhuǎn)速為150rpm下振蕩培養(yǎng)48小時即可得一級枯草芽孢桿菌 KR2(CGMCC No. 3242)種子液，將該一級種子液按照10%的接種量轉(zhuǎn)接到裝有同樣成分已滅 菌的培養(yǎng)基中繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，48小時后可得枯草芽孢桿菌KR2(CGMCC No. 3242) 二級種子 液。 將枯草芽孢桿菌KR2 (CGMCC No. 3242) 二級種子液按照10 %的接種量接種到35L 已滅菌的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，(葡萄糖30，酵母膏10，蛋白胨10，氯化鈉2，磷酸二氫 鉀l，磷酸氫二鉀l，硫酸鎂0. 5，異戊腈1，己內(nèi)酰胺5，氯化鈷:10卯m， pH :7，單位g/
L)，發(fā)酵罐體積為50L，采用通空氣與攪拌聯(lián)用的方式控制溶氧不低于10%，通氣量0. 2v/ v. min，罐壓0. 03MPa，溫度25。C，起始轉(zhuǎn)速100rpm，發(fā)酵過程中根據(jù)發(fā)酵液的溶氧水平有 步驟的調(diào)節(jié)，最大轉(zhuǎn)速不超過400rpm，發(fā)酵72小時后即可制得枯草芽孢桿菌KR2 (CGMCC NO. 3242)細(xì)胞發(fā)酵液。
實(shí)施例2固定化細(xì)胞制備 按1. 1%的海藻酸鈉溶液11%的聚乙烯醇溶液的質(zhì)量比為1 : IO的比例，在容 器中，將1. 1%的海藻酸鈉溶液和11%的聚乙烯醇溶液混合并攪拌均勻，制備出載體材料 溶液。然后將枯草芽孢桿菌KR2(CGMCC NO. 3242)濕菌體加入載體材料溶液中，制備出微生 物混合溶液?？莶菅挎邨U菌KR2 (CGMCC NO. 3242)濕菌體載體材料的質(zhì)量比為1 : 5。向 質(zhì)量濃度為4%的氯化鈣溶液(用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為6.6)中滴加入制備好的微生 物混合液，進(jìn)行微生物球的第一步固化反應(yīng)，固化反應(yīng)時間為0. 5小時。用網(wǎng)撈出第一步固 化后的微生物球，先用蒸餾水洗滌3次，再放入飽和硫酸鈉溶液中，進(jìn)行第二步固化反應(yīng)， 固化反應(yīng)時間為3小時。用網(wǎng)撈出第二步固化后的微生物球，用蒸餾水洗滌2次，備用。
實(shí)施例3絮凝細(xì)胞液的制備 取3L枯草芽孢桿菌KR2(CGMCC NO. 3242)發(fā)酵液3000rpm離心10min得沉淀菌體， 用3L去離子水沖洗一遍后繼續(xù)3000rpm離心10min，棄上清得沉淀濕菌體?？莶菅挎邨U菌 KR2(CGMCC NO. 3242)沉淀濕菌體稱重后用去離子水將其沖洗下來制得濃度為35g/L的菌 懸液。30。C下調(diào)菌懸液pH為7，向菌懸液中添加2。； (％。:g/1000mL)比例的殼聚糖，200rpm 下磁力攪拌10min即可制得枯草芽孢桿菌KR2(CGMCC NO. 3242)的絮凝細(xì)胞液。
實(shí)施例4 在50L攪拌釜中，事先裝有濃度為4%的乳腈水溶液30L，在溫度為20°C ，攪拌轉(zhuǎn)速 為150rpm下向其中添加300g濕菌體，反應(yīng)30min后逐漸向其中滴加高濃度的乳腈溶液，最 終使底物的累積濃度不超過18% ，反應(yīng)38小時后檢測底物濃度含量為25ppm，終止反應(yīng)。靜 止半小時后下料，將反應(yīng)液放出后壓濾，所得菌團(tuán)繼續(xù)套用到下批反應(yīng)中。濾液先用降膜式 薄膜蒸發(fā)器脫水處理，使濾液中的乳酸濃度不低于50%，然后在預(yù)熱到45t:，壓力為900Pa 的條件下進(jìn)入分子蒸餾裝置進(jìn)行蒸餾脫水，系統(tǒng)的蒸餾溫度為5(TC，真空度100Pa，進(jìn)料速 度180mL/h，刮膜器轉(zhuǎn)子的轉(zhuǎn)速130rpm。整批試驗(yàn)總共添加乳腈2. 5kg，最終收獲純度為 98. 7%的L-乳酸2. 95kg，收率達(dá)91. 9% 。
實(shí)施例5
在50L攪拌釜中，事先裝有濃度為4%的乳腈水溶液30L，在溫度為35°C ，攪拌轉(zhuǎn)速 為150rpm下向其中添加600g固定化細(xì)胞。反應(yīng)30min后逐漸向其中滴加高濃度的乳腈溶 液，最終使底物的累積濃度為40%，反應(yīng)40小時后檢測底物濃度含量為26ppm，終止反應(yīng)。 靜止半小時，下料。將過濾得到的固定化細(xì)胞繼續(xù)套用到下批反應(yīng)中。濾液先用降膜式薄 膜蒸發(fā)器脫水處理，使濾液中的乳酸濃度不低于50% ，然后在預(yù)熱到45°C ，壓力為800Pa的 條件下進(jìn)入分子蒸餾裝置進(jìn)行蒸餾脫水，系統(tǒng)的蒸餾溫度為7(TC，真空度50Pa，進(jìn)料速度 150mL/h，刮膜器轉(zhuǎn)子的轉(zhuǎn)速120rpm。整批試驗(yàn)總共添加乳腈4kg，最終收獲純度為97. 8% 的L-乳酸4. 77kg，收率達(dá)92.0%。 將過濾得到的固定化細(xì)胞繼續(xù)套用到下批反應(yīng)中，按上述提供的參數(shù)進(jìn)行投料反 應(yīng)和收集。整批試驗(yàn)中共添加乳腈3. 5kg，最終收獲純度為97. 3%的L-乳酸4. 23kg，收率 達(dá)92. 8%。
實(shí)施例6 在50L攪拌釜中，事先裝有濃度為4% (w/v)的乳腈水溶液30L，在溫度為50°C， 攪拌轉(zhuǎn)速為150rpm下向其中添加3L絮凝菌團(tuán)(實(shí)施例3制備)。反應(yīng)30min后逐漸向其 中滴加高濃度的乳腈溶液，最終使底物的濃度為30%，反應(yīng)30小時后檢測底物濃度含量為 25卯m，終止反應(yīng)。像反應(yīng)液中重新添加O. 02。；的殼聚糖，攪拌20min后靜止半小時后下料。 將反應(yīng)液放出后壓濾，濾液先用降膜式薄膜蒸發(fā)器脫水處理，使濾液中的乳酸濃度不低于 50%，然后在預(yù)熱到45t:，壓力為200Pa的條件下進(jìn)入分子蒸餾裝置進(jìn)行蒸餾脫水，系統(tǒng)的 蒸餾溫度為8(TC，真空度20Pa，進(jìn)料速度120mL/h，刮膜器轉(zhuǎn)子的轉(zhuǎn)速100rpm。整批試驗(yàn) 中共添加乳腈3kg，最終收獲純度為96. 8%的L-乳酸3. 65kg，收率達(dá)92. 9% 。
本發(fā)明未涉及部分均與現(xiàn)有技術(shù)相同或可采用現(xiàn)有技術(shù)加以實(shí)現(xiàn)。
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權(quán)利要求
一種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)KR2，保藏于中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.3242。
2. 權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌CGMCC No. 3242在生物催化法生產(chǎn)L_乳酸中的應(yīng)用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的枯草芽孢桿菌CGMCC No. 3242生物催化法生產(chǎn)L-乳酸的方法為在去離子水或純凈水或pH7. 0 8. 0的0. 2mol/L磷酸鹽緩沖液中，以1 10%的枯草芽孢桿菌CGMCC No. 3242固定化細(xì)胞為催化劑，在20 50°C，50 500rpm催化底物乳腈得到L_乳酸。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的底物乳腈的濃度為10 50%。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的固定化細(xì)胞的制備方法為按0. 5 1.5%的海藻酸鈉溶液與8 12%的聚乙烯醇溶液的質(zhì)量比為1 : 8 15的比例，在容器中將兩者混合并攪拌均勻，制備出載體材料溶液；然后將枯草芽孢桿菌CGMCC No. 3242濕菌體加入載體材料溶液中，制備出微生物混合溶液，其中枯草芽孢桿菌CGMCC No. 3242濕菌體與載體材料的質(zhì)量比為1 : 4 6 ;將該微生物混合液，滴加入pH值為6. 0 7. 0質(zhì)量濃度為1 5%的氯化鈣溶液中，進(jìn)行第一步固化反應(yīng)，固化時間為20 120min ;取出第一步固化后的微生物球，用蒸餾水洗滌2 3次，再放入飽和硫酸鈉溶液中，進(jìn)行第二步固化，固化時間為1 4小時；取出第二步固化后的微生物球，用蒸餾水洗滌2 3次，備用。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的反應(yīng)結(jié)束后反應(yīng)液靜止10 30min后進(jìn)行過濾，過濾出的濾液先經(jīng)過降膜式薄膜蒸發(fā)器脫水處理，使濾液中的乳酸濃度不低于50%，然后在預(yù)熱溫度為40 5(TC，壓力在0. 1 lKPa的條件下進(jìn)入分子蒸餾裝置進(jìn)行蒸餾脫水，系統(tǒng)的蒸餾溫度為50 8(TC，真空度10 100Pa，進(jìn)料速度120 180mL/h，刮膜器轉(zhuǎn)子的轉(zhuǎn)速100 130rpm。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的枯草芽孢桿菌CGMCC No. 3242生物催化法生產(chǎn)L-乳酸的方法為以乳腈為底物，添加5 15 %的枯草芽孢桿菌KR2 (CGMCCNo. 3242)絮凝細(xì)胞液為生物催化劑，于15 35°C， 100 300rpm反應(yīng)15 50小時得到L-乳酸。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于制備所述的底物乳腈的起始濃度為1 5%，采用流加方式使反應(yīng)體系中乳腈的最終濃度不超過30%。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于制備所述的絮凝細(xì)胞所用的絮凝劑是殼聚糖、聚谷氨酸、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺或聚乙烯亞胺，優(yōu)選殼聚糖。絮凝劑添加量為0. 1 15%0。
10. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的枯草芽孢桿菌KR2(CGMCC No. 3242)在生物催化法合成L-乳酸中的應(yīng)用，其特征在于所述的反應(yīng)結(jié)束后先添加0. 1 0. 5%。濃度的絮凝劑重新絮凝，過濾后先經(jīng)薄膜蒸發(fā)器脫水得濃度不低于50%的粗乳酸，然后在分子蒸餾裝置內(nèi)繼續(xù)蒸餾脫水，系統(tǒng)參數(shù)如下蒸餾溫度50 8(TC，真空度10 100Pa，進(jìn)料速度120 180mL/h，刮膜器轉(zhuǎn)子的轉(zhuǎn)速100 130rpm。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物化工領(lǐng)域，公開了一株枯草芽孢桿菌及其在生物催化生產(chǎn)L-乳酸中的應(yīng)用。一種利用枯草芽孢桿菌(CGMCC No.3242)生物催化生產(chǎn)L-乳酸的方法，以枯草芽孢桿菌(CGMCC No.3242)固定化細(xì)胞或絮凝細(xì)胞為生物催化劑，催化底物乳腈得到L-乳酸，反應(yīng)液先經(jīng)過降膜式薄膜蒸發(fā)器脫水處理，再經(jīng)分子蒸餾裝置進(jìn)行蒸餾脫水最終制得純度在95％以上的L-乳酸，產(chǎn)品收率超過90％。本發(fā)明工藝操作簡單，反應(yīng)條件溫和，底物利用程度高，能耗低，產(chǎn)品純度高，安全環(huán)保，具有廣闊的應(yīng)用潛力。
文檔編號C12N11/00GK101724592SQ20091026430
公開日2010年6月9日 申請日期2009年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月18日
發(fā)明者劉善和, 姜志忠, 孔國平, 楊壽海, 芮忠南 申請人:南京第一農(nóng)藥集團(tuán)有限公司