專利名稱：一種用于檢測遺傳毒性物質(zhì)的納米dna傳感器及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于檢測遺傳毒性物質(zhì)的納米DNA傳感器及其檢測方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隨著工業(yè)生產(chǎn)的飛速發(fā)展，成千上萬種化學(xué)合成物源源不斷地涌入市場和生活領(lǐng)域，其中部分化合物通過各種途徑進(jìn)入機(jī)體可對(duì)遺傳物質(zhì)造成損害，而引發(fā)基因突變、癌形成或致畸效應(yīng)。脫氧核糖核酸(DNA)是大多數(shù)生物體的遺傳物質(zhì)，對(duì)遺傳信息的保持和蛋白質(zhì)的合成非常關(guān)鍵。而環(huán)境中存在的這些具有遺傳毒性的物質(zhì)，毒性機(jī)制大都以DNA為 靶，對(duì)DNA的化學(xué)結(jié)構(gòu)造成損傷，甚至導(dǎo)致DNA結(jié)構(gòu)的斷裂?？赏ㄟ^遺傳毒性物質(zhì)導(dǎo)致DNA損傷的原理來檢測遺傳毒性物質(zhì)，對(duì)于生態(tài)毒理學(xué)的研究、新化合物的毒性鑒定及環(huán)境污染監(jiān)控都具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。以對(duì)DNA損傷的原理檢測遺傳毒性物質(zhì)的方法有很多，比如經(jīng)典的生物學(xué)檢測方法，Ames實(shí)驗(yàn)和單細(xì)胞凝膠電泳等，但這些方法常需要培養(yǎng)細(xì)菌或細(xì)胞，耗時(shí)較長常需要數(shù)日。電化學(xué)生物傳感器具有操作簡單、快速、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于分析方法的研究中。上世紀(jì)50年代，核酸DNA的堿基被發(fā)現(xiàn)具有電化學(xué)活性，將DNA吸附到電極表面，在一定的測試條件下DNA中的堿基會(huì)產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào)。當(dāng)遺傳毒性物質(zhì)與電極上吸附的DNA反應(yīng)后可造成DNA損傷，從而DNA中堿基的電化學(xué)信號(hào)就會(huì)降低，其中以堿基鳥嘌呤氧化峰電流信號(hào)最為靈敏，因此用此信號(hào)的變化可判斷遺傳毒性物質(zhì)對(duì)DNA的損傷作用，從而檢測待測物質(zhì)的遺傳毒性大小。但是傳統(tǒng)方法將雙鏈DNA直接在三電極系統(tǒng)下給予正電壓，吸附雙鏈DNA到電極表面來制作的傳感器，雙鏈DNA容易脫落且檢測靈敏度也有待提高。所以，構(gòu)造一種新型的傳感器加強(qiáng)DNA的固定和提高靈敏度，對(duì)于快速檢測遺傳毒性物質(zhì)具有科學(xué)和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種納米DNA傳感器及其制備方法，還提供對(duì)遺傳毒性物質(zhì)的檢測方法，以解決當(dāng)前對(duì)遺傳毒性物質(zhì)檢測需時(shí)長、操作步驟繁瑣的問題，提高傳感器檢測的靈敏度。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案是本發(fā)明提供的用于檢測遺傳毒性物質(zhì)的納米DNA傳感器，包括電極材料，其特征在于，在電極材料的表面有經(jīng)帶氨基基團(tuán)的納米金形成的納米金膜修飾，并吸附有雙鏈DNA，所述的雙鏈DNA是通過位于電極材料表面的納米金膜中帶氨基基團(tuán)的納米金帶有的正電荷，以靜電吸附方式吸附帶負(fù)電的雙鏈DNA而固定于電極材料的表面。經(jīng)帶氨基基團(tuán)的納米金形成納米金膜修飾電極材料表面的具體方法是將電極材料的表面分別經(jīng)
0.3um,0. 05uma -Al2O3打磨，每一步均用雙蒸水超聲波洗凈，在室溫環(huán)境中，將經(jīng)打磨和清洗潔凈后的電極材料插入到帶氨基基團(tuán)的納米金溶液中I小時(shí)，使溶液中帶氨基基團(tuán)的納米金在電極材料表面自動(dòng)分散成納米金膜，然后用5mL雙蒸水輕柔沖洗，用氮?dú)獯蹈蓚溆?；所述的電極材料是金電極；所述的帶氨基基團(tuán)的納米金溶液的制備方法是將濃度為ImM的氯金酸溶液90mL與濃度為ImM的油胺ImL混合,磁力攪拌加熱到80°C保持5min,
I.2 X IO4g離心，棄去上清，所得沉淀用IOmL超純水洗滌，I. 2 X IO4g離心后，重復(fù)超純水洗滌2次后，溶于IOmL超純水中即得到帶氨基基團(tuán)的納米金溶液；納米金膜修飾的電極材料表面吸附并固定雙鏈DNA的具體方法是將納米金膜修飾的電極材料插入含有雙鏈DNA的醋酸溶液中，在三電極系統(tǒng)下，給予電壓+0. 5V保持5min，然后用5mL雙蒸水輕柔沖洗,晾干，即實(shí)現(xiàn)將雙鏈DNA吸附并被固定到納米金膜修飾的電極材料表面；所述的含有雙鏈DNA的醋酸溶液，醋酸溶液的PH值為4. 75濃度為0. 25M，其中雙鏈DNA的濃度為10 u g/mL,所述的雙鏈DNA是小牛胸腺雙鏈DNA。本發(fā)明提供的用于檢測遺傳毒性物質(zhì)的納米DNA傳感器的制備方法包括以下步驟 步驟一、制備帶氨基基團(tuán)的納米金溶液取濃度為ImM的氯金酸溶液90mL與濃度為ImM的油胺ImL混合,磁力攪拌加熱到80°C保持5min, I. 2 X 104g離心,棄去上清,所得沉淀加入超純水IOmL洗滌，I. 2 X IO4g離心后，重復(fù)超純水洗滌2次，溶于IOmL超純水中即得到帶氨基基團(tuán)的納米金溶液。步驟二、制備納米金膜修飾的金電極金電極表面分別經(jīng)0. 3 ii m、
0.05 Uma-Al2O3打磨，每一步均用雙蒸水超聲波洗凈；在室溫環(huán)境中，將經(jīng)打磨和清洗潔凈后的金電極，插入步驟一配制的帶氨基基團(tuán)的納米金溶液中I小時(shí)，使帶氨基基團(tuán)的納米金在金電極表面自動(dòng)分散成納米金膜，然后用5mL雙蒸水輕柔沖洗，氮?dú)獯蹈?，即得到納米金膜修飾的金電極。步驟三將納米金膜修飾的金電極插入含有10 u g/mL小牛胸腺雙鏈DNA的0. 25M的醋酸(PH4. 75)溶液中，在三電極系統(tǒng)下，給予電壓+0. 5V保持5min，用5mL雙蒸水輕柔沖洗，晾干后備用，即制得用于檢測遺傳毒性物質(zhì)的納米DNA傳感器。本發(fā)明提供的檢測遺傳毒性物質(zhì)的方法包括以下步驟(I)滴加空白溶液8 ii L到納米DNA傳感器的表面，反應(yīng)lOmin，用方波伏安法在測試液中掃描測得納米DNA傳感器上所固定的雙鏈DNA中鳥嘌呤的氧化峰電流值，記作Sb ;然后用5mL雙蒸水沖洗；所述的空白溶液是濃度為0. 25M的醋酸(pH4. 75)溶液；所述的測試液是濃度為0. 25M的醋酸(pH4. 75)含IOmM KCl的溶液；(2)滴加待檢測樣品溶液8 ii L于同一納米DNA傳感器表面，反應(yīng)lOmin，用方波伏安法在測試液中掃描測得納米DNA傳感器上所固定的雙鏈DNA中鳥嘌呤的氧化峰電流值，記作Ss ；(3)計(jì)算Ss與Sb的百分比率S%= (Ss/Sb)X100，按以下方法(a)確定遺傳毒性物質(zhì)的濃度和/或含量；或按以下方法(b)判斷是否具有遺傳毒性(a)S%的值與待測的某一遺傳毒性物質(zhì)濃度成反比，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線定量檢測未知濃度的該遺傳毒性物質(zhì)；(b)根據(jù)信噪比I : 10，S%> 85%認(rèn)為不具有遺傳毒性；S%< 85%判斷具有遺
傳毒性。
本發(fā)明利用帶氨基基團(tuán)的納米金其表面的氨基基團(tuán)可與金電極的表面結(jié)合的性能，當(dāng)金電極插入到帶氨基基團(tuán)的納米金溶液中，帶氨基基團(tuán)的納米金就在金電極表面自動(dòng)分散成納米金膜。帶氨基基團(tuán)的納米金還帶有正電荷，可靜電吸附帶負(fù)電的雙鏈DNA，并在三電極系統(tǒng)下給予正電壓(納米金膜修飾的金電極為工作電極、甘汞電極為參比電極和鉬絲電極為輔助電極)，可加速將溶于醋酸溶液中的雙鏈DNA吸附并固定于金電極表面，從而制得檢測遺傳毒性物質(zhì)的納米DNA傳感器，制作原理見圖I。帶氨基基團(tuán)的納米金帶有正電荷對(duì)雙鏈DNA的靜電吸附，使得雙鏈DNA不易脫落；并且，納米金具有大比表面面積的特性，可增加對(duì)雙鏈DNA的吸附量；納米金還具有利于電子傳導(dǎo)的特性，進(jìn)而提高電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)。當(dāng)遺傳毒性物質(zhì)與納米DNA傳感器電極表面固定的雙鏈DNA反應(yīng)后，造成雙鏈DNA損傷，用方波伏安法掃描可檢測到DNA鳥嘌呤氧化峰電流值發(fā)生降低，通過反應(yīng)前后電流的百分比率可以判斷樣品是否具有遺傳毒性。本發(fā)明所用的帶氨基基團(tuán)的納米金溶液合成方法簡單，采用油胺作為還原劑還原氯金酸生成帶有氨基基團(tuán)的納米金溶液。通過控制油胺與氯金酸的的用量比，本發(fā)明所制得的帶有氨基基團(tuán)納米金粒徑為15±3nm，見圖3。
本發(fā)明中納米DNA傳感器是利用遺傳毒性物質(zhì)與傳感器電極表面固定的雙鏈DNA反應(yīng)后對(duì)DNA造成損傷的原理。首先將納米DNA傳感器與空白溶液反應(yīng)后，在測試溶液中測得傳感器電極表面固定的雙鏈DNA中鳥嘌呤的氧化峰電流值Sb ;然后再將該傳感器與被測樣品反應(yīng)后，在測試溶液中測得鳥嘌呤氧化峰電流值Ss，對(duì)遺傳毒性物質(zhì)毒性效應(yīng)的大小用Ss和Sb的百分比率來衡量，用以下公式表示S%= (Ss/Sb) XlOO將本發(fā)明的傳感器用于檢測具有遺傳毒性效應(yīng)的物質(zhì)2-氨基蒽。圖2所示納米DNA傳感器與不同濃度的2-氨基蒽標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)后的方波伏安法掃描圖，隨著2-氨基蒽濃度的增大，DNA鳥嘌呤氧化峰的電流不斷降低。線性回歸方程為SV0 = -0. 0628x+82. 772，(r = 0. 966)，濃度的線性響應(yīng)范圍為50nM I. 25 X 103nM，檢測下限為10nM，見圖4。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性回歸方程可對(duì)未知濃度的2-氨基蒽進(jìn)行檢測。同理，可用于檢測別的遺傳毒性物質(zhì)。另外，本發(fā)明中該納米DNA傳感器可用于檢測環(huán)境樣品是否具有遺傳毒性，根據(jù)信噪比I : 10，得出納米DNA傳感器判斷環(huán)境樣品是否有遺傳毒性的標(biāo)準(zhǔn)，即S%> 85%認(rèn)為不具有遺傳毒性；S%< 85%判斷具有遺傳毒性，環(huán)境樣本檢測操作流程圖見圖5。下面介紹本發(fā)明一種用于檢測遺傳毒性物質(zhì)的納米DNA傳感器和檢測方法，包括以下步驟一、一種用于檢測遺傳毒性物質(zhì)的納米DNA傳感器的制備，包括以下步驟I、制備帶氨基基團(tuán)的納米金溶液(I)取濃度為ImM的氯金酸溶液90mL與濃度為ImM的油胺ImL混合，磁力攪拌加熱到80°C保持5min,l. 2X 104g離心,棄去上清,所得沉淀即為帶氨基基團(tuán)的納米金；(2)往沉淀加入超純水IOmL洗滌，I. 2 X IO4g離心后，重復(fù)超純水洗滌2次，溶于IOmL超純水中即得到帶氨基基團(tuán)的納米金溶液。2、制備納米金膜修飾的金電極
(I)金電極表面分別經(jīng)0.3 iim、0. 05 Uma-Al2O3打磨，每一步均用雙蒸水超聲波洗凈；(2)在室溫環(huán)境中，將經(jīng)打磨和清洗潔凈后的金電極，插入帶氨基基團(tuán)的納米金溶液中I小時(shí)，使帶氨基基團(tuán)的納米金在金電極表面自動(dòng)分散組裝成納米金膜，然后用5mL雙蒸水輕柔沖洗，氮?dú)獯蹈?，即得到納米金膜修飾的金電極。3、用納米金膜修飾的金電極吸附和固定雙鏈DNA (I)將納米金膜修飾的金電極插入含有10 U g/mL小牛胸腺雙鏈DNA的0. 25M的醋酸(pH4. 75)溶液中；(2)在三電極系統(tǒng)下(納米金膜修飾的金電極為工作電極、甘汞電極為參比電極 和鉬絲電極為輔助電極)，給予電壓+0. 5V保持5min,用5mL雙蒸水輕柔沖洗,晾干后備用，即制得用于檢測遺傳毒性物質(zhì)的納米DNA傳感器。二、一種檢測遺傳毒性物質(zhì)的方法，包括以下步驟在三電極系統(tǒng)下(納米DNA傳感器為工作電極、甘汞電極為參比電極和鉬絲電極為輔助電極)，電化學(xué)測試方法采用方波伏安法掃描，測試參數(shù)為步電勢15mV，脈沖幅度40mV，頻率200Hz。測試液為5mL濃度為0. 25M的醋酸(pH4. 75)含IOmM KCl溶液。所有實(shí)
驗(yàn)步驟都在室溫操作。I、滴加空白溶液(濃度為0. 25M的醋酸溶液，pH為4. 75)8 ii L到納米DNA傳感器的表面，反應(yīng)lOmin，用方波伏安法在測試液中掃描測得納米DNA傳感器上所固定的雙鏈DNA中鳥嘌呤的氧化峰電流值，記作Sb ;然后用5mL雙蒸水沖洗。2、滴加待檢測樣品溶液8 ii L于同一納米DNA傳感器表面,反應(yīng)IOmin,用方波伏安法在測試液中掃描測得納米DNA傳感器上所固定的雙鏈DNA中鳥嘌呤的氧化峰電流值，記作Ss;3、計(jì)算Ss與Sb的百分比率S% = (Ss/Sb) X 100，S%的值與待測的某一遺傳毒性物質(zhì)濃度成反比，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線可定量檢測未知濃度的該遺傳毒性物質(zhì)。4、對(duì)于環(huán)境樣品的檢測是否具有遺傳毒性(I)環(huán)境樣本經(jīng)過前處理。(2)采用上述相同的電化學(xué)測試方法、條件和參數(shù)，測得納米DNA傳感器與空白溶液反應(yīng)后的Sb和與樣品反應(yīng)后的Ss,計(jì)算s%。(3)結(jié)果判斷，根據(jù)信噪比I : 10，S%> 85%認(rèn)為不具有遺傳毒性；S%< 85%判斷具有遺傳毒性。


圖I納米DNA傳感器制備中固定雙鏈DNA于電極材料表面的原理圖。采用三電極系統(tǒng)，納米金膜修飾的金電極為工作電極、甘汞電極為參比電極和鉬絲電極為輔助電極，這三支電極都插入含10 u g/mL小牛胸腺雙鏈DNA的0. 25M的醋酸(pH4. 75)溶液中，在電化學(xué)工作站控制下給予正電壓，可加速將溶于醋酸溶液中的雙鏈DNA吸附于金電極表面；并且納米金膜中帶氨基基團(tuán)的納米金帶有正電荷，可靜電吸附帶負(fù)電的雙鏈DNA，從而使得雙鏈DNA不易脫落。圖2納米DNA傳感器與不同濃度的2_氨基蒽標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)后，在濃度為0. 25M的醋酸(pH4. 75)含IOmM KCl的測試液中的方波伏安法掃描圖2_氨基蒽0nM(曲線a)、200nM(曲線 b)、400nM(曲線 c)、600nM(曲線 d)、800nM(曲線 e)。圖3帶氨基基團(tuán)的納米金透射電鏡圖。由圖所示，納米金顆粒平均粒徑大小為15±3nm。圖4納米DNA傳感器鳥嘌呤氧化峰電流值改變的百分比率(S% )與2_氨基蒽濃度的線性回歸圖。圖5納米DNA傳感器分析環(huán)境樣品是否有遺傳毒性的流程圖。環(huán)境樣品經(jīng)前處理后，納米DNA傳感器先與空白溶液反應(yīng)后測得電極上雙鏈DNA鳥嘌呤的氧化峰電流值Sb，然后再將納米DNA傳感器與被測樣品反應(yīng)后測得鳥嘌呤氧化峰電流值Ss，計(jì)算S% = (Ss/Sb) X 100 ;根據(jù)信噪比I : 10，S%> 85%認(rèn)為不具有遺傳毒性，S%< 85%判斷具有遺傳
毒性?！?br> 具體實(shí)施例方式實(shí)施例I 用于檢測遺傳毒性物質(zhì)的納米DNA傳感器I、制備帶氨基基團(tuán)的納米金溶液(I)取濃度為ImM的氯金酸溶液90mL與濃度為ImM的油胺ImL混合，磁力攪拌加熱到80°C保持5min,l. 2X 104g離心,棄去上清,所得沉淀即為帶氨基基團(tuán)的納米金；(2)往沉淀加入超純水IOmL洗漆，I. 2 X IO4g離心后，重復(fù)超純水洗滌2次，溶于IOmL超純水中即得到帶氨基基團(tuán)的納米金溶液。2、納米金膜修飾的金電極(I)金電極表面分別經(jīng)0. 3 ii m、0. 05 ii ma-Al2O3打磨，每一步均用雙蒸水超聲波洗凈；(2)在室溫環(huán)境中，將經(jīng)打磨和清洗潔凈后的金電極，插入帶氨基基團(tuán)的納米金溶液中I小時(shí)，使帶氨基基團(tuán)的納米金在金電極表面自動(dòng)分散成納米金膜，然后用5mL雙蒸水輕柔沖洗，氮?dú)獯蹈桑吹玫郊{米金膜修飾的金電極。3、納米金膜修飾的金電極吸附和固定雙鏈DNA (I)納米金膜修飾的金電極插入含有10 U g/mL小牛胸腺雙鏈DNA的0. 25M的醋酸(pH4. 75)溶液中；(2)在三電極系統(tǒng)下(納米金膜修飾的金電極為工作電極、甘汞電極為參比電極和鉬絲電極為輔助電極)，給予電壓+0. 5V保持5min，用5mL雙蒸水輕柔沖洗，即制得用于檢測遺傳毒物的納米DNA傳感器，晾干后備用。實(shí)施例2利用實(shí)施例I制備的納米DNA傳感器檢測2-氨基蒽電化學(xué)測試方法采用在三電極系統(tǒng)下(以納米DNA傳感器為工作電極、鉬絲電極為輔助電極、飽和甘汞電極電極為參比電極)，方波伏安法檢測電極上雙鏈DNA鳥嘌呤氧化峰電流，測試參數(shù)為步電勢15mV，脈沖幅度40mV，頻率200Hz。測試液為5mL濃度為0. 25M的醋酸(PH4. 75)含IOmM KCl溶液。所有實(shí)驗(yàn)步驟都在室溫操作。I.用雙蒸水配制濃度梯度為0. InM 10 ii M的標(biāo)準(zhǔn)品2_氨基蒽溶液。
2.滴加空白溶液(濃度為0. 25M的醋酸溶液，pH為4. 75)8 y L到納米DNA傳感器的表面，反應(yīng)lOmin，用方波伏安法在測試液中掃描測得納米DNA傳感器上所固定的雙鏈DNA中鳥嘌呤的氧化峰電流值，記作Sb ;然后用5mL雙蒸水輕柔沖洗。3.滴加一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)品2-氨基蒽溶液8 ii L于該工作電極表面，同一納米DNA傳感器表面，反應(yīng)lOmin，用方波伏安法在測試液中掃描測得納米DNA傳感器上所固定的雙鏈DNA中鳥嘌呤的氧化峰電流值，記作Ss04.計(jì)算S%= (Ss/Sb) X 100，根據(jù)標(biāo)品2-氨基蒽濃度與辦在一定范圍內(nèi)成反比，繪制標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線，可對(duì)未知濃度的2-氨基蒽進(jìn)行檢測進(jìn)行定量測定。實(shí)施例3 利用實(shí)施例I制備的納米DNA傳感器檢測環(huán)境水樣是否具有遺傳毒性I.水樣采集后，先用濾紙過濾一次去掉泥沙等較粗雜質(zhì)，然后再用0. 45 y m微孔濾器過濾一次去除水中懸浮顆粒物，再用0. 22 y m微孔濾器過濾一次，調(diào)整pH值為3。2.分別用3mL甲醇、3mL水活化平衡Oasis HLB固相萃取小柱；上樣到Oasis HLB萃取小柱上進(jìn)行萃取流速3mL mirT1，用Ilml丙酮洗脫HLB柱，氮吹濃縮至800 y L左右；將800 u L剩余丙酮轉(zhuǎn)移至2mL棕色樣品瓶中，濃縮管壁用Iml丙酮沖洗2遍；用氮?dú)鈱悠菲看蹈?，Iml DMSO溶解。3.水樣分別做三個(gè)濃度梯度的0. 75L、1. 5L和3. OL水濃縮樣，檢測時(shí)記作低、中、
聞濃縮組。4.分別將水樣0. 75L、I. 5L和3. OL濃縮后的非揮發(fā)性有機(jī)提取物各取33 U L，分別用雙蒸水稀釋至lmL，作納米DNA傳感器檢測用。5.按照實(shí)施實(shí)例2中相同的電化學(xué)檢測方法、條件和參數(shù)，測得傳感器與空白溶液反應(yīng)后的sb，再測得傳感器與樣品反應(yīng)后的Ss ；6.計(jì)算出每個(gè)樣品的3%=(&/\)父100，根據(jù)信噪比1 : 10，S%>85%認(rèn)為不具有遺傳毒性；S%< 85%判斷具有遺傳毒性。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測遺傳毒性物質(zhì)的納米DNA傳感器，包括電極材料，其特征在于，在電極材料的表面有經(jīng)帶氨基基團(tuán)的納米金形成的納米金膜修飾，并吸附有雙鏈DNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用于檢測遺傳毒性物質(zhì)的納米DNA傳感器，其特征在于，所述的雙鏈DNA是通過位于電極材料表面的納米金膜中帶氨基基團(tuán)的納米金帶有的正電荷，以靜電吸附方式吸附帶負(fù)電的雙鏈DNA而固定于電極材料的表面。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用于檢測遺傳毒性物質(zhì)的納米DNA傳感器，其特征在于，經(jīng)帶氨基基團(tuán)的納米金形成納米金膜修飾電極材料表面的具體方法是將電極材料的表面分別經(jīng)0. 3 ii m、0. 05 ii m a -Al2O3打磨，每一步均用雙蒸水超聲波洗凈；在室溫環(huán)境中，將經(jīng)打磨和清洗潔凈后的電極材料插入到帶氨基基團(tuán)的納米金溶液中I小時(shí)，使溶液中帶氨基基團(tuán)的納米金在電極材料表面自動(dòng)分散成納米金膜，然后用5mL雙蒸水輕柔沖洗，用氮?dú)獯蹈蓚溆谩?br> 4.根據(jù)權(quán)利要求I或2或3所述的用于檢測遺傳毒性物質(zhì)的納米DNA傳感器，其特征在于，所述的電極材料是金電極。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于檢測遺傳毒性物質(zhì)的納米DNA傳感器，其特征在于，所述的帶氨基基團(tuán)的納米金溶液的制備方法是將濃度為ImM的氯金酸溶液90mL與濃度為ImM的油胺ImL混合,磁力攪拌加熱到80°C保持5min, I. 2X 104g離心,棄去上清,所得沉淀用IOmL超純水洗漆，I. 2 X 104g離心后,重復(fù)超純水洗漆2次后,溶于IOmL超純水中即得到帶氨基基團(tuán)的納米金溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求I至4中任一項(xiàng)所述的用于檢測遺傳毒性物質(zhì)的納米DNA傳感器，其特征在于，納米金膜修飾的電極材料表面吸附并固定雙鏈DNA的具體方法是將納米金膜修飾的電極材料插入含有雙鏈DNA的醋酸溶液中，在三電極系統(tǒng)下，給予電壓+0. 5V保持5min，然后用5mL雙蒸水輕柔沖洗，晾干，即實(shí)現(xiàn)將雙鏈DNA吸附并被固定到納米金膜修飾的電極材料表面。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用于檢測遺傳毒物的納米DNA傳感器，其特征在于，所述的含有雙鏈DNA的醋酸溶液，醋酸溶液的pH值為4. 75濃度為0. 25M，其中雙鏈DNA的濃度為10 u g/mL,所述的雙鏈DNA是小牛胸腺雙鏈DNA。
8.一種用于檢測遺傳毒性物質(zhì)的納米DNA傳感器的制備方法，包括以下步驟 步驟一、制備帶氨基基團(tuán)的納米金溶液取濃度為ImM的氯金酸溶液90mL與濃度為ImM的油胺ImL混合,磁力攪拌加熱到80°C保持5min, I. 2X 104g離心,棄去上清,所得沉淀加入超純水IOmL洗滌，I. 2 X IO4g離心后，重復(fù)超純水洗滌2次，溶于IOmL超純水中即得到帶氨基基團(tuán)的納米金溶液。
步驟二、制備納米金膜修飾的金電極金電極表面分別經(jīng)0. 3 ii m、0. 05 u ma -Al2O3打磨，每一步均用雙蒸水超聲波洗凈；在室溫環(huán)境中，將經(jīng)打磨和清洗潔凈后的金電極，插入步驟一配制的帶氨基基團(tuán)的納米金溶液中I小時(shí)，使帶氨基基團(tuán)的納米金在金電極表面自動(dòng)分散成納米金膜，然后用5mL雙蒸水輕柔沖洗，氮?dú)獯蹈桑吹玫郊{米金膜修飾的金電極。
步驟三將納米金膜修飾的金電極插入含有10 u g/mL小牛胸腺雙鏈DNA的0. 25M的醋酸(pH4. 75)溶液中，在三電極系統(tǒng)下，給予電壓+0. 5V保持5min，用5mL雙蒸水輕柔沖洗，晾干后備用，即制得用于檢測遺傳毒性物質(zhì)的納米DNA傳感器。
9.一種檢測遺傳毒性物質(zhì)的方法，包括以下步驟 (1)滴加空白溶液8ii L到權(quán)利要求I所述的納米DNA傳感器的表面，反應(yīng)lOmin，用方波伏安法在測試液中掃描測得納米DNA傳感器上所固定的雙鏈DNA中鳥嘌呤的氧化峰電流值，記作Sb ;然后用5mL雙蒸水沖洗；所述的空白溶液是濃度為0. 25M的醋酸(pH4. 75)溶液；所述的測試液是濃度為0. 25M的醋酸(pH4. 75)含IOmM KCl的溶液； (2)滴加待檢測樣品溶液8ii L于同一納米DNA傳感器表面,反應(yīng)IOmin,用方波伏安法在測試液中掃描測得納米DNA傳感器上所固定的雙鏈DNA中鳥嘌呤的氧化峰電流值，記作Ss; (3)計(jì)算Ss與Sb的百分比率S%=(Ss/Sb)X100，按以下方法(a)確定遺傳毒性物質(zhì)的濃度和/或含量；或按以下方法(b)判斷是否具有遺傳毒性 (a)S%的值與待測的某一遺傳毒性物質(zhì)濃度成反比，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線定量檢測未知濃度的該遺傳毒性物質(zhì)； (b)根據(jù)信噪比I: 10，S%> 85%認(rèn)為不具有遺傳毒性；S%< 85%判斷具有遺傳毒性。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種納米DNA傳感器及其檢測遺傳毒性物質(zhì)的方法。本方法利用油胺還原氯化金合成了帶氨基基團(tuán)的納米金，能在金電極表面自動(dòng)分散成膜而修飾電極表面，帶氨基基團(tuán)的納米金由于帶正電可通過靜電吸附帶負(fù)電的雙鏈DNA而將其固定于金電極表面，運(yùn)用遺傳毒性物質(zhì)損傷雙鏈DNA使得雙鏈DNA中鳥嘌呤氧化峰電流改變的規(guī)律，可對(duì)遺傳毒性物質(zhì)進(jìn)行檢測。本發(fā)明用透射電鏡表征納米金結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，并以2-氨基蒽為標(biāo)準(zhǔn)品，利用方波伏安法檢測2-氨基蒽的線性范圍為50nM～1.25×103nM，檢測下限為10nM，具有操作簡單、檢測時(shí)間短、可快速判斷環(huán)境樣品是否含有遺傳毒性物質(zhì)等特點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N27/26GK102830146SQ201210306078
公開日2012年12月19日 申請日期2012年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月27日
發(fā)明者夏瑋, 李媛媛, 徐順清 申請人:華中科技大學(xué)