專利名稱：：一種快速鑒別鳙魚幼苗性別的分子生物學(xué)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種分子生物學(xué)，特別是一種快速鑒別鳙魚幼苗性別的分子生物學(xué)方法。
背景技術(shù)：
：我國有著豐富的魚類資源，其中許多魚類在生長速率上存在著性別差異，因此，開展這些魚類性別決定相關(guān)基因及性別特異標(biāo)記的研究對于魚類性別控制具有很高的理論指導(dǎo)意義。鳙(Aristichthysmobilis)屬鯉形目，鯉科，鰱亞科，鳙屬。俗稱花鰱，胖頭魚，黑鰱，黃鰱，松魚，鎔魚，大頭魚。魚名，鳙魚，又名“胖頭魚”、“花鰱”、“黑鰱”，頭很大，生活在淡水中。鳙生長迅速，3齡魚可達(dá)4-5公斤，最大個(gè)體可達(dá)40公斤，天然產(chǎn)量很高。疾病少，易飼養(yǎng)，是我國淡水養(yǎng)殖業(yè)中的“四大家魚”之一，為我國重要經(jīng)濟(jì)魚類。鳙魚雌性生長發(fā)育快，生長迅速。目前人工雌核發(fā)育與激素性反轉(zhuǎn)結(jié)合創(chuàng)造全雌性的養(yǎng)殖群體是鳙魚育種的主要方向。但是由于鳙魚第一次性成熟需45年，在幼苗時(shí)期根本無法通過外觀形態(tài)來判斷其性別特征，所以怎樣從幼苗群體中，簡單快速的識別出遺傳性別成為鳙魚成功選育的先決條件。RAPD技術(shù)是近幾年出現(xiàn)的，可以快速尋找分子標(biāo)記的一種有效方法。用它在某些動物的基因組中尋找性別標(biāo)記已有成功報(bào)道。如在虹鱒魚基因組中找到了兩個(gè)雄性特異的分子標(biāo)記，可以作為識別雌雄的探針。Kovacs等2000年用RAPD掃描非洲鯰魚(Clariasgariepinus)雌、雄基因池，找到兩個(gè)雄性性別相關(guān)的RAPD標(biāo)記。但目前國內(nèi)外尚無有關(guān)分子標(biāo)記鑒別鳙魚幼苗性別方法的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種對鳙魚雌性特異性引物序列。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種能快速鑒別鳙魚幼苗性別的分子生物學(xué)方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是，鳙魚雌性特異性引物序列，其特征在于其特異性引物序列為上游5’CGCATACTCMACATCACATAC3’;下游5’TCACTCACTGTCTGCTCACTG3’。利用設(shè)計(jì)的特異引物序列以鳙魚個(gè)體基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25ul，反應(yīng)組成為IU的TaqDNA聚合酶，2ul的dNTP，100200ng基因組DNA，其中含雌性特異上下游引物各0.1μmol/L，在PCR儀上按下面的循環(huán)參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增95°C預(yù)變性5min后，94°C變性30sec，60°C退火30sec，72°C延伸60sec共30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸lOmin，擴(kuò)增產(chǎn)物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，溴化乙錠染色，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照記錄，lOObpDNAladder作分子量標(biāo)記，出現(xiàn)大小為518bp目的帶的是雌性個(gè)體，沒有條帶的即為雄性個(gè)體。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)比較具有能在鳙魚幼苗期快速準(zhǔn)確鑒別出性別的顯著優(yōu)點(diǎn)。圖1為利用特異PCR法對性別特異片段的驗(yàn)證電泳結(jié)果圖。在雌雄10個(gè)個(gè)體中，對照基因條帶在所有個(gè)體中清晰可見，證明PCR擴(kuò)增程序沒有問題。1,2,3,4,5除管家基因外沒有擴(kuò)增出任何條帶，均為雄性個(gè)體。而6，7，8，9，10泳道都出現(xiàn)了大小為518bp的擴(kuò)增帶，均為雌性個(gè)體；M為IOObp梯度的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。箭頭1所指為大小為518bp的雄性特異條帶；箭頭2所指為對照基因條帶。圖2為利用雌性特異引物對鳙魚幼苗性別鑒定電泳結(jié)果圖。隨機(jī)選取24個(gè)鳙魚幼苗個(gè)體進(jìn)行性別鑒定。其中1，2，3，4，5，6，11，12，13，14，16，18，19，21，22，23，24十七個(gè)個(gè)體的電泳帶上有一個(gè)518bp大小的條帶，為雌性個(gè)體；7，8，9，10，15，17，20七個(gè)個(gè)體在518bp位置上沒有條帶，為雌性個(gè)體。M為IOObp梯度的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。箭頭1所指為大小為518bp的雄性特異條帶；箭頭2所指為對照基因條帶。具體實(shí)施例方式1.雌性特異引物的獲得以及性別特異性的驗(yàn)證性腺解剖鑒定性別后，提取雌雄個(gè)體基因組DNA，利用220條隨機(jī)引物進(jìn)行RAPD-PCR擴(kuò)增，當(dāng)使用到隨機(jī)引物S2120時(shí)，在雌性個(gè)體中擴(kuò)增出一個(gè)穩(wěn)定的譜帶，該帶紋在雄性個(gè)體中不存在。該條帶即為鳙魚雌性特異條帶，通過克隆和測序獲得了一段約518bp的雌性特異片段，命名為AmfT(其DNA序列如表1)，該片段屬非編碼序列，將該序列在Genebank上進(jìn)行序列比對，未發(fā)現(xiàn)與之同源的序列。測序后設(shè)計(jì)一對雌性特異引物Amff1和Amff2，通過NCBI搜索鳙魚的GAPDH對照基因，設(shè)計(jì)一對能作為PCR內(nèi)部對照的引物(序列為5，GCCTCCTGCACCACCAACTG3，和5，CGGAAGGCCATGCCGGTCAG3，)。利用設(shè)計(jì)好的特異引物及對照基因引物在10個(gè)已知性別的個(gè)體中進(jìn)行特異PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性5min后，94°C變性30sec，60°C退火30sec，72°C延伸60sec共30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。擴(kuò)增產(chǎn)物4°C保存。結(jié)果如圖1所示，在雌雄10個(gè)個(gè)體中，對照基因條帶在所有個(gè)體中清晰可見，證明PCR擴(kuò)增程序沒有問題。1，2，3，4，5均為雄性個(gè)體，除管家基因外沒有擴(kuò)增出任何條帶。而6，7，8，9，10均為雌性個(gè)體，泳道都出現(xiàn)了大小為518bp的擴(kuò)增帶；這表明本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物和方法能夠用于鳙魚性別的鑒定。2.鳙魚幼苗性別的鑒別將實(shí)驗(yàn)魚靜脈抽血少許(不超過0.5ml)，加至少兩倍的抗凝劑A⑶，4000rpm離心IOmin,去上清；加入5ml裂解液及20μgRNA酶，37溫育3h；加蛋白酶K至終濃度100μg/μ1，50°C過夜。經(jīng)酚一酚·氯仿異戊醇一氯仿·異戊醇依次抽提，無水乙醇沉淀，70%乙醇洗滌。干燥后，將鳙魚基因組DNA溶于TE或無菌雙蒸水中，分別編號。利用設(shè)計(jì)的雌性特異引物對24個(gè)未知性別鰱魚幼苗個(gè)體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25μ1，IUTaq酶，2μ1dNTP，100200ng基因組DNA，雌性特異上下游引物各0.1μmol/L。循環(huán)參數(shù)為95°C預(yù)變性5min后，94°C變性30sec，60°C退火30sec，72°C延伸60sec共30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。擴(kuò)增產(chǎn)物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，溴化乙錠染色，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照記錄。如圖2發(fā)現(xiàn)17個(gè)出現(xiàn)大小為518bp目的帶的是雌性個(gè)體，其它7個(gè)沒有條帶的即為雄性個(gè)體。以上均表明本發(fā)明設(shè)計(jì)的特異引物和方法能夠用于鰱魚幼苗雌雄性別的鑒別。表1.鳙魚雌性特異片段Amff序列CGCATACTCAAACATCACATACAAAAGCAACAAAAAAAAGGCAATGCACCGAGAAGCCACAAAACAGTGTAAAGAAATGAAAGCGTGATGCGTCATGTAGTATGAACAGACTTTAAAGTCATATTCACAGCATATCCACATATTTGGGATGACATAAATACATGCATTAGGCTTTTTTTAAATGAAATAATAATAACTCTGAATTCACACTAAGCCTGAAATGTCACTGCAATATTTTTATTAAAAATAAATAATTATATGTATTATTGACTATTTAAATTTAAATTATGCATTGGTTTTAGTGTGAATAATTTAAGTGTGAAAAATTACAGTGAAAATAAGACATTCTATAGTTTCAGATTTGGTGTGAACAGGCATTAACTGAAGCAGAGCGAAGATGAAGCCATCTGTTACAGCAGATGAGTGTACAATTTGAAAACAATGACAGTTTATGGAAGATTTGCTTTTGGGAAATGACTGCATAAAGCGGCACAAAGCAGTGAGCAGACAGTGAGTGA表2.鳙魚雌性特異性引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>權(quán)利要求鳙魚雌性特異性引物序列，其特征在于其特異性引物序列為上游5’CGCATACTCAAACATCACATAC3’；下游5’TCACTCACTGTCTGCTCACTG3’。2.一種快速鑒別鳙魚幼苗性別的分子生物學(xué)方法，其特征在于利用設(shè)計(jì)的特異引物序列Amffl:5’CGCATACTCAAACATCACATAC3’；Amff2:5’TCACTCACTGTCTGCTCACTG3，，以鳙魚個(gè)體基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25ul，反應(yīng)組成為IU的TaqDNA聚合酶，2ul的dNTP，100200ng基因組DNA，其中含雌性特異上下游引物各0.1μmol/L,在PCR儀上按下面的循環(huán)參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增95°C預(yù)變性5min后，94°C變性30sec，60°C退火30sec，72°C延伸60sec共30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸lOmin，擴(kuò)增產(chǎn)物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，溴化乙錠染色，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照記錄，IOObpDNAladder作分子量標(biāo)記，出現(xiàn)大小為518bp目的帶的是雌性個(gè)體，沒有條帶的即為雄性個(gè)體。全文摘要一種快速鑒別鳙魚幼苗性別的分子生物學(xué)方法，涉及一種分子生物學(xué)，本發(fā)明的目的是提供一種能快速鑒別鳙魚幼苗性別的分子生物學(xué)方法。本發(fā)明的技術(shù)方案要點(diǎn)是，以鳙魚個(gè)體基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物以1.5％瓊脂糖凝膠電泳分離，溴化乙錠染色，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照記錄，100bpDNAladder作分子量標(biāo)記，出現(xiàn)大小為518bp目的帶的是雌性個(gè)體，沒有條帶的即為雄性個(gè)體。本發(fā)明用于鑒別鳙魚幼苗的性別。文檔編號C12Q1/68GK101805785SQ20091020780公開日2010年8月18日申請日期2009年10月30日優(yōu)先權(quán)日2009年10月30日發(fā)明者夏曉華,常重杰,杜啟艷,王友利,陳建軍申請人:河南師范大學(xué)