專(zhuān)利名稱(chēng)：一種利用膠體金相互聚集檢測(cè)生物素標(biāo)記的dna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
—種基于不同生物分子修飾的膠體金相互聚集檢測(cè)生物素標(biāo)記的DNA的方法，屬 于分析生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
納米材料在生物分析中的應(yīng)用成為一個(gè)快速發(fā)展的領(lǐng)域，膠體金以其獨(dú)特的光 學(xué)、電學(xué)性質(zhì)以及生物親和效應(yīng)，在催化、傳感器和DNA分析檢測(cè)等方面表現(xiàn)出很多潛在的 應(yīng)用價(jià)值，受到了化學(xué)、物理及生命科學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域的廣泛關(guān)注。1996年，Mirkin等首次 報(bào)道了膠體金在DNA的交聯(lián)作用下的聚集現(xiàn)象，用來(lái)對(duì)生物大分子進(jìn)行檢測(cè)分析，之后，相 關(guān)方面的研究逐漸增多。但大多數(shù)利用膠體金檢測(cè)DNA的方法是利用生物分子修飾的膠體 金與固定在固相表面的生物分子相互作用的單層結(jié)合，或是不同DNA修飾的膠體金在液相 發(fā)生空間上聚集。本方法先將biotin修飾的ssDNA固定到醛基基片上，然后，將鏈霉親和 素修飾的膠體金以及連接上5' biotin修飾的DNA的膠體金依次加入到反應(yīng)體系中，并重 復(fù)這一過(guò)程，利用biotin與鏈霉親和素的相互作用，使兩種修飾不同生物分子的膠體金發(fā) 生結(jié)合，發(fā)生聚集，將DNA信號(hào)放大，實(shí)現(xiàn)在基片表面的空間上對(duì)DNA信號(hào)進(jìn)行放大，最后， 利用銀染方法進(jìn)一步放大信號(hào)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明發(fā)現(xiàn)在1X10"fmol(約為3. 162fmol)至 1 X 103°fmol物質(zhì)的量范圍內(nèi)，灰度值與物質(zhì)的量的對(duì)數(shù)值具有良好的線性的線性關(guān)系和 精密度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種基于不同生物分子修飾的膠體金相互聚集的檢測(cè)生物 素標(biāo)記的DNA的方法，這種方法具有較寬的線性范圍、較低的檢測(cè)限以及較高的精密度。
本發(fā)明的技術(shù)方案一種基于不同生物分子修飾的膠體金相互聚集的檢測(cè)生物素 標(biāo)記的DNA的方法，步驟為(1)膠體金的制備；(2)DNA修飾的膠體金的制備；(3)鏈霉親和 素修飾的膠體金的制備；(4)不同生物分子修飾的膠體金相互聚集及銀染實(shí)驗(yàn)；(5)掃描及 數(shù)據(jù)分析。 (1)膠體金的制備利用Frens法制備13nm的膠體金； 所用的玻璃儀器使用鉻酸洗液浸泡后，雙蒸水清洗，烘干備用；制備時(shí)向500mL燒 杯中加入1%氯化金溶液7. 5mL，再加入超純水(電阻率^ 18. 2MQ cm)至250mL，加熱。 將溶液加熱至沸騰后，立即加入6. 25mLl^檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)加熱，攪拌，沸騰15分鐘 后，停止加熱。這一過(guò)程中可觀察到溶液的顏色由黃色變?yōu)樯钭仙?，進(jìn)而變?yōu)橥该鞯纳罴t 色。冷卻至室溫后，將膠體金用0. 22ym的微孔濾膜進(jìn)行過(guò)濾，4t:保存。
(2)biotin標(biāo)記的DNA修飾的膠體金的制備利用巰基與膠體金的相互作用，將 biotin標(biāo)記的DNA修飾到膠體金表面； 向lmL的AuNP (pH = 7. 0)中加入30 y L100 y M的5'巰基修飾的ssDNA，避光搖 16h，然后向溶液中加入10. 8 ii LO. 5M的磷酸緩沖液和一定量2M的NaCl溶液使其N(xiāo)a+濃度
3遞增，當(dāng)Na+濃度升至0. 1M， 8h后停止反應(yīng)，再加入0. 3mL10%小牛血清白蛋白，lh后離心， 20000g，4°C，lh。離心結(jié)束后，棄上清，將紅色油狀沉淀溶解于PBST中。然后向溶液中加入 30 ii L100 ii M的5'biotin修飾的ssDNA，避光搖16h后離心，20000g， 4°C ， lh。棄上清，沉淀 溶解于PBS中。 (3)鏈霉親和素修飾的膠體金的制備利用蛋白質(zhì)與膠體金的靜電吸附作用將鏈 霉親和素修飾到膠體金表面； 向lmL的AuNP(pH = 9.0)中加入40 y LO. 5 y g/y L的鏈霉親和素(SA)，避光 搖16h，向溶液中加入一定量的2M的NaCl溶液使其N(xiāo)a+濃度遞增，升至0. 1M 8h后，加入 0. 3mL10% BSA，lh后離心，20000g，4。C，60min。棄上清，將紅色油狀沉淀溶解于PBS緩沖液 中。 (4)不同生物分子修飾的膠體金相互聚集及銀染實(shí)驗(yàn)利用生物素與鏈霉親和素 的相互作用，使兩種不同修飾的膠體金發(fā)生聚集，使信號(hào)放大，然后進(jìn)行銀染進(jìn)一步增強(qiáng)信 號(hào)； 將5， biotin修飾的ssDNA稀釋成1 X 103°nM， 1 X 102 5nM， 1 X 102°nM， 1 X 10L5nM， 1 X 101QnM， 1 X 10a 5nM分別取1 L點(diǎn)于醛基基片上，對(duì)照組使用無(wú)修飾的ssDNA。將基片置 于37tV恒濕環(huán)境中，16h。然后將基片置于lOii g/mL的鮭精DNA封閉液中，室溫封閉24h。 封閉結(jié)束后用O. 5XPBST洗三次，每次10min。向反應(yīng)池中加入一定量的SA-AuNP，孵育3h。 之后用PBST洗三次，每次10min。再向反應(yīng)池中加入一定量的DNA-AuNP，孵育3h。之后用 PBST洗三次，每次10min。重復(fù)上述孵育過(guò)程，孵育結(jié)束后對(duì)基片進(jìn)行銀染。其他3組分別 僅使用AuNP，DNA-AuNP和SA-AuNP孵育。由于5'biotin-ssDNA具有大量的堿性基團(tuán)，當(dāng)其 被點(diǎn)到醛基基片上后堿性基團(tuán)會(huì)與醛基反應(yīng)，從而將biotin標(biāo)記的ssDNA固定到基片上。 當(dāng)反應(yīng)中依次加入SA-AuNP和DNA-AuNP后，點(diǎn)樣處出現(xiàn)了紅色圓點(diǎn)。說(shuō)明當(dāng)用SA-AuNP孵 育時(shí)，其上面的SA會(huì)與基片上ssDNA的biotin結(jié)合，這樣就將SA-AuNP固定到基片上，再 加入DNA-AuNP，DNA-AuNP上的DNA帶有biotin，它會(huì)與SA-AuNP上的SA相互結(jié)合，重復(fù)這 一過(guò)程，更多的SA-AuNP和DNA-AuNP會(huì)聚集到點(diǎn)樣處，形成建立在SA與biotin相互作用 基礎(chǔ)上的多層次的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)信號(hào)的放大，達(dá)到肉眼可見(jiàn)的程度。從而實(shí)現(xiàn)了對(duì) 信號(hào)的放大。如果反應(yīng)中，僅加入沒(méi)有任何修飾的AuNP，點(diǎn)樣處沒(méi)有出現(xiàn)紅色圓點(diǎn)，但出現(xiàn) 了較高的紅色背景，這是由于沒(méi)有包被的AuNP與基片上的封閉劑鮭精DNA相互作用，AuNP 被吸附到基片上，從而產(chǎn)生了較深的紅色的背景。當(dāng)反應(yīng)中只加入DNA-AuNP，也沒(méi)有出現(xiàn)紅 色圓點(diǎn)。當(dāng)反應(yīng)中只加入SA-AuNP，理論上應(yīng)該結(jié)合上一層SA-AuNP，但由于密度過(guò)低，無(wú)法 觀察到。僅加入SA-AuNP或DNA-AuNP都不會(huì)形成基于SA與biotin相互作用的兩種不同 修飾的AuNP的聚集。在所有基片上，對(duì)照組(點(diǎn)樣處為未修飾的ssDNA)均未出現(xiàn)紅色圓 點(diǎn)。 (5)掃描及數(shù)據(jù)分析； 將銀染后的基片進(jìn)行掃描，使用ImageJ軟件分析其灰度值，使用oringe6. 0軟件 分析其線性相關(guān)系數(shù)及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明在1X10"fmol(約為3. 162fmo1)至 1 X 103°fmol物質(zhì)的量范圍內(nèi)，點(diǎn)樣處生成的灰度值與物質(zhì)的量的對(duì)數(shù)值具有較好的線性 關(guān)系，經(jīng)分析其線性相關(guān)系數(shù)為0. 99218，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1. 732% (n = 6)。該方法是一種 靈敏度高，特異性好的可視化檢測(cè)DNA的方法。


圖1膠體金的電子顯微鏡圖片。 圖2膠體金的紫外可見(jiàn)吸光光譜圖。 圖3AuNP， DNA-AuNP及SA-AuNP的紫外可見(jiàn)吸光光譜圖。 圖4基片實(shí)驗(yàn)結(jié)果(對(duì)照組點(diǎn)樣處為未修飾的ssDNA) 。 A組僅使用AuNP孵育，B組僅使用DNA-AuNP孵育，C組僅使用SA-AuNP孵育，D組交替使用DNA-AuNP和SA-AuNP孵育。 圖5銀染后的基片反相圖片。 圖6基片上5' biotin-ssDNA物質(zhì)的量取對(duì)數(shù)值后與灰度值的線性關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式
(1)膠體金的制備利用Frens法制備13nm的膠體金； 所用的玻璃儀器使用鉻酸洗液浸泡后，雙蒸水清洗，烘干備用；制備時(shí)向500mL燒杯中加入1%氯化金溶液7. 5mL，再加入超純水(電阻率^ 18. 2MQ cm)至250mL，加熱。將溶液加熱至沸騰后，立即加入6. 25mLl %檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)加熱，攪拌，沸騰15分鐘后，停止加熱。這一過(guò)程中可觀察到溶液的顏色由黃色變?yōu)樯钭仙?，進(jìn)而變?yōu)橥该鞯纳罴t色。冷卻至室溫后，將膠體金用0.22iim的微孔濾膜進(jìn)行過(guò)濾，4t:保存。
(2)biotin標(biāo)記的DNA修飾的膠體金的制備利用巰基與膠體金的相互作用，將biotin標(biāo)記的DNA修飾到膠體金表面； 向lmL的AuNP (pH = 7. 0)中加入30 y L100 y M的5'巰基修飾的ssDNA，避光搖16h，然后向溶液中加入10. 8 ii LO. 5M的磷酸緩沖液和一定量2M的NaCl溶液使其N(xiāo)a+濃度遞增，當(dāng)Na+濃度升至0. 1M， 8h后停止反應(yīng)，再加入0. 3mL10%小牛血清白蛋白，lh后離心，20000g，4°C，lh。離心結(jié)束后，棄上清，將紅色油狀沉淀溶解于PBST中。然后向溶液中加入30 ii L100 ii M的5'biotin修飾的ssDNA，避光搖16h后離心，20000g， 4°C ， lh。棄上清，沉淀溶解于PBS中。 (3)鏈霉親和素修飾的膠體金的制備利用蛋白質(zhì)與膠體金的靜電吸附作用將鏈霉親和素修飾到膠體金表面； 向lmL的AuNP (pH = 9. 0)中加入40 y LO. 5 y g/y L的鏈霉親和素(SA)，避光搖16h，向溶液中加入一定量的2M的NaCl溶液使其N(xiāo)a+濃度遞增，升至0. 1M 8h后，加入0. 3mL10%小牛血清白蛋白，lh后離心，20000g， 4°C ， 60min。棄上清，將紅色油狀沉淀溶解于PBS緩沖液中。 (4)不同生物分子修飾的膠體金相互聚集及銀染實(shí)驗(yàn)利用生物素與鏈霉親和素的相互作用，使兩種不同修飾的膠體金發(fā)生聚集，使信號(hào)放大，然后進(jìn)行銀染進(jìn)一步增強(qiáng)信號(hào)； 將5， biotin修飾的ssDNA稀釋成1 X 103°nM， 1 X 102 5nM， 1 X 102°nM， 1 X 10L5nM，1 X 101. °nM， 1 X 100.5nM分別取1 y L點(diǎn)于醛基基片上。將基片置于37°C ，恒濕環(huán)境中，16h。然后將基片置于10 y g/mL的鮭精DNA封閉液中，室溫封閉24h。封閉結(jié)束后用0. 5% PBST洗三次，每次10min。向反應(yīng)池中加入一定量的SA-AuNP，孵育3h。之后用PBST洗三次，每次 10min。再向反應(yīng)池中加入一定量的DNA-AuNP，孵育3h。之后用PBST洗三次，每次10min。 重復(fù)上述孵育過(guò)程，孵育結(jié)束后對(duì)基片進(jìn)行銀染。
(5)掃描及數(shù)據(jù)分析； 將銀染后的基片進(jìn)行掃描，使用ImageJ軟件分析其灰度值，使用oringe6. 0軟件
分析其線性相關(guān)系數(shù)及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。
權(quán)利要求
一種基于不同生物分子修飾的膠體金相互聚集的檢測(cè)生物素標(biāo)記的DNA的方法，其特征是步驟為(1)膠體金的制備；(2)DNA修飾的膠體金的制備；(3)鏈霉親和素修飾的膠體金的制備；(4)不同生物分子修飾的膠體金相互聚集及銀染實(shí)驗(yàn)；(5)掃描及數(shù)據(jù)分析。(1)膠體金的制備利用Frens法制備13nm的膠體金；所用的玻璃儀器使用鉻酸洗液浸泡后，雙蒸水清洗，烘干備用；制備時(shí)向500mL燒杯中加入一定量的氯化金溶液，再加入超純水至250mL，加熱。將溶液加熱至沸騰后，立即加入一定量的檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)加熱，攪拌，沸騰15分鐘后，停止加熱。這一過(guò)程中可觀察到溶液的顏色由黃色變?yōu)樯钭仙M(jìn)而變?yōu)橥该鞯纳罴t色。冷卻至室溫后，將膠體金用微孔濾膜進(jìn)行過(guò)濾，4℃保存。(2)biotin標(biāo)記的DNA修飾的膠體金的制備利用巰基與膠體金的相互作用，將biotin標(biāo)記的DNA修飾到膠體金表面；向1mL的AuNP中加入一定量的5’巰基修飾的ssDNA，避光搖一段時(shí)間，然后向溶液中加入微量的磷酸緩沖液和一定量的NaCl溶液使其N(xiāo)a+濃度遞增，當(dāng)Na+濃度升至0.1M，停止反應(yīng)，再加入小牛血清白蛋白封閉，1h后離心。離心結(jié)束后，棄上清，將紅色油狀沉淀溶解于PBST中。然后向溶液中加入一定量的5’biotin修飾的ssDNA，長(zhǎng)時(shí)間避光搖后離心，棄上清，沉淀溶解于PBS中。(3)鏈霉親和素修飾的膠體金的制備利用蛋白質(zhì)與膠體金的靜電吸附作用將鏈霉親和素修飾到膠體金表面；向1mL的AuNP中加入一定量的鏈霉親和素(SA)，避光搖一段時(shí)間，向溶液中加入一定量的NaCl溶液使其N(xiāo)a+濃度遞增，升至0.1M后，加入小牛血清白蛋白封閉，1h后離心。棄上清，將紅色油狀沉淀溶解于PBS緩沖液中。(4)不同生物分子修飾的膠體金相互聚集及銀染實(shí)驗(yàn)利用生物素與鏈霉親和素的相互作用，使兩種不同修飾的膠體金發(fā)生聚集，使信號(hào)放大，然后進(jìn)行銀染進(jìn)一步增強(qiáng)信號(hào)；將5’biotin修飾的ssDNA稀釋成不同濃度，分別取1μL點(diǎn)于醛基基片上，對(duì)照組使用無(wú)修飾的ssDNA。將基片置于恒溫恒濕環(huán)境中反應(yīng)一段時(shí)間。然后將基片置于鮭精DNA封閉液中封閉。封閉結(jié)束后用PBST洗三次。向反應(yīng)池中加入一定量的鏈霉親和素修飾的膠體金(SA-AuNP)，孵育一段時(shí)間。之后用PBST洗三次。再向反應(yīng)池中加入一定量的biotin標(biāo)記的DNA修飾的膠體金(DNA-AuNP)，孵育一段時(shí)間。之后用PBST洗三次。重復(fù)上述孵育過(guò)程，孵育結(jié)束后對(duì)基片進(jìn)行銀染。對(duì)照組分別僅使用AuNP，DNA-AuNP和SA-AuNP孵育。(5)掃描及數(shù)據(jù)分析；將銀染后的基片進(jìn)行掃描，使用ImageJ軟件分析其灰度值，使用oringe6.0軟件分析其線性相關(guān)系數(shù)及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。
全文摘要
一種基于不同修飾的膠體金聚集和銀染信號(hào)擴(kuò)增的DNA測(cè)定方法，屬于分析生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。該發(fā)明主要內(nèi)容是使兩種修飾不同生物分子的膠體金發(fā)生結(jié)合，將DNA信號(hào)放大。首先將生物素標(biāo)記的單鏈DNA通過(guò)共價(jià)交聯(lián)固定到基片表面上，再加入鏈霉親和素修飾的膠體金，使之結(jié)合到生物素標(biāo)記的單鏈DNA上，然后加入生物素修飾的膠體金，使兩種修飾不同生物分子的膠體金發(fā)生結(jié)合，重復(fù)這一過(guò)程，將DNA信號(hào)放大，最后，利用銀染方法進(jìn)一步放大信號(hào)。通過(guò)使用該方法，發(fā)現(xiàn)在一定的物質(zhì)的量范圍內(nèi)，點(diǎn)樣處生成的灰度值與物質(zhì)的量的對(duì)數(shù)值具有較好的線性關(guān)系。該方法是一種靈敏度高，特異性好的可視化檢測(cè)DNA的方法，在諸多領(lǐng)域有應(yīng)用潛力。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101717827SQ200910241450
公開(kāi)日2010年6月2日 申請(qǐng)日期2009年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月9日
發(fā)明者張玉祥, 沈海瀅 申請(qǐng)人:首都醫(yī)科大學(xué)