一種基于稀土金屬鈰的熒光納米簇的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于稀土金屬鈰的熒光納米簇的制備方法及其應(yīng)用。本發(fā)明涉及基于稀土金屬元素鈰綠色合成金鈰納米簇的制備方法及其在腫瘤成像和檢測中的應(yīng)用。相關(guān)納米簇材料具有尺寸小，穩(wěn)定性高等特點(diǎn)，在實(shí)際應(yīng)用中有良好的生物相容性和穩(wěn)定的熒光特性，且在室溫下長期放置不發(fā)生聚集而且熒光性能穩(wěn)定。本發(fā)明的方法簡便易操作；合成出的納米材料毒性低，易分離提純；在相關(guān)生物檢測和成像過程中性噪比高，靈敏度和特異性強(qiáng)，具有廣闊的醫(yī)學(xué)臨床應(yīng)用價(jià)值和前景。
【專利說明】一種基于稀土金屬鈰的熒光納米簇的制備方法及其應(yīng)用【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明公開了一種基于稀土金屬鈰的熒光納米簇的制備方法及其應(yīng)用。具體涉及以還原型谷胱甘肽做還原劑，基于稀土金屬元素鈰綠色合成鈰及金鈰納米簇的制備方法及其在腫瘤成像和檢測中的應(yīng)用，并將相關(guān)熒光納米探針應(yīng)用于腫瘤靶向成像和環(huán)境中重金屬離子的檢測；其次利用腫瘤的生理環(huán)境，原位合成熒光金鈰納米簇，實(shí)現(xiàn)活體腫瘤細(xì)胞的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)成像分析。
【背景技術(shù)】
[0002]在環(huán)境污染方面，重金屬是指汞、鎘、鉛以及“類金屬”一砷等生物毒性顯著的重金屬。其中鉛，汞，砷等對(duì)人體毒害巨大，這些重金屬在水中不能被分解，人飲用后毒性放大，與水中的其他毒素結(jié)合生成毒性更大的有機(jī)物。人食入汞后直接沉入肝臟，對(duì)大腦、神經(jīng)、視力破壞極大；人食入鎘后導(dǎo)致高血壓，引起心腦血管疾病，破壞骨骼和肝腎，并引起腎衰竭；鉛是重金屬污染中毒性較大的一種，人食入鉛后，一旦進(jìn)入人體將很難排除，能直接傷害人的腦細(xì)胞，特別是胎兒的神經(jīng)系統(tǒng)，可造成先天智力低下；砷是砒霜的組分之一，有劇毒，會(huì)致人迅速死亡，長期接觸少量，會(huì)導(dǎo)致慢性中毒且還有致癌性。這些重金屬中任何一種都能引起人的頭痛、頭暈、失眠、健忘、神精錯(cuò)亂、關(guān)節(jié)疼痛、結(jié)石、癌癥。因此，對(duì)重金屬污染進(jìn)行防治和檢測，是改善環(huán)境和防止人體中毒及水質(zhì)保護(hù)的重要舉措。
[0003]癌癥，又稱惡性腫瘤，是人類健康的重大威脅，其中以肺癌、胃癌、食管癌、肝癌、乳腺癌、宮頸癌最為常見，占全部惡性腫瘤的70-80%。如今抗癌工作依然嚴(yán)峻，開發(fā)針對(duì)腫瘤的高靈敏靶向成像和治療方法是亟待解決的重要問題。目前，臨床醫(yī)療工作中，惡性腫瘤的發(fā)現(xiàn)主要依賴于影像學(xué)、病理學(xué)及常規(guī)腫瘤標(biāo)志物等檢查技術(shù)，這些傳統(tǒng)的診斷方法雖在臨床上應(yīng)用多年，但缺乏足夠的敏感度和特異度，更重要的是難以早期發(fā)現(xiàn)腫瘤。開發(fā)腫瘤早期診斷的方法尤為重要，它不僅為人類提早預(yù)防腫瘤做準(zhǔn)備而且對(duì)疾病治療預(yù)后提供保障。癌癥治療一直極其困難，所以在癌癥早期階段的高靈敏診斷策略是至關(guān)重要的。在這方面，成像在癌癥的臨床試驗(yàn)和醫(yī)學(xué)實(shí)踐中成為一個(gè)不可缺少的工具。腫瘤成像的方法有很多，如核磁共振，PET-CT，放射性同位素等，但是過程復(fù)雜且對(duì)于普通患者來說過于昂貴且靈敏度不夠高。腫瘤體內(nèi)熒光成像將提`供一個(gè)用于腫瘤直接生物成像的可能性，以此可在癌癥治療過程中進(jìn)行精確的診斷和監(jiān)控。相關(guān)精準(zhǔn)熒光標(biāo)記的多模態(tài)成像方法將為實(shí)現(xiàn)高靈敏、快速的癌癥早期診斷提供新技術(shù)和新方法。
[0004]納米材料因其自身具備的一些特殊性質(zhì)在癌癥檢測等研究中備受矚目。納米材料以優(yōu)越的性能在活細(xì)胞內(nèi)靶向性傳輸，具有巨大的、潛在的研究前景，并且納米材料在生物影像中的應(yīng)用具有重要的價(jià)值。以金等貴金屬納米材料為例，生物相容性好，熒光特性穩(wěn)定，在生物醫(yī)學(xué)中具有廣闊的應(yīng)用前景:如在腫瘤等疾病的早期診治中，可應(yīng)用于體內(nèi)腫瘤演化過程的分析檢測或分子顯像；提高藥物治療的靶向性，避開體內(nèi)的生物或生理學(xué)屏障；還可以對(duì)治療效果進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測。高特異性和穩(wěn)定性的納米熒光探針受到越來越多的親睞，在腫瘤成像標(biāo)記及重金屬離子檢測中具有潛在的應(yīng)用前景。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明發(fā)現(xiàn)和建立了一種基于稀土金屬鈰的熒光納米簇的制備方法，并由此實(shí)現(xiàn)了腫瘤精準(zhǔn)成像標(biāo)記與重金屬低成本、高靈敏的快速檢測，為癌癥等疾病早期發(fā)現(xiàn)和實(shí)時(shí)診斷監(jiān)測提供了新的方法和依據(jù)，具有重要的應(yīng)用前景和價(jià)值。
[0006]本發(fā)明提出了一種基于稀土金屬鈰的熒光納米簇的制備方法，包括以下步驟:
O配制一定濃度的還原型谷胱甘肽水溶液、金試劑和鈰試劑水溶液；
2)將1.5至10mmol/L的還原型谷胱甘肽水溶液與0.5至5mmol/L的金試劑混合均勻，充分震蕩，直至溶液顏色變?yōu)闊o色；
3)將混合溶液放入水浴鍋中加熱一段時(shí)間后，向其中的金試劑混合溶液中加入0.025至5mmol/L鈰試劑，繼續(xù)反應(yīng)一段時(shí)間，然后從水浴鍋中取出，冷卻即得到熒光優(yōu)良的金鈰納米復(fù)合材料；其中加熱時(shí)間為0.5至4h，加熱溫度為37至90°C，谷胱甘肽與金試劑和鈰試劑的比例可以進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而得到不同熒光產(chǎn)率的納米材料。
[0007]本發(fā)明還提出了一種在腫瘤原位合成摻雜稀土金屬鈰的熒光納米簇的制備方法，包括以下步驟:
O配制一定濃度的金試劑和鋪試劑水溶液；
2)將濃度為0.0001至I mmol/L的鈰試劑與0.0001至I mmol/L金試劑混合均勻，取一定量的混合溶液與腫瘤細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4至48小時(shí)；
3)用共聚焦熒光顯微鏡對(duì)金鈰納米復(fù)合材料在細(xì)胞成像及其相關(guān)分布定位進(jìn)行表征，通過熒光成像的熒光分布情況 和其熒光強(qiáng)度對(duì)金鈰納米復(fù)合材料與腫瘤細(xì)胞相互作用及其機(jī)制進(jìn)行分析和定量。
[0008]其中所述的金試劑是氯金酸、八氯化四金、氯化金、三氯化金、一氯化金中的一種或者任意二種的混合溶液；鈰試劑是硝酸鈰、硫酸鈰、氯化鈰、氟化鈰、碳酸鈰、醋酸鈰等鈰的配合物或者鹽中的一種。
[0009]其中所述的腫瘤細(xì)胞原位合成熒光納米簇的制備方法，其中所述腫瘤細(xì)胞為選自肝癌、肺癌、宮頸癌、白血病、骨肉的腫瘤細(xì)胞株。
[0010]合成出的相關(guān)基于稀土金屬鈰的熒光納米簇，因其良好的生物相容性和在生理緩沖液中良好的分散性，將其作為高效熒光探針可對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行精準(zhǔn)標(biāo)記；又由于其高熒光特性，抗干擾能力強(qiáng)，在重金屬離子檢測中也具有廣泛的應(yīng)用前景。腫瘤原位合成的熒光金鈰納米簇，無需提純分離，可實(shí)現(xiàn)活體腫瘤細(xì)胞的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)、高分辨的熒光成像。
[0011]原理說明
金屬納米材料近年來被大量研究，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中具有潛在的應(yīng)用前景。眾所周知，金等納米材料具有良好的生物相容性，因而受到科學(xué)家的親睞,納米材料本身具有對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向性，因而能夠作為腫瘤標(biāo)記的熒光探針。高熒光強(qiáng)度的探針可以大幅提高腫瘤熒光成像的信噪比，又其良好的生物相容性對(duì)細(xì)胞毒性小，所以在生物醫(yī)學(xué)中具有廣泛的用途。利用金鈰納米復(fù)合材料穩(wěn)定的熒光性能，在重金屬離子的檢測中，某些重金屬離子如汞，銅等能夠特異地引起金鈰納米復(fù)合材料的熒光猝滅，從而達(dá)到檢測的目的。利用腫瘤細(xì)胞復(fù)雜的生理環(huán)境，金試劑能夠被還原出金納米顆粒，在金納米顆粒形成晶種初期，由于稀土金屬鈰的存在，鈰摻雜到金納米顆粒中從而形成金鈰納米復(fù)合材料，在腫瘤原位實(shí)現(xiàn)了腫瘤細(xì)胞的實(shí)時(shí)、高分辨的熒光成像。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]下面結(jié)合【專利附圖】

【附圖說明】本發(fā)明的實(shí)施例。
[0013]圖1是本發(fā)明合成出的金鈰納米復(fù)合材料在不同激發(fā)波長下的熒光發(fā)射光譜；
圖2是沒有作用金鈰納米復(fù)合材料的腫瘤細(xì)胞(HeLa)空白對(duì)照；
圖3是本發(fā)明合成出的金鈰納米復(fù)合材料標(biāo)記腫瘤細(xì)胞(HeLa)的激光共聚焦效果
圖；
圖4是本發(fā)明合成出的金鈰納米復(fù)合材料與一定濃度的銅離子作用引起劇烈的熒光猝滅圖。
【具體實(shí)施方式】
[0014]本實(shí)驗(yàn)所用的還原型谷胱甘肽、氯金酸、八氯化四金、氯化金、三氯化金、一氯化金以及硝酸鈰、硫酸鈰、氯化鈰、氟化鈰、碳酸鈰、醋酸鈰等試劑均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
[0015]實(shí)施例1
第一步，配制一定濃度的還原型谷胱甘肽水溶液、金試劑和鈰試劑水溶液；
第二步，將1.5至10mmol/L的還原型谷胱甘肽水溶液與0.5至5mmol/L的金試劑混合均勻，充分震蕩，直至溶液顏色變?yōu)闊o色；
第三步，將混合溶液放入水浴鍋中加熱一段時(shí)間后，向其中的金試劑混合溶液中加入
0.025至5mmol/L鈰試劑，繼續(xù)反應(yīng)一段時(shí)間，然后從水浴鍋中取出，冷卻即得到熒光優(yōu)良的金鈰納米復(fù)合材料；其中加熱時(shí)間為0.5至4h，加熱溫度為37至90°C，谷胱甘肽與金試齊_鈰試劑的比例可以進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而得到不同熒光產(chǎn)率的納米材料。
[0016]實(shí)施例2
1）配制一定濃度的金試劑和鋪試劑水溶液；
2)將濃度為0.0001至1 mmol/L的鈰試劑與0.0001至I mmol/L金試劑混合均勻；
3)選用肝癌細(xì)胞(HepG2)作為研究對(duì)象，實(shí)驗(yàn)組將處于對(duì)數(shù)生長期的肝癌細(xì)胞(H印G2)按照1.6 X IO5個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)8 h后加入已滅菌并用新鮮無菌的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋的含有濃度為0.0001至I mmol/L的金鈰混合溶液與處于對(duì)數(shù)生長期的H印G2細(xì)胞共孵育4-48小時(shí)(37 ° C，5 % C02，RH 95%);對(duì)照組將培養(yǎng)基中的肝癌細(xì)胞(HepG2)按照1.6 X IO5個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于6孔板中，與實(shí)驗(yàn)組同等條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)時(shí)間終止后向?qū)嶒?yàn)組和對(duì)照組的每孔加入磷酸緩沖溶液(PBS，pH=7.2)沖洗2至3次；
4)用共聚焦熒光顯微鏡等對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行成像表征:將其置于激光聚焦熒光顯微鏡下，采用波長為488 nm藍(lán)光進(jìn)行激發(fā)即可采集到細(xì)胞的綠色熒光圖像，通過熒光斷層掃描技術(shù)可以觀察細(xì)胞上的熒光分布情況。
[0017]所述金試劑是氯金酸、八氯化四金、氯化金、三氯化金、一氯化金中的一種或者任意二種的混合溶液；鈰試劑是硝酸鈰、硫酸鈰、氯化鈰、氟化鈰、碳酸鈰、醋酸鈰等鈰的配合物或者鹽中的一種。[0018]合成出的一種基于稀土金屬鈰的熒光增強(qiáng)納米材料，作為高效熒光探針對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記；由于其高熒光特性，抗干擾能力強(qiáng)，用于檢測金屬離子。
[0019]由以上實(shí)例結(jié)果表明:合成出的金鈰納米復(fù)合材料具有強(qiáng)熒光特性，在寬的激發(fā)波長下，金鈰納米復(fù)合材料的熒光發(fā)射峰位置保持不變；對(duì)腫瘤細(xì)胞(如HeLa細(xì)胞等)進(jìn)行熒光標(biāo)記，激光共聚焦圖顯示出金鈰納米復(fù)合材料特異性靶向腫瘤細(xì)胞并且熒光效果顯著；在重金屬離子檢測應(yīng)用中，銅離子大幅度猝滅了金鈰納米復(fù)合材料的熒光，以此為基礎(chǔ)檢測重金屬離子具有良好的效果。
[0020]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出:對(duì)于本【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。`
【權(quán)利要求】
1.一種基于稀土金屬鈰的熒光納米簇的綠色合成方法，包括以下步驟: 1)配制一定濃度的還原型谷胱甘肽水溶液、金試劑和鈰試劑水溶液； 2)將1.5至10mmol/L的還原型谷胱甘肽水溶液與0.5至5mmol/L的金試劑混合均勻，充分震蕩，直至溶液顏色變?yōu)闊o色； 3)將混合溶液放入水浴鍋中加熱一段時(shí)間后，向其中的金試劑混合溶液中加入0.025至5mmol/L鈰試劑，繼續(xù)反應(yīng)一段時(shí)間，然后從水浴鍋中取出，冷卻即得到熒光優(yōu)良的金鈰納米復(fù)合材料；其中加熱時(shí)間為0.5至4h，加熱溫度為37至90°C，谷胱甘肽與金試劑和鈰試劑的比例可以進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而得到不同熒光產(chǎn)率的納米材料。
2.如權(quán)利要求1所述基于稀土金屬鈰的熒光納米簇的制備方法，其中所述金試劑是氯金酸、八氯化四金、氯化金、三氯化金、一氯化金中的一種或者任意二種的混合溶液；鈰試劑是硝酸鈰、硫酸鈰、氯化鈰、氟化鈰、碳酸鈰、醋酸鈰等鈰的配合物或者鹽中的一種。
3.—種在腫瘤原位合成摻雜稀土金屬鈰的熒光納米簇的制備方法，包括以下步驟: O配制一定濃度的金試劑和鋪試劑水溶液； 2)將濃度為0.0001至I mmol/L的鈰試劑與0.0001至I mmol/L金試劑混合均勻，取一定量的混合溶液與腫瘤細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4至48小時(shí)； 3)用共聚焦熒光顯微鏡對(duì)金鈰納米復(fù)合材料在細(xì)胞成像及其相關(guān)分布定位進(jìn)行表征，通過熒光成像的熒光分布情況和其熒光強(qiáng)度對(duì)金鈰納米復(fù)合材料與腫瘤細(xì)胞相互作用及其機(jī)制進(jìn)行分析和定量 。
4.如權(quán)利要求書3所述的制備方法，其中所述金試劑是氯金酸、八氯化四金、氯化金、三氯化金、一氯化金中的一種或者任意二種的混合溶液；鈰試劑是硝酸鈰、硫酸鈰、氯化鈰、氟化鈰、碳酸鈰、醋酸鈰等鈰的配合物或者鹽中的一種。
5.如權(quán)利要求書3中所述的制備方法，其中所述腫瘤細(xì)胞為選自肝癌、肺癌、宮頸癌、白血病、骨肉瘤的腫瘤細(xì)胞株。
【文檔編號(hào)】B82Y40/00GK103820114SQ201410075079
【公開日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2014年3月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月4日
【發(fā)明者】王雪梅, 革偉, 張園園 申請(qǐng)人:東南大學(xué)