專利名稱：一種檢測(cè)納米微粒暴露毒性的方法及其所用的染毒柜的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法領(lǐng)域，特別涉及一種檢測(cè)納米微粒暴露毒性的方法及其 所用的染毒柜。
背景技術(shù)：
隨著納米科技的迅速發(fā)展，納米微粒作為新型材料廣泛應(yīng)用于不同的領(lǐng)域，而由 于顆粒粒徑達(dá)到納米級(jí)，它們的理化性質(zhì)也發(fā)生了根本性變化，將表現(xiàn)出小尺寸效應(yīng)，表面 效應(yīng)，量子尺寸等效應(yīng)，因此與傳統(tǒng)材料相比，納米微粒的性質(zhì)已經(jīng)發(fā)生了巨大的變化，其 生物安全性相應(yīng)也發(fā)生了質(zhì)的變化。在日常生活或由于工作環(huán)境的影響，許多工作者都會(huì) 接觸到納米顆粒，而接觸最多的就是SiO2顆粒，常因吸入納米顆粒而對(duì)身體造成損傷，比如 人們因接觸納米顆粒導(dǎo)致肺損傷，甚至導(dǎo)致矽肺的案例越來(lái)越受到重視，如煤礦粉塵，瓷磚 加工產(chǎn)生的細(xì)微顆粒，水泥廠煙囪灰塵等。但是目前為止對(duì)于納米微粒的安全性評(píng)價(jià)卻并 不完善。事實(shí)上，現(xiàn)在許多國(guó)家研究者已經(jīng)認(rèn)識(shí)到這個(gè)問(wèn)題，并且越來(lái)越多的工作者開始關(guān) 注納米尺度的物質(zhì)的生物效應(yīng)，對(duì)環(huán)境和健康的影響。近年來(lái)，科學(xué)家們相繼開展了納米微粒暴露毒性的研究，主要集中在分子細(xì)胞水 平，直接考察納米微粒對(duì)紅細(xì)胞及大鼠肺泡巨噬細(xì)胞的影響，也有研究者通過(guò)氣管注入法 直接注入納米微粒到大鼠氣管內(nèi)，來(lái)考察納米微粒對(duì)大鼠肺部等組織的損傷。這些方法通 常對(duì)實(shí)驗(yàn)操作人員具有較高的要求，操作復(fù)雜，另外考慮到現(xiàn)實(shí)生活當(dāng)中人們接觸極細(xì)微 顆粒的途徑和方式，這些方法缺乏模擬現(xiàn)實(shí)環(huán)境考察納米微粒對(duì)人們的環(huán)境，身體的影響。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題就是針對(duì)現(xiàn)有的納米微粒的毒性評(píng)價(jià)僅僅停留分 子細(xì)胞或組織水平，還沒(méi)有如現(xiàn)實(shí)生活當(dāng)中人們接觸極細(xì)微顆粒的安全性評(píng)價(jià)方法的不 足，提供一種檢測(cè)納米微粒暴露毒性的方法及其所用的裝置，此方法以盡量模擬現(xiàn)實(shí)生活 中人們接觸粉塵的方式進(jìn)行染毒，選定納米微粒，進(jìn)行靜態(tài)染毒，簡(jiǎn)單易行，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)納 米微粒進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)。本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案之一是一種染毒柜，在該染毒柜內(nèi)， 底部是風(fēng)機(jī)，中上部是可放置試驗(yàn)動(dòng)物的金屬網(wǎng)，在染毒柜的柜壁中部有一開口，為加樣 孔，該開口中有密封塞可以塞住該開口，柜頂是可密封固定的柜蓋。根據(jù)本發(fā)明，較佳的，染毒柜的內(nèi)四角用圓弧材料倒角粘附以去除死角。染毒柜的 內(nèi)壁是4個(gè)圓弧壁鉤，供支撐金屬網(wǎng)用。金屬網(wǎng)較佳的是不銹鋼網(wǎng)。柜蓋上有密封圈，以將 柜蓋密封固定。染毒柜柜壁的材料的較佳的為有機(jī)玻璃。根據(jù)本發(fā)明，較佳的，風(fēng)機(jī)和染毒柜底部之間是固定在柜底的圓柱，以支撐風(fēng)機(jī)， 使其和染毒柜底部保持一定的空間。較佳的，染毒柜柜壁在與風(fēng)機(jī)水平處開一細(xì)孔，風(fēng)機(jī)電 線通過(guò)該細(xì)孔到染毒柜外。風(fēng)機(jī)較佳的是可調(diào)風(fēng)速風(fēng)機(jī)，更佳的是圓形可調(diào)風(fēng)速風(fēng)機(jī)。根據(jù)本發(fā)明，較佳的，還包括一試驗(yàn)動(dòng)物固定器，該固定器的外表面光滑致密。所3述的固定器可以是常規(guī)的動(dòng)物用固定器，試驗(yàn)動(dòng)物的身體都在固定器內(nèi)部，只有頭鼻部露 出。該固定器較佳的是圓柱形固定器。固定器材質(zhì)較佳的為塑料。本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案之二是一種檢測(cè)納米微粒暴露毒性 的方法，包括以下步驟(1)用外表面覆有光滑材料的固定器固定試驗(yàn)動(dòng)物，只保留試驗(yàn)動(dòng)物的頭部暴露 在周圍環(huán)境中；(2)把固定好的試驗(yàn)動(dòng)物放在如上所述的染毒柜內(nèi)的金屬網(wǎng)上，密封固定好染毒 柜；(3)開啟風(fēng)機(jī)，通過(guò)加樣孔撒入納米微粒，調(diào)節(jié)風(fēng)速，控制納米微粒被吹起，靜態(tài)染步驟(1)中，較佳的，在固定試驗(yàn)動(dòng)物前在試驗(yàn)動(dòng)物尾部附著吸水海綿，以吸附尿 液等排泄物。固定器較佳的為類圓柱形固定器。固定器材質(zhì)較佳的為不銹鋼。固定器表面 覆的光滑材料較佳的是不銹鋼片，保鮮膜等。步驟O)中，所述的納米微粒的平均粒徑可以是任何，優(yōu)選IOnm ΙΟμπι，更優(yōu)選 20nm 800nm。步驟C3)是為了將試驗(yàn)動(dòng)物暴露在納米微粒粉塵中，進(jìn)行靜態(tài)染毒。其中較佳的， 通過(guò)調(diào)速器調(diào)節(jié)風(fēng)速，控制粉塵能夠吹起即可。靜態(tài)染毒時(shí)間可以持續(xù)是任何時(shí)間，進(jìn)行很 多次，較佳的是靜態(tài)染毒時(shí)間是2小時(shí)，每次2只大鼠，試驗(yàn)動(dòng)物染毒期間不進(jìn)食不飲水，其 他時(shí)間自由飲水進(jìn)食。染毒結(jié)束后，依照實(shí)驗(yàn)方案要求對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行觀察，檢測(cè)相關(guān)毒性 指標(biāo)，評(píng)估納米微粒的暴露毒性。本發(fā)明所用的原料或試劑除特別說(shuō)明之外，均市售可得。相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果如下本發(fā)明模擬現(xiàn)實(shí)環(huán)境當(dāng)中人們接觸粉 塵的途徑，可行性強(qiáng)，易于操作，使用方便。并且該靜態(tài)染毒柜體積小，試樣用量小，成本低 廉。較好的實(shí)現(xiàn)了暴露毒理學(xué)的檢測(cè)模擬條件。本發(fā)明檢測(cè)納米微粒暴露毒性的方法，可 以用于考察納米微粒暴露毒理學(xué)和對(duì)納米微粒的暴露安全性進(jìn)行評(píng)估等，具有較好的現(xiàn)實(shí) 意義和實(shí)驗(yàn)可行性。


以下結(jié)合

本發(fā)明的特征和有益效果。圖1是染毒柜整體圖。1，染毒柜柜壁；2，加樣孔；3，金屬網(wǎng)；4，支撐金屬網(wǎng)的壁鉤； 5，染毒柜的柜弧形內(nèi)角；6，柜蓋；7，風(fēng)機(jī)；8，風(fēng)機(jī)支撐物。圖2是試驗(yàn)動(dòng)物固定器結(jié)構(gòu)示意圖。9，動(dòng)物固定器；10，頭鼻部出口 ；11，可開閉的 蓋；12，海綿等吸水材料的固定裝置；13，尾部出口 ；14，固定角。圖3 9是大鼠肺部病理切片圖。其中，圖3是空白對(duì)照組；圖4是20nm實(shí)驗(yàn)組； 圖5是50nm實(shí)驗(yàn)組；圖6是80nm實(shí)驗(yàn)組；圖7是140nm實(shí)驗(yàn)組；圖8是280nm實(shí)驗(yàn)組；圖 9是800nm實(shí)驗(yàn)組。
具體實(shí)施例方式下面用實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1靜態(tài)染毒柜的制備靜態(tài)染毒柜，材料為有機(jī)玻璃，厚度為8mm，用專用有機(jī)玻璃膠粘附，長(zhǎng)X寬X高 =42CmX42CmX60Cm，總體積為100L，染毒柜內(nèi)四角用圓弧有機(jī)玻璃倒角粘附以去除死 角，柜壁中部挖出加樣孔，距離柜底40cm的內(nèi)壁鑲嵌4個(gè)圓弧壁勾，直徑為5mm，供支撐鐵絲 網(wǎng)用，染毒柜頂端添加密封圈，再用有機(jī)玻璃蓋進(jìn)行密封固定。裝置如圖1。染毒柜底部安置圓形可調(diào)風(fēng)速軸流風(fēng)機(jī)，型號(hào)150FZY2_D，長(zhǎng)X寬= 16cmX16cm，距離染毒柜底部15cm，用有機(jī)玻璃圓柱體支撐，并粘附固定，染毒柜壁上開一 細(xì)孔，高度與風(fēng)機(jī)安裝高度一致，把風(fēng)機(jī)控制電線用圓柱形塑料管包裹后，引至染毒柜外， 并裝上調(diào)速器。實(shí)施例2大鼠固定裸露裝置大鼠用圓柱形固定器固定，固定器材質(zhì)為塑料，在固定大鼠前在大鼠尾部附著吸 水海綿，以吸附尿液等排泄物。固定器表面覆以光滑材料保鮮膜，只允許大鼠頭部暴露在周 圍環(huán)境中。固定器如圖2。實(shí)施例3大鼠靜態(tài)染毒把固定好的大鼠放入染毒柜內(nèi)，密封固定好染毒柜后，開啟風(fēng)機(jī)，通過(guò)加樣孔分別 撒入20nm，50nm, 140nm, 280nm, 800nm粒徑的SW2顆粒40mg，每組15只大鼠，通過(guò)調(diào)速器調(diào) 節(jié)風(fēng)速，控制粉塵能夠吹起即可。靜態(tài)染毒時(shí)間為2小時(shí)(h)，每次2只大鼠，大鼠染毒期間 不進(jìn)食不飲水，其他時(shí)間自由飲水進(jìn)食。實(shí)施例4大鼠染毒后不同時(shí)間點(diǎn)肺部損傷考察染毒結(jié)束后，觀察大鼠的生理生活情況，死亡情況。于染毒后Mh，48h，72h，處死 各實(shí)驗(yàn)組大鼠，立即開胸腔，結(jié)扎整個(gè)右肺，割取右肺用于病理組織切片觀察。分離出頸部 氣管后，在氣管下端開一” T”形小口，采用外徑為1. 8mm的靜脈導(dǎo)管作為氣管插管，待插管 到達(dá)氣管隆突部位后，向左偏向進(jìn)入左主支氣管即可。用無(wú)菌生理鹽水對(duì)左肺進(jìn)行肺泡灌 洗，共6次，依次為3ml，2ml，2ml，2ml，2ml，2ml，2ml。收集所有肺泡灌洗液，采用Allegra X-15R centrifuge (美國(guó) BECKMAN COULTER)離心機(jī)，控溫 4°C，冷凍離心 2000r/min，冷凍 離心15min。吸取上清液進(jìn)行總蛋白(IPr)、乳酸脫氫酶(LDH)活性測(cè)定，管底沉淀細(xì)胞用 5ml無(wú)菌生理鹽水稀釋制成細(xì)胞懸液，再稀釋5倍，進(jìn)行細(xì)胞總數(shù)(total cellular score, TCS)計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示，染塵后，大鼠TPr，LDH含量均有不同程度的高于對(duì)照組，而TCS計(jì)數(shù)可 見明顯的包細(xì)胞增多，巨噬細(xì)胞增多。見表1，2，3。病理切片顯示，所有的實(shí)驗(yàn)組大鼠均有不同程度的肺部炎癥損傷，主要表現(xiàn)在肺 泡間隔不同程度的增厚，伴有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，主要是巨噬細(xì)胞，淋巴細(xì)胞，或中性粒細(xì)胞。見 圖3 9。說(shuō)明本發(fā)明有關(guān)納米微粒暴露毒理學(xué)的試驗(yàn)方法可行，以上描述是對(duì)本發(fā)明的解 釋，不是對(duì)發(fā)明的限制，本發(fā)明所限定的范圍參見權(quán)利要求書，在不違背本發(fā)明的精神的情 況下，本發(fā)明可以做任何形式的修改。表1.不同粒徑SiO2染塵后不同時(shí)間肺泡灌洗液中細(xì)胞總數(shù)(卩^ XlO5)
權(quán)利要求
1.一種染毒柜，其特征在于，在該染毒柜內(nèi)，底部是風(fēng)機(jī)，中上部是可放置試驗(yàn)動(dòng)物的 金屬網(wǎng)，在染毒柜的柜壁中部有一開口，為加樣孔，該開口中有密封塞可以塞住該開口，柜 頂是可密封固定的柜蓋。
2.如權(quán)利要求1所述的染毒柜，其特征在于，染毒柜的內(nèi)四角用圓弧材料倒角粘附以 去除死角；染毒柜的內(nèi)壁是4個(gè)圓弧壁鉤，供支撐金屬網(wǎng)用；柜蓋上有密封圈，以將柜蓋密 封固定。
3.如權(quán)利要求1所述的染毒柜，其特征在于，風(fēng)機(jī)和染毒柜底部之間是固定在柜底的 圓柱；染毒柜柜壁在與風(fēng)機(jī)水平處開一細(xì)孔，風(fēng)機(jī)電線通過(guò)該細(xì)孔到染毒柜外。
4.如權(quán)利要求1所述的染毒柜，其特征在于，風(fēng)機(jī)是圓形可調(diào)風(fēng)速風(fēng)機(jī)。
5.如權(quán)利要求1所述的染毒柜，其特征在于，還包括一試驗(yàn)動(dòng)物固定器，該固定器的外 表面光滑致密。
6.一種檢測(cè)納米微粒暴露毒性的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)用外表面覆有光滑材料的固定器固定試驗(yàn)動(dòng)物，只保留試驗(yàn)動(dòng)物的頭部暴露在周 圍環(huán)境中；(2)把固定好的試驗(yàn)動(dòng)物放在如權(quán)利要求1 5任一項(xiàng)所述的染毒柜內(nèi)的金屬網(wǎng)上，密 封固定好染毒柜；(3)開啟風(fēng)機(jī)，通過(guò)加樣孔撒入納米微粒，調(diào)節(jié)風(fēng)速，控制納米微粒被吹起，靜態(tài)染毒。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟O)中，所述的納米微粒的平均粒徑是 IOnm 10 μ m0
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的納米微粒的平均粒徑是20nm 800nmo
9.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，在固定試驗(yàn)動(dòng)物前在試驗(yàn)動(dòng)物 尾部附著吸水海綿，以吸附尿液等排泄物；步驟(3)靜態(tài)染毒時(shí)間為2小時(shí)，染毒結(jié)束后，依 照實(shí)驗(yàn)方案要求對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行觀察，檢測(cè)毒性指標(biāo)，評(píng)估納米微粒的暴露毒性。
10.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述的試驗(yàn)動(dòng)物是大鼠。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測(cè)納米微粒暴露毒性的方法及其所用的染毒柜。在該染毒柜內(nèi)，底部是風(fēng)機(jī)，中上部是可放置試驗(yàn)動(dòng)物的金屬網(wǎng)，在染毒柜的柜壁中部有一開口，為加樣孔，該開口中有密封塞，柜頂是可密封固定的柜蓋。該方法包括以下步驟(1)用外表面覆有光滑材料的固定器固定試驗(yàn)動(dòng)物，只保留試驗(yàn)動(dòng)物的頭部暴露；(2)把固定好的試驗(yàn)動(dòng)物放在所述的染毒柜內(nèi)的金屬網(wǎng)上，密封固定好染毒柜；(3)開啟風(fēng)機(jī)，通過(guò)加樣孔撒入納米微粒，調(diào)節(jié)風(fēng)速，控制納米微粒被吹起，靜態(tài)染毒。本發(fā)明模擬現(xiàn)實(shí)環(huán)境當(dāng)中人們接觸粉塵的途徑，可行性強(qiáng)，易于操作，使用方便。并且該靜態(tài)染毒柜體積小，試樣用量小，成本低廉。較好的實(shí)現(xiàn)了暴露毒理學(xué)的檢測(cè)模擬條件。
文檔編號(hào)C12Q1/06GK102053148SQ20091019789
公開日2011年5月11日 申請(qǐng)日期2009年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月29日
發(fā)明者凌向陽(yáng), 奉建芳, 祝林 申請(qǐng)人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院, 上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所