專利名稱：基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)的鴨疫里默氏桿菌檢測試劑盒及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物檢測試劑盒及方法，特別涉及一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù) 的鴨疫里默氏桿菌檢測試劑盒及方法。
背景技術(shù)：
鴨疫里默氏桿菌(Riemerella anatipestifer,RA)是一種革蘭氏陰性、無鞭毛、無 芽孢的棒狀桿菌。由其引起的鴨疫里默氏桿菌病是危害鴨、鵝、火雞等家禽和野禽的一種接 觸性傳染病，又名鴨傳染性漿膜炎、新鴨病、鴨敗血癥、鴨疫綜合癥和鴨疫巴氏桿菌病等。該 病發(fā)病率和死亡率通常在10 30%，但有的鴨場感染鴨疫里默氏桿菌的病鴨死亡率高達(dá) 75%。一旦某地區(qū)的鴨群、鵝群發(fā)生鴨疫里默氏桿菌感染，該病就會成為地方性疾病，很難 徹底根除，并且經(jīng)常反復(fù)爆發(fā)，帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。鴨疫里默氏桿菌感染以全身滲出性漿 膜炎為主要病理特征，在病理學(xué)上很難與禽巴氏桿菌感染、大腸桿菌感染、鏈球菌感染和沙 門氏菌感染進(jìn)行區(qū)別。目前，鴨疫里默氏桿菌的檢測方法主要有分離培養(yǎng)鑒定法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) 法和熒光定量PCR(FQ-PCR)法，但分離培養(yǎng)鑒定法操作繁瑣、費時，PCR法和FQ-PCR法需要 昂貴的儀器和試劑，檢測成本高，不適合中小型單位和現(xiàn)場檢測應(yīng)用。環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(loop-mediatedisothermal amplification，LAMP)技術(shù)與其它 核酸擴(kuò)增技術(shù)相比，可以在等溫條件下快速、高效、特異地擴(kuò)增靶序列，且操作簡便，不需要 昂貴的儀器和試劑，成本低，已在病原微生物檢測領(lǐng)域顯示出廣闊的發(fā)展前景。但至今尚未 見基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)專門檢測鴨疫里默氏桿菌的報道。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，為克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的之一在于提供一種基于環(huán)介導(dǎo) 等溫擴(kuò)增技術(shù)的鴨疫里默氏桿菌檢測試劑盒；目的之二在于提供一種使用所述基于環(huán)介導(dǎo) 等溫擴(kuò)增技術(shù)的鴨疫里默氏桿菌檢測試劑盒檢測鴨疫里默氏桿菌的方法；靈敏度高，特異 性好，操作簡便快速，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，檢測成本低，適合中小型單位和現(xiàn)場檢測應(yīng)用。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案1、基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)的鴨疫里默氏桿菌檢測試劑盒，含有以下5組特異性 引物中的任意1組①上游內(nèi)弓丨物 FIP :5，-caggcttccacccattgtccaa-tgagacacggaccagactc-3，；內(nèi)弓L BIP :5，_cgtgaaggacgacggccctat_ctaccctcacgagagtaggt_3，；上游外引物F3 5，-tttagggggcctgagagg-3，；下游外引物 B3 5，-ccggtgcttattcgtacagt-3，；②上游內(nèi)弓丨物 FIP :5，-tattcctcactgctgcctcccg-gtgatcccccacactggt-3，；內(nèi)弓L BIP :5，_cgtgaaggacgacggccctat_ctaccctcacgagagtaggt_3，；
4
上游外引物F3 5，-tttagggggcctgagagg-3，；下游外引物 B3 :5，-ccggtgcttattcgtacagt-3，；③上游內(nèi)弓丨物 FIP :5，-caggcttccacccattgtccaa-acactggtactgagacacgg-3，；內(nèi)弓L BIP :5，_cgtgaaggacgacggccctat_ctaccctcacgagagtaggt_3，；上游外引物F3 5，-tttagggggcctgagagg-3，；下游外引物 B3 :5，-ccggtgcttattcgtacagt-3，；④上游內(nèi)弓丨物 FIP :5，-cgctttcgtccctcagcgtc-tactcagaacaccgattgcg-3，；下游內(nèi)弓丨物 BIP :5，-agataccctggtagtccacgcc-tcgcttagtctctgaaccct-3，；上游外引物F3 :5，-agtgtagcggtgaaatgca-3，；下游夕卜弓丨物 B3 :5，-actccccaggtggctaac-3，；⑤上游內(nèi)弓丨物 FIP :5，-caacccatagggccgtcgtc_ttggacaatgggtggaagc_3，；下游內(nèi)弓丨物 BIP :5，-tctcgtgagggtagctgaaggt-accctccgtattaccgcg-3，；上游夕卜弓丨物 F3 :5，-ggaggcagcagtgaggaa-3，；下游夕卜弓丨物 B3 5，-gcggaccctttaaacccaat-3，。進(jìn)一步，還含有以下試劑中的一種或多種嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bst)DNA聚合酶、 IOX熱聚合反應(yīng)緩沖液、三磷酸堿基脫氧核苷酸混合物(dNTPs)、硫酸鎂、甜菜堿和熒光染 料賽博綠I (SYBR Green I)；所述IOX熱聚合反應(yīng)緩沖液由濃度為250mmol/L、pH為8. 8 的三羥基甲基氨基甲烷_鹽酸(Tris-HCl)、濃度為lOOmmol/L的氯化鉀、濃度為IOOmmol/ L的硫酸銨、濃度為20mmol/L的硫酸鎂和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為的曲拉通(Triton)X-IOO組成；所 述dNTPs由三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸(dATP)、三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸(dGTP)、三磷酸胞 嘧啶脫氧核苷酸(dCTP)和三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸(dTTP)組成。上述試劑均為常規(guī)試 劑，可直接從商業(yè)渠道購得，通常在相關(guān)實驗室中為常備試劑，故本發(fā)明試劑盒中可以不放 入上述試劑，或僅放入上述試劑中的一種或幾種，當(dāng)然也可全部放入，提供多種選擇以方便 使用者購買。2、使用所述基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)的鴨疫里默氏桿菌檢測試劑盒檢測鴨疫里 默氏桿菌的方法，包括以下步驟a、提取待檢樣品的細(xì)菌DNA作為模板DNA，控制模板DNA水溶液的0D26(1/0D28(1值為 1. 6 2. 0,濃度為 10 IOOng/ μ 1 ；b、鴨疫里默氏桿菌的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增在反應(yīng)管中配制總體積為25 μ 1的環(huán)介導(dǎo) 等溫擴(kuò)增反應(yīng)體系，由以下組分組成濃度各為0. 2ymol/L的上游內(nèi)引物FIP和下游內(nèi)引 物BIP，濃度各為0. 8 μ mol/L的上游外引物F3和下游外引物B3，8U嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA 聚合酶，IX熱聚合反應(yīng)緩沖液，濃度各為lmmol/L的三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸鳥 嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸和三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸，濃度為3mmol/L 的硫酸鎂，濃度為lmol/L的甜菜堿，待檢模板DNA水溶液1 μ 1，余量為水；將反應(yīng)管于60 65°C水浴中保溫反應(yīng)45 90分鐘，再于80 95°C水浴中保溫3 5分鐘終止反應(yīng)；C、顯色檢測在反應(yīng)管中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的熒光染料賽博綠I水溶液1 μ 1， 用肉眼觀察顏色變化，如果顏色為黃色，說明待檢樣品中不含有鴨疫里默氏桿菌；如果顏色 變?yōu)榫G色，說明待檢樣品中含有鴨疫里默氏桿菌。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明建立了基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)的鴨疫里默氏桿菌檢測試劑盒及方法，該試劑盒根據(jù)鴨疫里默氏桿菌16S rRNA(GenbankAccession No. EU376364)保守區(qū)的六個特異區(qū)域設(shè)計了兩條特異性內(nèi)引物和兩條特異性外引物，從而 保證了檢測結(jié)果的可靠性；本發(fā)明基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)檢測鴨疫里默氏桿菌，由四條 引物對靶序列的六個特異區(qū)域進(jìn)行識別，特異性強(qiáng)；在等溫條件下擴(kuò)增，不會因溫度改變而 造成時間損失，耗時短，在1小時內(nèi)即可將靶序列擴(kuò)增至IO9倍，而且受非靶序列的影響小， 與PCR法相比靈敏度更高，檢測限僅為幾個拷貝；此外，該技術(shù)不需要特殊、昂貴的儀器和 試劑，擴(kuò)增產(chǎn)物不需要進(jìn)行凝膠電泳，直接用熒光染料顯色即可憑肉眼判斷結(jié)果，操作簡便 快速，檢測成本低。本發(fā)明的試劑盒及方法特別適合中小型單位和現(xiàn)場檢測應(yīng)用。
具體實施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進(jìn) 行詳細(xì)的描述。實施例11、基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)的鴨疫里默氏桿菌檢測試劑盒，由以下試劑組成a、濃度各為5ymol/L的上游內(nèi)引物FIP水溶液和下游內(nèi)引物BIP水溶液，濃度各 為20 μ mol/L的上游外引物F3水溶液和下游外引物B3水溶液引物序列如下上游內(nèi)弓丨物 FIP :5，-caggcttccacccattgtccaa-tgagacacggaccagactc-3，；內(nèi)弓L BIP :5，_cgtgaaggacgacggccctat_ctaccctcacgagagtaggt_3，；上游外引物F3 5，-tttagggggcctgagagg-3，；下游外引物 B3 :5，-ccggtgcttattcgtacagt-3，；b、濃度為8U/ μ 1的Bst DNA聚合酶水溶液；cUOX熱聚合反應(yīng)緩沖液由濃度為250mmol/L、pH為8. 8的Tris-HCl、濃度為 100mmol/L的氯化鉀、濃度為lOOmmol/L的硫酸銨、濃度為20mmol/L的硫酸鎂和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為
的 Triton X-100 組成；d、濃度為 10mmol/L 的 dNTPs 水溶液由濃度各為 10mmol/L 的 dATP、dGTP、dCTP 和 dTTP組成；e、濃度為lOOmmol/L的硫酸鎂水溶液；f、濃度為2mol/L的甜菜堿水溶液；g、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的熒光染料SYBR Green I水溶液。2、使用所述基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)的鴨疫里默氏桿菌檢測試劑盒檢測鴨疫里 默氏桿菌的方法，包括以下步驟a、提取待檢樣品的細(xì)菌DNA作為模板DNA 本實施例同時設(shè)置實驗組和空白對照 組，其中實驗組為鴨疫里默氏桿菌，來源于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)禽病研究中心；采用DNA提取試劑 盒(天根生化科技有限公司)提取各組細(xì)菌DNA，按照試劑盒說明書操作，實驗組所得細(xì)菌 DNA水溶液的OD260/OD280值為1. 8，濃度為20ng/ μ 1。b、鴨疫里默氏桿菌的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增在反應(yīng)管中配制總體積為25 μ 1的環(huán)介導(dǎo) 等溫擴(kuò)增反應(yīng)體系加入濃度均為5ymol/L的上游內(nèi)引物FIP水溶液和下游內(nèi)引物BIP 水溶液各1 μ 1，濃度均為20 μ mol/L的上游外引物F3水溶液和下游外引物B3水溶液各 1 μ 1，濃度為8U/ μ 1的Bst DNA聚合酶水溶液1 μ 1，10 X熱聚合反應(yīng)緩沖液2. 5 μ 1，濃度為10mmol/L的dNTPs水溶液2. 5 μ 1，濃度為100mmol/L的硫酸鎂水溶液0. 75 μ 1，濃度為 2mol/L的甜菜堿水溶液12. 5 μ 1，用無DNA酶的水稀釋至24 μ 1，再加入模板DNA水溶液 1 μ 1，混合均勻，即得；將反應(yīng)管于60 65°C水浴中保溫反應(yīng)60分鐘，再于80°C水浴中保 溫5分鐘終止反應(yīng)；C、顯色檢測在反應(yīng)管中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的熒光染料賽博綠I水溶液1 μ 1， 振搖均勻，用肉眼觀察顏色變化。結(jié)果空白對照組的顏色為黃色，說明不含有鴨疫里默氏桿菌；實驗組的顏色變 為綠色，說明含有鴨疫里默氏桿菌，與預(yù)期結(jié)果一致。實施例21、基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)的鴨疫里默氏桿菌檢測試劑盒，與實施例1所述試劑 盒的不同之處在于特異性引物序列不同，本試劑盒的引物序列如下上游內(nèi)弓丨物 FIP :5，-tattcctcactgctgcctcccg-gtgatcccccacactggt-3，；內(nèi)弓L BIP :5，_cgtgaaggacgacggccctat_ctaccctcacgagagtaggt_3，；上游外引物F3 5，-tttagggggcctgagagg-3，；下游夕卜弓丨物 B3 5，-ccggtgcttattcgtacagt-3，。2、使用所述基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)的鴨疫里默氏桿菌檢測試劑盒檢測鴨疫里 默氏桿菌的方法，與實施例1所述方法相同，結(jié)果發(fā)現(xiàn)空白對照組的顏色為黃色，說明不 含有鴨疫里默氏桿菌；實驗組的顏色變?yōu)榫G色，說明含有鴨疫里默氏桿菌，與預(yù)期結(jié)果一 致。實施例31、基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)的鴨疫里默氏桿菌檢測試劑盒，與實施例1所述試劑 盒的不同之處在于特異性引物序列不同，本試劑盒的引物序列如下上游內(nèi)引物 FIP :5，-caggcttccacccattgtccaa-acactggtactgagacacgg-3，；內(nèi)引 BIP :5，_cgtgaaggacgacggccctat_ctaccctcacgagagtaggt_3，；上游外引物F3 5，-tttagggggcctgagagg-3，；下游外引物 B3 5，-ccggtgcttattcgtacagt-3，。2、使用所述基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)的鴨疫里默氏桿菌檢測試劑盒檢測鴨疫里 默氏桿菌的方法，與實施例1所述方法相同，結(jié)果發(fā)現(xiàn)空白對照組的顏色為黃色，說明不 含有鴨疫里默氏桿菌；實驗組的顏色變?yōu)榫G色，說明含有鴨疫里默氏桿菌，與預(yù)期結(jié)果一 致。實施例41、基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)的鴨疫里默氏桿菌檢測試劑盒，與實施例1所述試劑 盒的不同之處在于特異性引物序列不同，本試劑盒的引物序列如下上游內(nèi)引物 FIP :5，-cgctttcgtccctcagcgtc-tactcagaacaccgattgcg-3，；下游內(nèi)引物 BIP :5，-agataccctggtagtccacgcc-tcgcttagtctctgaaccct-3，；上游外引物F3 :5，-agtgtagcggtgaaatgca-3，；下游外引物 B3 5，-actccccaggtggctaac-3，。2、使用所述基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)的鴨疫里默氏桿菌檢測試劑盒檢測鴨疫里 默氏桿菌的方法，與實施例1所述方法相同，結(jié)果發(fā)現(xiàn)空白對照組的顏色為黃色，說明不含有鴨疫里默氏桿菌；實驗組的顏色變?yōu)榫G色，說明含有鴨疫里默氏桿菌，與預(yù)期結(jié)果一 致。實施例51、基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)的鴨疫里默氏桿菌檢測試劑盒，與實施例1所述試劑 盒的不同之處在于特異性引物序列不同，本試劑盒的引物序列如下上游內(nèi)弓丨物 FIP :5，-caacccatagggccgtcgtc_ttggacaatgggtggaagc_3，；下游內(nèi)弓丨物 BIP :5，-tctcgtgagggtagctgaaggt-accctccgtattaccgcg-3，；上游夕卜弓丨物 F3 :5，-ggaggcagcagtgaggaa-3，；下游夕卜弓丨物 B3 5，-gcggaccctttaaacccaat-3，。2、使用所述基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)的鴨疫里默氏桿菌檢測試劑盒檢測鴨疫里 默氏桿菌的方法，與實施例1所述方法相同，結(jié)果發(fā)現(xiàn)空白對照組的顏色為黃色，說明不 含有鴨疫里默氏桿菌；實驗組的顏色變?yōu)榫G色，說明含有鴨疫里默氏桿菌，與預(yù)期結(jié)果一 致。最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過參 照本發(fā)明的優(yōu)選實施例已經(jīng)對本發(fā)明進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可 以在形式上和細(xì)節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明
的精神和范圍。
序列表
<110>重慶市畜牧科學(xué)院、四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
<120>基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)的鴨疫里默氏桿菌檢測試劑』t及方法
<160>20
<210>1
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>第①組上游內(nèi)引物FIP
<400>1
caggcttcca cccattgtcc aatgagacac ggaccagact c41
<210>2
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>第①組下游內(nèi)引物BIP
<400>2
cgtgaaggac gacggcccta tctaccctca cgagagtagg t41
<210>3
<211>18
<212>DNA<213>人工序列<220><223>第①組上游外引物F3<400>3tttagggggc ctgagagg18<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>第①組下游外引物B3<400>4ccggtgctta ttcgtacagt20<210>5<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>第②組上游內(nèi)引物FIP<400>5tattcctcac tgctgcctcc cggtgatccc ccacactggt40<210>6<211>41<212>DNA<213>人工序列<220><223>第②組下游內(nèi)引物BIP<400>6cgtgaaggac gacggcccta tctaccctca cgagagtagg t41<210>7<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>第②組上游外引物F3<400>7tttagggggc ctgagagg18<210>8
9
<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>第②組下游外引物B3<400>8ccggtgctta ttcgtacagt20<210>9<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>第③組上游內(nèi)引物FIP<400>9caggcttcca cccattgtcc aaacactggt actgagacac gg42<210>10<211>41<212>DNA<213>人工序列<220><223>第③組下游內(nèi)引物BIP<400>10cgtgaaggac gacggcccta tctaccctca cgagagtagg t41<210>11<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>第③組上游外引物F3<400>11tttagggggc ctgagagg18<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>第③組下游外引物B3<400>12ccggtgctta ttcgtacagt20
caacccatag ggccgtcgtc ttggacaatg ggtggaagc 39<210>18<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>第⑤組下游內(nèi)引物BIP<400>18tctcgtgagg gtagctgaag gtaccctccg tattaccgcg 40<210>19<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>第⑤組上游外引物F3<400>19ggaggcagca gtgaggaa18<210>20<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>第⑤組下游外引物B3<400>20gcgg8ccctt taaacccaat20
1權(quán)利要求
基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)的鴨疫里默氏桿菌檢測試劑盒，其特征在于含有以下5組特異性引物中的任意1組①上游內(nèi)引物FIP5’-caggcttccacccattgtccaa-tgagacacggaccagactc-3’； 下游內(nèi)引物BIP5’-cgtgaaggacgacggccctat-ctaccctcacgagagtaggt-3’； 上游外引物F35’-tttagggggcctgagagg-3’； 下游外引物B35’-ccggtgcttattcgtacagt-3’；②上游內(nèi)引物FIP5’-tattcctcactgctgcctcccg-gtgatcccccacactggt-3’； 下游內(nèi)引物BIP5’-cgtgaaggacgacggccctat-ctaccctcacgagagtaggt-3’； 上游外引物F35’-tttagggggcctgagagg-3’； 下游外引物B35’-ccggtgcttattcgtacagt-3’；③上游內(nèi)引物FIP5’-caggcttccacccattgtccaa-acactggtactgagacacgg-3’； 下游內(nèi)引物BIP5’-cgtgaaggacgacggccctat-ctaccctcacgagagtaggt-3’； 上游外引物F35’-tttagggggcctgagagg-3’； 下游外引物B35’-ccggtgcttattcgtacagt-3’；④上游內(nèi)引物FIP5’-cgctttcgtccctcagcgtc-tactcagaacaccgattgcg-3’； 下游內(nèi)引物BIP5’-agataccctggtagtccacgcc-tcgctta，ctctgaaccct-3’； 上游外引物F35’-agtgtagcggtgaaatgca-3’； 下游外引物B35’-actccccaggtggctaac-3’；⑤上游內(nèi)引物FIP5’-caacccatagggccgtcgtc-ttggacaatgggtggaagc-3’； 下游內(nèi)引物BIP5’-tctcgtgagggtagctgaaggt-accctccgtattaccgcg-3’； 上游外引物F35’-ggaggcagcagtgaggaa-3’； 下游外引物B35’-gcggaccctttaaacccaat-3’。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)的鴨疫里默氏桿菌檢測試劑盒，其 特征在于還含有以下試劑中的一種或多種嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶、IOX熱聚合反 應(yīng)緩沖液、三磷酸堿基脫氧核苷酸混合物、硫酸鎂、甜菜堿和熒光染料賽博綠I ；所述IOX 熱聚合反應(yīng)緩沖液由濃度為250 mmol/L、pH為8. 8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、濃度為 100 mmol/L的氯化鉀、濃度為lOOmmol/L的硫酸銨、濃度為20 mmol/L的硫酸鎂和質(zhì)量分?jǐn)?shù) 為的曲拉通X-100組成；所述三磷酸堿基脫氧核苷酸混合物由三磷酸腺嘌呤脫氧核苷 酸、三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸和三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸組 成。
3.使用權(quán)利要求1所述的基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)的鴨疫里默氏桿菌檢測試劑盒檢 測鴨疫里默氏桿菌的方法，其特征在于包括以下步驟a、提取待檢樣品的細(xì)菌DNA作為模板DNA，控制模板DNA水溶液的0D26(1/0D28(1值為 1. 6 2. 0，濃度為 10 100 ng/ μ 1 ；b、鴨疫里默氏桿菌的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增在反應(yīng)管中配制總體積為25μ 1的環(huán)介導(dǎo)等溫 擴(kuò)增反應(yīng)體系，由以下組分組成濃度各為0. 2 ymol/L的上游內(nèi)引物FIP和下游內(nèi)引物 BIP，濃度各為0. 8 μ mol/L的上游外引物F3和下游外引物B3，8 U嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA 聚合酶，IX熱聚合反應(yīng)緩沖液，濃度各為1 mmol/L的三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸鳥 嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸和三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸，濃度為3 mmol/L的硫酸 鎂，濃度為1 mol/L的甜菜堿，待檢模板DNA水溶液1 μ 1，余量為水；將反應(yīng)管于 60 65°C水浴中保溫反應(yīng)45 90分鐘，再于80 95°C水浴中保溫3 5分鐘終止反應(yīng)； c、顯色檢測在反應(yīng)管中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的熒光染料賽博綠I水溶液1 μ 1，用肉 眼觀察顏色變化，如果顏色為黃色，說明待檢樣品中不含有鴨疫里默氏桿菌；如果顏色變?yōu)?綠色，說明待檢樣品中含有鴨疫里默氏桿菌。
全文摘要
本發(fā)明公開了基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)的鴨疫里默氏桿菌檢測試劑盒及方法，該試劑盒根據(jù)鴨疫里默氏桿菌16S rRNA保守區(qū)的六個特異區(qū)域設(shè)計了兩條特異性內(nèi)引物和兩條特異性外引物，可以特異地區(qū)分鴨疫里默氏桿菌與其它血清型沙門氏菌，從而保證了環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增的高度特異性和檢測結(jié)果的可靠性；本發(fā)明基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)檢測鴨疫里默氏桿菌，可以在等溫條件下快速、高效、特異地擴(kuò)增靶序列，且操作簡便，不需要昂貴的儀器和試劑，擴(kuò)增產(chǎn)物直接用熒光染料顯色即可憑肉眼判斷結(jié)果，檢測成本低，特別適合中小型單位和現(xiàn)場檢測應(yīng)用。
文檔編號C12R1/01GK101871005SQ20091025105
公開日2010年10月27日 申請日期2009年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月29日
發(fā)明者付利芝, 楊松全, 楊柳, 楊睿, 楊金龍, 沈克飛, 程安春 申請人:重慶市畜牧科學(xué)院;四川農(nóng)業(yè)大學(xué)