專利名稱：一種提高谷氨酸溫度敏感突變株發(fā)酵產(chǎn)酸率的方法
一種提高谷氨酸溫度敏感突變株發(fā)酵產(chǎn)酸率的方法技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提高L-谷氨酸發(fā)酵過程產(chǎn)率的方法，屬于發(fā)酵法生
產(chǎn)氨基酸的技術(shù)領(lǐng)域。背景技術(shù)：
自1957年木下等發(fā)明了利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)谷氨酸以來，谷氨酸 發(fā)酵已經(jīng)進(jìn)行工業(yè)化的大規(guī)模生產(chǎn)。國內(nèi)自1964年上海工業(yè)微生物研究所與上海天廚味 精廠協(xié)作，采用黃色短桿菌以發(fā)酵法生產(chǎn)谷氨酸獲得成功以后，1965年在上海天廚味精廠 50m3發(fā)酵罐首先投產(chǎn)，完成了以蛋白質(zhì)原料水解法向發(fā)酵法生產(chǎn)味精的轉(zhuǎn)化。根據(jù)原輕工 業(yè)部規(guī)劃，首先在沈陽味精廠與天津味精廠推廣。1964年，由中國科學(xué)院微生物研究所與 杭州味精廠合作，于1966年采用北京棒桿菌發(fā)酵法生產(chǎn)谷氨酸在杭州味精廠投產(chǎn)，此后， 利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)谷氨酸在國內(nèi)各味精廠相繼推廣，有力地推動了我國味精工業(yè)的崛 起。迄今為止，國內(nèi)已全部采用發(fā)酵法生產(chǎn)味精。多數(shù)廠家現(xiàn)在生產(chǎn)上常用的菌株是T6-13、 FM415、 S9114和CMTC6282等。近60年來，全國味精產(chǎn)量(不含臺灣)已由水解法生產(chǎn)的 4200噸發(fā)展到2008年的190萬噸，占世界味精總產(chǎn)量的70%以上，居世界味精產(chǎn)量首位。
早在20世紀(jì)70年代，日本就有溫度敏感型谷氨酸菌的研究報道。國內(nèi)最早的報 道是1985年上海市工業(yè)微生物所的孫智鳳等對溫度敏感型變異株D0菌的選育及其作用的 報道，他們以該菌為出發(fā)菌株，經(jīng)DES和NTG連續(xù)誘變處理，選育得到一株優(yōu)良的溫度敏感 型NI菌，此菌的生物素適應(yīng)范圍更廣(25iig/L 200iig/L)，同時要在較高溫度(37°C 40°C)下才能正常發(fā)酵產(chǎn)酸。將NI菌用于大米水解糖在6.5n^發(fā)酵罐上生產(chǎn)谷氨酸，平 均產(chǎn)酸率達(dá)5. 89%，平均糖酸轉(zhuǎn)化率為47. 25%，平均發(fā)酵周期為26. 5h。 2002年陳寧等 報道定向選育出了具有寡霉素抗性、谷氨酸氧肟酸鹽抗性的溫度敏感性突變株TMG0106，然 后，以該突變株和產(chǎn)酸率高的天津短桿菌TG961為親株，通過原生質(zhì)體融合技術(shù)，成功地選 育出了產(chǎn)酸率高的融合子CN1021，在6m3發(fā)酵罐上其谷氨酸產(chǎn)量達(dá)14. 6%，糖酸轉(zhuǎn)化率達(dá) 62.8%，并且該菌株系溫度敏感型菌株，可用于谷氨酸強制發(fā)酵。2003年、2004年張克旭、 陳寧等又對溫度敏感突變株CN1021發(fā)酵條件的研究進(jìn)行了報道。蓮花集團(tuán)在幾年前也致 力于以溫度敏感型菌種替代傳統(tǒng)的谷氨酸生產(chǎn)菌種的研究生產(chǎn)工作，經(jīng)幾年的研究探索， 也取得了較大的突破。 目前國內(nèi)谷氨酸主要技術(shù)和產(chǎn)業(yè)化路線主要涉及濕磨玉米淀粉、雙酶法制糖、精 料發(fā)酵、等電離交提取與精制工藝、廢水處理與清潔生產(chǎn)等5個方面，其中谷氨酸發(fā)酵主要 采用生物素亞適量法發(fā)酵，產(chǎn)酸率在100 120g/L，平均轉(zhuǎn)化率為60 % ，而國外主要采用添 加青霉素、溫度敏感型等強制發(fā)酵工藝，產(chǎn)酸水平在140 160g/L左右，轉(zhuǎn)化率65%以上。 本發(fā)明通過采用谷氨酸溫度敏感突變株生產(chǎn)谷氨酸，產(chǎn)酸率可達(dá)到180g/L以上，糖酸轉(zhuǎn)化 率達(dá)到62%以上。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明采用以谷氨酸溫度敏感突變株在發(fā)酵過程提高溫度的方法來 提高谷氨酸發(fā)酵產(chǎn)酸率。 典型的谷氨酸溫度敏感突變株都是短桿菌屬的變種，這些菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基上 28°C 33t:培養(yǎng)時，生長良好，若在37°C 4(TC培養(yǎng)時不能生長或僅能微弱生長，在富含 生物素的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)到適當(dāng)階段，把溫度從28°C 33t:轉(zhuǎn)換到37 4(TC后，可在培養(yǎng)基中積累大量谷氨酸。 谷氨酸溫度敏感突變株多為基因突變型菌株，突變位置發(fā)生在決定與谷氨酸分泌有關(guān)系的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的基因上(編碼某些酶肽鍵結(jié)構(gòu)的順反子)，由于突變導(dǎo)致DNA分子上遺傳密碼的轉(zhuǎn)換或顛換， 一個堿基為另一個堿基所置換，這樣為該基因所指導(dǎo)的酶，在高溫下失活，導(dǎo)致細(xì)胞膜某些結(jié)構(gòu)的改變。當(dāng)控制培養(yǎng)溫度為最適生長溫度時，菌體正常生長；當(dāng)溫度提高到一定程度時，菌體便停止生長而大量產(chǎn)酸。由于其發(fā)酵控制方式與現(xiàn)行的采用生物素亞適量法發(fā)酵谷氨酸完全不同，在利用其發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸時，不需要控制生物素亞適量，僅需通過物理方式(培養(yǎng)溫度的改變)就可以完成谷氨酸生產(chǎn)菌由生長型細(xì)胞向產(chǎn)酸型細(xì)胞的轉(zhuǎn)變，從而避免了因原料的影響而造成產(chǎn)酸不穩(wěn)定的現(xiàn)象，而且發(fā)酵穩(wěn)定，發(fā)酵周期短，設(shè)備利用率高。另外，由于在采用溫度敏感型菌株強制發(fā)酵過程中不存在生物素亞適量問題，生物素可以大過量，從而可以強化體內(nèi)C02固定反應(yīng)，提高谷氨酸對糖的轉(zhuǎn)化率，達(dá)到高產(chǎn)酸、高轉(zhuǎn)化率的目的。
本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的 本發(fā)明提供的一種提高L-谷氨酸發(fā)酵產(chǎn)率的方法，其特征是谷氨酸溫度敏感突變株在發(fā)酵培養(yǎng)基上28°C 33t:培養(yǎng)時，生長良好，當(dāng)發(fā)酵液稀釋20倍濃度0D62。 值為0. 3-0. 8時，在1 30分鐘內(nèi)提高溫度至37°C 4(TC培養(yǎng)，此時不能生長或僅能微弱生長，菌體可在發(fā)酵液中積累大量谷氨酸。
本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果 與現(xiàn)有谷氨酸生物素亞適量工藝相比，本發(fā)明的方法具有以下特點 由于谷氨酸溫度敏感突變株發(fā)酵控制方式與現(xiàn)行的采用生物素亞適量法發(fā)酵谷
氨酸完全不同，在利用其發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸時，不需要控制生物素亞適量，僅需通過物理方式
(培養(yǎng)溫度的改變)就可以完成谷氨酸生產(chǎn)菌由生長型細(xì)胞向產(chǎn)酸型細(xì)胞的轉(zhuǎn)變，從而避
免了因原料的影響而造成產(chǎn)酸不穩(wěn)定的現(xiàn)象；溫度敏感型菌株具有耐生物素、溫度敏感的
特點，要在較高的溫度下才能正常發(fā)酵產(chǎn)酸(一般為37t: 4(TC);溫度轉(zhuǎn)換是影響產(chǎn)酸
的關(guān)鍵，溫度對谷氨酸發(fā)酵具有生產(chǎn)性的影響表明，溫度轉(zhuǎn)換后，必須進(jìn)行適度剩余生長，
完成從谷氨酸非積累型細(xì)胞向積累型細(xì)胞的轉(zhuǎn)變，以保證在富含生物素的培養(yǎng)基中高產(chǎn)谷
氨酸。生產(chǎn)原料易得，不僅可以利用生物素含量高的原料如糖蜜、薯干等直接進(jìn)行發(fā)酵生
產(chǎn)，而且可以利用淀粉質(zhì)原料；發(fā)酵工藝趨于簡單，易于控制，發(fā)酵周期短，節(jié)約能耗，降低
成本等優(yōu)點。
具體實施方式
下面通過實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，所舉之例并不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍 實施例1 : 采用的菌株為谷氨酸棒桿菌、黃色短桿菌等谷氨酸溫度敏感突變株；培養(yǎng)基為在現(xiàn)有普遍采用的發(fā)酵培養(yǎng)基[葡萄糖18%、玉米漿2%、1%504*711200. 15%、K2HP04 0 . 45%、MnS04 0 . 00 0 3%、FeS04 0 . 00 0 3%、VB1 0.00004% ];培養(yǎng)方法將菌種接入種子培養(yǎng)基[葡萄糖2. 5%、玉米槳3%、K2HP04 *3H200. 3%、MgS04 *7H20 0. 1%、0. 0002%、FeS04 0 . 00 0 2%、VB1 0. 00002%，尿素0.055% ]中，接種量為10% ;在30°C 、pH為7. 0和溶氧為20%條件下于5L自動控制發(fā)酵罐中培養(yǎng)12h至對數(shù)期，按10X的接種量接入含有發(fā)酵培養(yǎng)基的30L自 動控制發(fā)酵罐中，控制初始培養(yǎng)溫度為30°C，當(dāng)發(fā)酵液稀釋20倍濃度0062。 值為0. 35時， 在5分鐘內(nèi)提高溫度至37t:培養(yǎng)，通入適當(dāng)空氣，調(diào)節(jié)適當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速，采用分階段供氧模式 控制溶氧0 10h為20 % ， 10 32h為5 % ，通過自動流加氨水控制pH在7. 0 7. 2，通 過流加適量泡敵消泡，并通過流加濃度為800g/L的葡萄糖溶液將殘?zhí)强刂圃?. 5%，發(fā)酵 至32h停止。放罐時，L-谷氨酸的產(chǎn)量為181. Og/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為62.0%。
實施例2: 采用的菌株為谷氨酸棒桿菌、黃色短桿菌等谷氨酸溫度敏感突變株；培養(yǎng)基為在 現(xiàn)有普遍采用的發(fā)酵培養(yǎng)基(同實施例1);種子培養(yǎng)方法同實施例1。發(fā)酵控制初始培養(yǎng) 溫度為28°C ，當(dāng)發(fā)酵液稀釋20倍濃度0062。 值為0. 4時，在3分鐘內(nèi)提高溫度至37"C培養(yǎng)， 其它培養(yǎng)方法同實施例1。放罐時，L-谷氨酸的產(chǎn)量為158. Og/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為60. 0%。
實施例3: 采用的菌株為谷氨酸棒桿菌、黃色短桿菌等谷氨酸溫度敏感突變株；培養(yǎng)基為在 現(xiàn)有普遍采用的發(fā)酵培養(yǎng)基(同實施例1);種子培養(yǎng)方法同實施例1。發(fā)酵控制初始培養(yǎng)溫 度為32°C，當(dāng)發(fā)酵液稀釋20倍濃度0062。 值為0. 6時，在15分鐘內(nèi)提高溫度至38"C培養(yǎng)， 其它培養(yǎng)方法同實施例1。放罐時，L-谷氨酸的產(chǎn)量為162. Og/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為61. 9% 。
實施例4 : 采用的菌株為谷氨酸棒桿菌、黃色短桿菌等谷氨酸溫度敏感突變株；培養(yǎng)基為在 現(xiàn)有普遍采用的發(fā)酵培養(yǎng)基(同實施例1);種子培養(yǎng)方法同實施例1。發(fā)酵控制初始培養(yǎng)溫 度為33°C，當(dāng)發(fā)酵液稀釋20倍濃度0062。 值為0. 8時，在25分鐘內(nèi)提高溫度至39。C培養(yǎng)， 其它培養(yǎng)方法同實施例1。放罐時，L-谷氨酸的產(chǎn)量為157. Og/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為61. 3% 。
權(quán)利要求
一種提高谷氨酸溫度敏感突變株發(fā)酵產(chǎn)酸率的方法，其主要步驟為采用谷氨酸棒桿菌、黃色短桿菌等谷氨酸溫度敏感突變株經(jīng)發(fā)酵獲得L-谷氨酸，其特征在于發(fā)酵過程在前期低溫培養(yǎng)至對數(shù)生長期，迅速提高培養(yǎng)溫度，僅通過溫度轉(zhuǎn)換，并且要在溫度轉(zhuǎn)換之后進(jìn)行適度的剩余生長，完成從谷氨酸非積累型細(xì)胞向谷氨酸積累型細(xì)胞的轉(zhuǎn)變，實現(xiàn)谷氨酸的高產(chǎn)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是其中所說的發(fā)酵過程在前期低溫培養(yǎng)溫度為28°C 33°C。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是其中所說的發(fā)酵過程在前期低溫培養(yǎng)至對 數(shù)生長期時開始迅速提高溫度時機是當(dāng)發(fā)酵液稀釋20倍濃度0D62Qnm值為0. 3-0. 8時。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是培養(yǎng)溫度從28°C 33t:提高至37 40°C 所用的時間為1 30分鐘。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是其中所說的發(fā)酵過程迅速提高培養(yǎng)溫度至 37 40°C。
全文摘要
一種提高谷氨酸溫度敏感突變株發(fā)酵產(chǎn)酸率的方法。本發(fā)明涉及一種發(fā)酵法制備L-谷氨酸的方法。本發(fā)明根據(jù)谷氨酸溫度敏感突變株的突變位置是發(fā)生在決定與谷氨酸分泌有密切關(guān)系的細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)基因上，發(fā)生堿基的轉(zhuǎn)換或顛換，這樣為基因所指導(dǎo)譯出的酶，在高溫時失活，導(dǎo)致細(xì)胞膜某些結(jié)構(gòu)的改變，在溫度轉(zhuǎn)換之后，進(jìn)行適度地剩余生長，完成從谷氨酸非積累型細(xì)胞向谷氨酸積累型細(xì)胞的轉(zhuǎn)變的原理，僅通過采用控制溫度就能實現(xiàn)谷氨酸高產(chǎn)的方法，來有效提高L-谷氨酸發(fā)酵產(chǎn)率。
文檔編號C12R1/13GK101705263SQ20091022894
公開日2010年5月12日 申請日期2009年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月3日 公開號200910228946.發(fā)明者劉淑云, 徐慶陽, 謝希賢, 陳寧, 魏偉 申請人:天津科技大學(xué)