專利名稱：一種抗流感病毒藥物篩選模型及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于抗流感病毒藥物篩選模型與方法及應(yīng)用，特別涉及一種流感病毒RNA聚合酶抑制劑篩選模型及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
甲流感與禽流感是目前嚴(yán)重威脅人類生命健康的急性呼吸道傳播性疾病。隨著疫 苗和藥物的廣泛使用，抗原變異株和耐藥株的出現(xiàn)，使疫苗的保護(hù)效力和目前抗流感藥物 的治療效果顯著降低，因此開發(fā)出新型的抗流感病毒藥物迫在眉睫。甲型流感病毒屬于正 粘病毒科(Orthomyxoviridae)，甲型流感病毒屬。目前已發(fā)現(xiàn)16種HA亞型和9種NA亞 型。甲型流感病毒RNA聚合酶是負(fù)責(zé)流感病毒RNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄等生物學(xué)功能的多亞基、多 功能酶，在流感病毒的生活周期中發(fā)揮著極其重要的作用。甲型流感病毒的RNA聚合酶是 由由2個(gè)堿性亞基PB1、PB2和1個(gè)酸性亞基PA組成的復(fù)合物。在病毒體內(nèi)，3個(gè)RNA聚合 酶亞基與NP蛋白、RNA形成較為緊密的RNP復(fù)合物。甲型流感病毒RNA聚合酶是一個(gè)多功 能酶，不僅具有RNA聚合酶活性(轉(zhuǎn)錄酶和復(fù)制酶)，還有RNA核酸酶活性(內(nèi)切酶和外切 酶)。流感病毒的RNA聚合酶可直接從宿主細(xì)胞內(nèi)的mRNA上剪切加帽的RNA引物(capped RNA primer)來啟動(dòng)合成自身的mRNA。因此，流感病毒與高等生物轉(zhuǎn)錄后需加上帽子結(jié) 構(gòu)不同，流感病毒mRNA轉(zhuǎn)錄后不再需要加帽的引物，直接先以vRNA為模板合成出其互補(bǔ) RNA (cRNA)，然后再以cRNA為模板復(fù)制出vRNA。綜上所述，流感病毒RNA聚合酶是一個(gè)多功 能酶，既是轉(zhuǎn)錄酶又是復(fù)制酶，同時(shí)在轉(zhuǎn)錄過程中，具有切割宿主mRNA帽子結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi) 切酶活性，又有發(fā)揮校對作用的核酸外切酶活性。在不同亞型的流感病毒中RNA聚合酶較 為穩(wěn)定，不像表面抗原血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)那樣容易發(fā)生抗原變異。只要任何 一個(gè)RNA聚合酶亞基的活性被阻斷，那么流感病毒的復(fù)制就會受到抑制，而且RNA聚合酶基 因位于病毒體內(nèi)很少受到宿主免疫壓力的影響，基因序列相對較為保守。因此，本發(fā)明以流 感病毒感染和生活周期肩負(fù)重要功能、又相對穩(wěn)定的RNA聚合酶作為抗流感病毒新型藥物 篩選模型，有望開發(fā)出高效、低毒、副作用小的破壞酶結(jié)構(gòu)或抑制酶活性的新型的抗流感病 毒新藥。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的本發(fā)明目的在于建立一種抗流感病毒藥物篩選模型及其應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，它利用甲型流感病毒4個(gè)聚合酶(PB1，PB2，PA和NP) 基因的轉(zhuǎn)錄活性，將上述4個(gè)RNA聚合酶基因與報(bào)告基因共同轉(zhuǎn)染細(xì)胞后使報(bào)告基因在細(xì) 胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄表達(dá)，然后利用熒光顯微鏡等熒光檢測儀器檢測其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的熒光報(bào)告基因的發(fā) 光強(qiáng)度或通過間接檢測報(bào)告基因作用底物的變化來篩選抗流感病毒藥物的方法?！N新型的抗流感病毒藥物篩選模型的按如下步驟制備
A、通過將含甲型流感病毒4個(gè)RNA聚合酶相關(guān)基因(PB1、PB2、PA和NP)分別插 入pHW2000雙向轉(zhuǎn)錄真核表達(dá)載體BsmBI酶切位點(diǎn)，構(gòu)建具有流感病毒RNA聚合酶活性的 真核質(zhì)粒 pHWPB2、pHWPBl、pHWPA 和 pHWNP ；B、按如下引物PCR擴(kuò)增報(bào)告基因反向插入上述pHW2000載體的BsmBI酶切位點(diǎn)，引物F1:5' -ATACGTCTCGGGGAGCAAAAGCAGGGTAGATAATCACTCACCGAGTGACATCAACACCATGGTGAGCAAGGGCGAGG-3’引物F2:5，-ATACGTCTCATATTAGTAGAAACAAGGGTATTTTTCTTTACTTGTACAGCTCGTCC-3，，如何插 入pHW2000載體的BsmBI酶切位點(diǎn)C、將上述質(zhì)粒按任意比例，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，按轉(zhuǎn)染試劑說明共轉(zhuǎn)染真核 細(xì)胞293T細(xì)胞，，轉(zhuǎn)染后0-24h在轉(zhuǎn)染后的真核細(xì)胞293T細(xì)胞中加入待檢測藥物，培養(yǎng) 12-36h后，以不加待測藥物的細(xì)胞轉(zhuǎn)染組為對照，利用熒光顯微鏡或相應(yīng)檢測試劑觀察或 檢測報(bào)告基因的表達(dá)豐度來判定待檢測藥物對甲型流感病毒RNA聚合酶的影響所述的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑可以為Lipofectamine2000(Invitrogen)所述的報(bào)告基因?yàn)榫G色熒光蛋白(GFP)，紅色熒光蛋白(rGFP)；也可以是通過化 學(xué)發(fā)光法來檢測的報(bào)告基因，如CAT，Luc if erase有益效果1、本發(fā)明以流感病毒感染和生活周期肩負(fù)重要功能、又相對穩(wěn)定的RNA聚合酶作 為抗流感病毒新型藥物篩選模型，有望開發(fā)出高效、低毒、副作用小的破壞酶結(jié)構(gòu)或抑制酶 活性的新型的抗流感病毒新藥


圖1為實(shí)施例1的示意圖
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1(1)通過將含甲型流感病毒4個(gè)RNA聚合酶相關(guān)基因(PB1、PB2、PA和NP)分別插 入pHW2000雙向轉(zhuǎn)錄真核表達(dá)載體BsmBI酶切位點(diǎn)，構(gòu)建具有流感病毒RNA聚合酶活性的 真核質(zhì)粒 pHWPB2、pHWPBU pHWPA 和 pHWNP ；(2)按參考文獻(xiàn)[1]的方法通過如下引物PCR擴(kuò)增綠色熒光蛋白(GFP)基因反向 插入pHW2000載體的BsmBI酶切位點(diǎn)，具體操作方式如下引物F1:5’ -ATACGTCTCGGGGAGCAAAAGCAGGGTAGATAATCACTCACCGAGTGACATCAACACCATGGTGAGCAAGGGCGAGG-3’引物F2:5’ -ATACGTCTCATATTAGTAGAAACAAGGGTATTTTTCTTTACTTGTACAGCTCGTCC-3’(3)將上述質(zhì)粒按任意比例，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑如 Lipofectamine2000 (Invitrogen)，按轉(zhuǎn)染試劑說明共轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞293T細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染后0-24h加入待檢測藥物，培養(yǎng)12-36h后，以不加待測藥物的細(xì)胞轉(zhuǎn)染組為對照，利用熒光顯 微鏡觀察綠色熒光蛋白報(bào)告基因是否表達(dá)來判定待檢測藥物對甲型流感病毒RNA聚合酶 的影響。
權(quán)利要求
一種抗流感病毒藥物篩選模型，其特征在于按如下步驟制備A、通過將含甲型流感病毒4個(gè)RNA聚合酶相關(guān)基因(PB1、PB2、PA和NP)分別插入pHW2000雙向轉(zhuǎn)錄真核表達(dá)載體BsmBI酶切位點(diǎn)，構(gòu)建具有流感病毒RNA聚合酶活性的真核質(zhì)粒pHWPB2、pHWPB1、pHWPA和pHWNP；B、按如下引物PCR擴(kuò)增報(bào)告基因反向插入上述pHW2000載體的BsmBI酶切位點(diǎn)，引物F15’-ATACGTCTCGGGGAGCAAAAGCAGGGTAGATAATCACTCACCGAGTGACATCAACACCATGGTGAGCAAGGGCGAGG-3’引物F25’-ATACGTCTCATATTAGTAGAAACAAGGGTATTTTTCTTTACTTGTACAGCTCGTCC-3’，如何插入pHW2000載體的BsmBI酶切位點(diǎn)C、將上述質(zhì)粒按任意比例，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，按轉(zhuǎn)染試劑說明共轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞293T細(xì)胞，，轉(zhuǎn)染后0-24h在轉(zhuǎn)染后的真核細(xì)胞293T細(xì)胞中加入待檢測藥物，培養(yǎng)12-36h后，以不加待測藥物的細(xì)胞轉(zhuǎn)染組為對照，利用熒光顯微鏡或相應(yīng)檢測試劑觀察或檢測報(bào)告基因的表達(dá)豐度來判定待檢測藥物對甲型流感病毒RNA聚合酶的影響。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗流感病毒藥物篩選模型，其特征在于所述的報(bào)告基因?yàn)榫G 色熒光蛋白(GFP)、紅色熒光蛋白(rGFP)、CAT或Luc if erase。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于抗流感病毒藥物篩選模型與方法及應(yīng)用，特別涉及一種流感病毒RNA聚合酶抑制劑篩選模型及其應(yīng)用；本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，它利用甲型流感病毒4個(gè)聚合酶(PB1，PB2，PA和NP)基因的轉(zhuǎn)錄活性，將上述4個(gè)RNA聚合酶基因與報(bào)告基因共同轉(zhuǎn)染細(xì)胞后使報(bào)告基因在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄表達(dá)，然后利用熒光顯微鏡等熒光檢測儀器檢測其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的熒光報(bào)告基因的發(fā)光強(qiáng)度或通過間接檢測報(bào)告基因作用底物的變化來篩選抗流感病毒藥物的方法；本發(fā)明以流感病毒感染和生活周期肩負(fù)重要功能、又相對穩(wěn)定的RNA聚合酶作為抗流感病毒新型藥物篩選模型，有望開發(fā)出高效、低毒、副作用小的破壞酶結(jié)構(gòu)或抑制酶活性的新型的抗流感病毒新藥。
文檔編號C12N5/10GK101875946SQ20091023458
公開日2010年11月3日 申請日期2009年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月23日
發(fā)明者張?jiān)u滸, 張陸勇 申請人:中國藥科大學(xué)