專利名稱：一種枯草芽孢桿菌a16及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物保護(hù)領(lǐng)域，具體涉及一種枯草芽孢桿菌A16及其制備方法與應(yīng) 用。
背景技術(shù)：
玉米大斑病是由子囊菌門球腔菌屬大斑剛毛球腔菌[Setosphaeria turcica(Luttrell) Leonard" Suggs]所引起的以葉部產(chǎn)生大型病斑癥狀為主的玉米病 害，其分布較廣，為害較重，是世界性的病害。在世界各地主要玉米產(chǎn)區(qū)，該病害都有不 同程度的發(fā)生和危害。玉米小斑病是由子囊菌門旋孢腔菌屬異旋孢腔菌[Cochliobolus heterostrophus Drechsler]所引起的溫暖潮濕玉米產(chǎn)區(qū)的重要葉部病害，是國內(nèi)外玉米 上普遍發(fā)生的病害之一。據(jù)估計(jì)，一般中等發(fā)病年份感病品種損失約10% 20%，嚴(yán)重時(shí) 可達(dá)30 % 80%，甚至毀種絕收。 目前，對(duì)玉米大、小斑病的防治主要是農(nóng)業(yè)防治和化學(xué)防治。農(nóng)業(yè)防治主要是通過 栽培抗病品種，但一些品種很容易失去抗病性，所以完全通過抗病品種來實(shí)現(xiàn)防治病害有 一定的難度?；瘜W(xué)藥劑防治雖然能有效的控制病害的發(fā)生和流行，但是長期的使用會(huì)對(duì)非 靶標(biāo)生物產(chǎn)生直接毒害，造成對(duì)環(huán)境污染，嚴(yán)重影響了人類的健康和環(huán)境。因此，尋找新的 無公害方法已成為當(dāng)務(wù)之急，生物防治方法將越來越受到重視。 拮抗內(nèi)生細(xì)菌作為一種重要的生防菌，在植物病害生物防治中起著很重要的作 用。其主要優(yōu)勢(shì)在于(l)細(xì)菌的種類和數(shù)量眾多，在植物根際和地上部大量存在；(2)細(xì)菌 對(duì)病原菌的作用方式較廣，可以通過競爭，拮抗和寄生，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性等方式對(duì)病原菌 產(chǎn)生影響；(3)具有驚人的繁殖速度；(4)許多細(xì)菌存在于植物根際和地上部，對(duì)植物的生 態(tài)環(huán)境較適宜；(5)細(xì)菌大多可以通過人工培養(yǎng)，便于控制，在實(shí)踐中易操作；(6)有些細(xì)菌 不僅能防治病害而且還可以產(chǎn)生增收效應(yīng)。 因此，從甜玉米健康植株內(nèi)篩選獲得對(duì)玉米大、小斑病有拮抗作用的內(nèi)生生防細(xì) 菌菌株，對(duì)于玉米大、小斑病的防治具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種對(duì)玉米大、小斑病菌具有拮抗 作用的枯草芽孢桿菌A16，該菌株可以有效抑制玉米大、小斑病，對(duì)玉米大、小斑病的防治具 有重要意義。 本發(fā)明的另一 目的在于提供上述枯草芽孢桿菌A16的制備方法。 本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供上述枯草芽孢桿菌A16在植物疾病防治中的應(yīng)用。 本發(fā)明通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn) 本發(fā)明枯草芽孢桿菌A16， Bacillus subtilis A16，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏 中心，保藏號(hào)為CCTCC NO :M 209105。 所述枯草芽孢桿菌A16在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上菌落呈乳白色，形狀不規(guī)則，無光澤，不濕潤，邊緣不整齊，菌落直徑0. 5 lcm，表面有皺褶，菌體成直桿狀，大小約 3. lOumXO. 65um，芽孢呈橢圓形。 所述枯草芽孢桿菌A16具有以下生化特性對(duì)玉米大斑病菌、玉米小斑病菌、玉米
彎孢葉斑病菌、棉花黃萎病菌、小麥赤霉病菌、香蕉炭疽病菌和香蕉枯萎病菌有拮抗作用；
其中，枯草芽孢桿菌A16還對(duì)玉米大斑病菌和玉米小斑病菌有平板拮抗作用。 所述枯草芽孢桿菌A16還具有固氮、促進(jìn)植物生長、增強(qiáng)宿主抗逆性等生物學(xué)作用。 本發(fā)明枯草芽孢桿菌A16的制備包括如下步驟 (1)剪取待分離的玉米組織，消毒后用1 % NaClO處理，再用無菌水沖洗； (2)將經(jīng)過表面消毒的玉米組織加無菌水研磨，按照梯度濃度依次稀釋1X102、
1 X 103、 1 X 104倍，分別涂布于NA平板上，置于2『C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； (3)待平板長出菌落后，根據(jù)菌落的形態(tài)特征，挑取單個(gè)菌落，經(jīng)劃線、純化后得到
枯草芽孢桿菌A16， 4。C冰箱保存在NA斜面上。 上述枯草芽孢桿菌的制備方法，優(yōu)選為如下步驟 (1)剪取待分離的玉米組織2g，75X酒精消毒3min后，用1% NaClO處理10min， 再用無菌水沖洗4次，取最后一次沖洗液留做對(duì)照； (2)將經(jīng)過表面消毒的玉米組織加10mL無菌水置于滅菌的研缽中研磨至組織粉 碎，靜置3 10min，按照梯度濃度依次稀釋1 X 102、 1 X 103、 1 X 104倍，分別吸取100 y L涂 布于NA平板上，置于28。C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； (3)待平板長出菌落后，根據(jù)菌落的形態(tài)特征，挑取單個(gè)菌落，經(jīng)劃線、反復(fù)純化 后，得到枯草芽孢桿菌A16，4。C冰箱保存在NA斜面上。 本發(fā)明枯草芽孢桿菌A16用于促進(jìn)植物生長和防治植物病害時(shí)，將該枯草芽孢桿 菌A16接種于玉米苗、棉花苗、小麥苗或香蕉苗后，可獲得對(duì)玉米大斑病、玉米小斑病和玉 米彎孢葉斑病具有抗病力的玉米植株、對(duì)棉花黃萎病具有抗病力的棉花植株、對(duì)小麥霉菌 病具有抗病力的小麥植株或?qū)ο憬短烤也『拖憬犊菸【哂锌共×Φ南憬吨仓辏抑仓甑?生長狀況得到顯著改善。 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果 本發(fā)明枯草芽孢桿菌A16為植物有益內(nèi)生細(xì)菌，對(duì)玉米大、小斑病菌的抑制作用 強(qiáng)，對(duì)多種病原菌具有拮抗作用，抑菌譜廣，環(huán)境安全性好，可應(yīng)用于植物病害的生物防治 中，尤其是對(duì)玉米大、小斑病的防治具有重要意義；本發(fā)明枯草芽孢桿菌A16的培養(yǎng)條件簡 單，容易保存，便于工業(yè)化生產(chǎn)，具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。


圖1為枯草芽孢桿菌A16對(duì)玉米小斑病菌菌絲的抑制作用；
圖2為枯草芽孢桿菌A16對(duì)玉米大斑病菌菌絲的抑制作用； 圖3為枯草芽孢桿菌A16對(duì)玉米彎孢葉斑病菌、小麥赤霉病菌、棉花黃萎病菌和香 蕉枯萎病菌的抑制作用，其中，A為枯草芽孢桿菌A16對(duì)玉米彎孢葉病菌的抑制作用；B為枯 草芽孢桿菌A16對(duì)小麥赤霉病菌的抑制作用；C為枯草芽孢桿菌A16對(duì)棉花黃萎病菌的抑 制作用；D為枯草芽孢桿菌A16對(duì)香蕉枯萎病菌(F0C4)的抑制作用。
具體實(shí)施例方式以下就實(shí)施例來進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何限定。
實(shí)施例1枯草芽孢桿菌A16對(duì)玉米小斑病菌和玉米大斑病菌的平板拮抗作用
枯草芽孢桿菌A16經(jīng)平板對(duì)峙篩選獲得。在馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基PDA (其中加5g/L 蛋白胨，pH值調(diào)節(jié)到6. 5)平板中央接入直徑為5mm的玉米大、小斑病菌菌絲塊，隨后在每 皿對(duì)稱接上三片直徑為5mm的滅菌濾紙片，濾紙片中心距離中央菌絲塊為25mm，最后在每 片濾紙片上接入細(xì)菌培養(yǎng)液10 L，以不接枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液的平板為空白對(duì)照，三次重 復(fù)，置于2『C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d后，測(cè)定抑菌圈半徑，由圖1可見枯草芽孢桿菌A16顯著抑制 玉米小斑病菌的生長，由圖2可見枯草芽孢桿菌A16顯著抑制玉米大斑病菌的生長。
實(shí)施例2枯草芽孢桿菌A16室內(nèi)防效測(cè)定 將經(jīng)0. 1 % NaCIO消毒后的甜玉米種子用拮抗菌株培養(yǎng)液(含菌量為 1.2X109cfu/ml)浸種5h后，播于花盆中(泥土消毒)，每盆播種10粒種子，設(shè)無菌水浸種 為對(duì)照。每處理播種10盆，長至三葉一新時(shí)(21d左右)，噴玉米大、小斑病菌孢子懸浮液， 接種后放置在溫室中培養(yǎng)，在接種病原菌后7d調(diào)查發(fā)病情況。結(jié)果顯示經(jīng)A16菌株處理過 的玉米植株大、小斑病的病情指數(shù)分別比對(duì)照低了 31. 4、46. 3。
實(shí)施例3枯草芽孢桿菌A16對(duì)多種病原菌的拮抗作用 采用平板對(duì)峙法，測(cè)試枯草芽孢桿菌A16對(duì)玉米彎孢葉斑病菌、棉花黃萎病菌、小 麥赤霉病菌、香蕉炭疽病菌和香蕉枯萎病菌5種病原菌的拮抗作用。參照平板對(duì)峙法進(jìn)行 篩選。在馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基PDA(其中加5g/L蛋白胨，pH值調(diào)節(jié)到6. 5)平板中央接入直徑 為5mm的病原菌菌絲塊，在距離病原菌兩側(cè)25mm處，用接種環(huán)劃線接種內(nèi)生細(xì)菌，以只接病 原菌為對(duì)照，于28t:培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d，測(cè)量抑菌帶寬度，每處理重復(fù)3次。結(jié)果見表l以及 圖3。從圖3的圖A中可看到枯草芽孢桿菌A16對(duì)玉米彎孢葉斑病菌的抑制作用；B中可觀 察到枯草芽孢桿菌A16對(duì)小麥赤霉病菌的抑制作用；C中可觀察到枯草芽孢桿菌A16對(duì)棉 花黃萎病菌的抑制作用；D中可觀察到枯草芽孢桿菌A16對(duì)香蕉枯萎病菌4號(hào)小種(F0C4) 的抑制作用。
表1拮抗菌株對(duì)不同病原菌的抑制作用病原菌A16
棉花黃萎菌+++
FOC4++
小麥赤霉菌++++
香蕉炭疽菌++++
玉米彎孢葉斑菌+++ "++"表示抑菌帶為6 8mm ;"+++"表示抑菌帶為8 10mm ;
"++++"表示抑菌帶> 10mm。
權(quán)利要求
一種枯草芽孢桿菌A16，其特征在于所述枯草芽孢桿菌A16，Bacillus subtilis A16，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC NOM 209105。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌A16，其特征在于所述枯草芽孢桿菌A16在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上菌落呈乳白色，形狀不規(guī)則，無光澤，不濕潤，邊緣不整齊，菌落直徑0. 5 lcm，表面有皺褶，菌體成直桿狀，芽孢呈橢圓形。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌A16，其特征在于所述枯草芽孢桿菌A16具有以下生化特性對(duì)玉米大斑病菌、玉米小斑病菌、玉米彎孢葉斑病菌、棉花黃萎病菌、小麥赤霉病菌、香蕉炭疽病菌和香蕉枯萎病菌有拮抗作用。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的枯草芽孢桿菌A16，其特征在于所述枯草芽孢桿菌A16對(duì)玉米大斑病菌和玉米小斑病菌有平板拮抗作用。
5. 權(quán)利要求1所述枯草芽孢桿菌A16的制備方法，其特征在于包括如下步驟(1) 剪取待分離的玉米組織，消毒后用1% NaC10處理，再用無菌水沖洗；(2) 將經(jīng)過表面消毒的玉米組織加無菌水研磨，按照梯度濃度依次稀釋1X102、1 X 103、 1 X 104倍，分別涂布于NA平板上，置于2『C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；(3) 待平板長出菌落后，根據(jù)菌落的形態(tài)特征，挑取單個(gè)菌落，經(jīng)劃線、純化后得到枯草芽孢桿菌A16， 4t:冰箱保存在NA斜面上。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述枯草芽孢桿菌A16的制備方法，其特征在于包括如下步驟(1) 剪取待分離的玉米組織2g，75X酒精消毒3min后，用1% NaClO處理10min，再用無菌水沖洗4次，取最后一次沖洗液留做對(duì)照；(2) 將經(jīng)過表面消毒的玉米組織加lOmL無菌水置于滅菌的研缽中研磨至組織粉碎，靜置3 10min，按照梯度濃度依次稀釋1 X 102、1 X 103、1 X 104倍，分別吸取100 y L涂布于NA平板上，置于2『C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；(3) 待平板長出菌落后，根據(jù)菌落的形態(tài)特征，挑取單個(gè)菌落，經(jīng)劃線、反復(fù)純化后，得到枯草芽孢桿菌A16， 4。C冰箱保存在NA斜面上。
7. 權(quán)利要求1所述枯草芽孢桿菌A16用于防治玉米大斑病、玉米小斑病、玉米彎孢葉斑病、棉花黃萎病、小麥霉菌病、香蕉炭疽病和香蕉枯萎病的用途。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于利用枯草芽孢桿菌A16CCTCC NO. M 209105接種于玉米苗、棉花苗、小麥苗或香蕉苗，獲得對(duì)玉米大斑病、玉米小斑病和玉米彎孢葉斑病具有抗病力的玉米植株、對(duì)棉花黃萎病具有抗病力的棉花植株、對(duì)小麥霉菌病具有抗病力的小麥植株或?qū)ο憬短烤也『拖憬犊菸【哂锌共×Φ南憬吨仓辍?br> 9. 權(quán)利要求1所述的銅綠假單胞菌DIO用于玉米、棉花、小麥或香蕉促長的用途。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的用途，其特征在于利用枯草芽孢桿菌A16CCTCC N0.M209105接種于玉米苗、棉花苗、小麥苗或香蕉苗，可促進(jìn)玉米苗、棉花苗、小麥苗或香蕉苗的生長。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種枯草芽孢桿菌A16，Bacillus subtilis A16，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC NOM 209105。該枯草芽孢桿菌A16在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上菌落呈乳白色，形狀不規(guī)則，無光澤，不濕潤，邊緣不整齊，菌落直徑0.5～1cm，表面有皺褶，菌體成直桿狀，芽孢呈橢圓形。本發(fā)明還公開了該枯草芽孢桿菌A16的制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明枯草芽孢桿菌A16抑菌譜廣，可抑制玉米大、小斑病，對(duì)玉米大斑病菌、玉米小斑病菌、玉米彎孢葉斑病菌、棉花黃萎病菌、小麥赤霉病菌、香蕉炭疽病菌和香蕉枯萎病菌也均有較強(qiáng)的拮抗作用，防治效率高，環(huán)境安全性好，具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N1/20GK101698829SQ20091019292
公開日2010年4月28日 申請(qǐng)日期2009年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月30日
發(fā)明者徐立新, 王振中, 董章勇 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)