專利名稱：一種制備s-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備S-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯的方法，屬于生物催化不 對(duì)稱還原制備醫(yī)藥手性中間體技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
S-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯，分子式為C12H1603 ，英文名為ETHYL (S)-2-HYDROXY匿4-PHENYLBUTYRATE, CAS號(hào)125639-64-7。與R-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯相對(duì)應(yīng)，是一種重要的手性化合物。后者是合成眾多血 管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)普利類藥物的關(guān)鍵手性中間體；而對(duì)S-2-羥基 -4-苯基丁酸乙酯的應(yīng)用正在進(jìn)一步研究中。該類化合物的制備方法主要有拆分法和合成法，其中，拆分法主要包括 化學(xué)拆分和生物拆分，但其最大收率一般不超過50%;合成法主要包括化學(xué) 合成法和生物合成法，其中化學(xué)合成法的收率一般在70~90%，對(duì)映體過量 (ee)值為50~82%,其所用催化劑價(jià)格昂貴，產(chǎn)物的光學(xué)純度也不理想，且一 般需要較髙的氫氣壓力，對(duì)設(shè)備要求較髙。生物催化法具有高效、髙立體選 擇性、反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)得到了研究者的青睞。目前，羥基腈化 酶和脂肪酶是最為普遍和最為常用的生物催化劑，羥基腈化酶是第一個(gè)用于 合成光學(xué)純度的羥腈類化合物的生物催化劑，但該合成過程的第二步是腈基 水解反應(yīng)(J. Biotechnol. 1994， 33: 175-182),劇烈的腈基水解反應(yīng)會(huì)帶來(lái)終 產(chǎn)物消旋、降解和其他一些副反應(yīng)(J. Mol. Catal. B: Enzym. 2003， 24-25: 89-98)。脂肪酶拆分外消旋體是制備光學(xué)純2-羥基-4-苯基丁酸乙酯一個(gè)較為 成功的方法(J. Org. Chem. 1990， 55: 812-815),據(jù)報(bào)道，來(lái)自Psedomonas cepacia中的脂肪酶可在水和有機(jī)溶劑組成的兩相體系中選擇性水解2-羥基 -4-苯基丁酸乙酯的外消旋體，并可通過透析過濾的方法獲得單一光學(xué)純度的 產(chǎn)物(Enzyme Microb. Technol. 2002， 30: 673-681)，然而，就其本質(zhì)而言， 消旋體拆分的最髙理論產(chǎn)量是50%。此外，醇脫氫酶選擇性還原2-氧代-4-苯基丁酸制備其單一光學(xué)異構(gòu)體的方法是一個(gè)重要和具有廣泛應(yīng)用價(jià)值的3生物催化手段，例如，Cha等(Biotechnol. Prog. 2007， 23: 606-612)利用 Enterobacter sp. BK2K中的醇脫氫酶以2-氧代-4-苯基丁酸為底物，偶聯(lián)甲 酸脫氫酶進(jìn)行輔酶NAD+循環(huán)，制備得到S-2-羥基-4-苯基丁酸，然而，其ee 值只有94%，底物濃度也僅為0.1M，催化效率和產(chǎn)物光學(xué)純度不髙。因此，開發(fā)一種高效穩(wěn)定的生物催化制備S-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯的方 法，選擇適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件，最大限度地提髙ee值和底物濃度，具有現(xiàn)實(shí)的積 極意義。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種制備S-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯的方法，以最大 限度地提髙ee值和底物濃度。為達(dá)到上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是 一種制備8-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯的方法，包括如下步驟(1)在溶劑中加入底物、雙羰基還原酶和由甲酸脫氫酶介導(dǎo)的輔酶循環(huán) 再生體系，振蕩反應(yīng)1 18小時(shí)；其中，所述溶劑為有機(jī)溶劑和緩沖液的混合溶液，有機(jī)溶劑和緩沖液的 體積比為1: 9~5: 5，所述有機(jī)溶劑選自乙醇、四氫呋喃、二甲基亞砜、乙 酸乙酯、甲苯和正己垸中的一種或幾種，所述緩沖液的pH值為4~7.5;o所述底物為、^ Q，其中R為H或d"的烷基；底物濃度為0.1-1.5 M;所述雙羰基還原酶的用量為0.5 5U/mL;(2)將步驟(l)得到的產(chǎn)物進(jìn)行分離提純，即得到所述S-2-羥基-4-苯基丁 酸乙酯。上文中，所述雙羰基還原酶是指中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)CN101429514A公開 的雙羰基還原酶，其核苷酸序列與原文中的SEQ ID NO.l具有80。/。以上的 同源性，或者由與SEQ ID NO.2具有80。/。以上的同源性的氨基酸序列組成。 所述由甲酸脫氫酶介導(dǎo)的輔酶循環(huán)再生體系是常規(guī)技術(shù)，通常包括甲酸鹽、輔酶NAD+和甲酸脫氫酶，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)實(shí)際情況選擇合適的 組分和用量。所述底物中的R基為C卜6的直鏈垸基或側(cè)鏈垸基。所述步驟(1) 中的振蕩反應(yīng)的轉(zhuǎn)速一般在100 300rpm，優(yōu)選150 250rpm。所述步驟(2) 的分離提純方法可以是將反應(yīng)體系分離取有機(jī)層，再將水相用有機(jī)溶劑萃 取，合并有機(jī)相，純化后即得到所述產(chǎn)物。進(jìn)一步的技術(shù)方案，所述步驟(l)中的有機(jī)溶劑選自乙醇、二甲基亞砜和 甲苯中的一種或幾種。進(jìn)一步的技術(shù)方案，所述步驟(l)中的緩沖液為磷酸鹽緩沖液或醋酸鹽緩 沖液。該緩沖液的制備均為現(xiàn)有技術(shù)。本發(fā)明的反應(yīng)過程可用如下反應(yīng)式表示:輔酶循環(huán)體系由于上述技術(shù)方案的采用，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1. 本發(fā)明采用了新的雙羰基還原酶，并配合溶劑和輔酶體系的選擇， 催化合成了 S-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯，其光學(xué)純度ee值可達(dá)99.5%,底物 濃度髙達(dá)0.8M以上，具有現(xiàn)實(shí)的積極意義；其中，選擇甲酸脫氫酶介導(dǎo)的 輔酶循環(huán)再生體系、特定的溶劑并規(guī)定緩沖液的pH值，可以有效地與雙羰 基還原酶配合，獲得所需的高光學(xué)純度的產(chǎn)物。2. 本發(fā)明的制備方法簡(jiǎn)單、過程可控，效率極髙，具有良好的應(yīng)用前景。


圖1是本發(fā)明實(shí)施例四中底物轉(zhuǎn)化率與反應(yīng)時(shí)間的關(guān)系曲線圖；圖2是本發(fā)明實(shí)施例一中2-羥基-4-苯基丁酸乙酯消旋體對(duì)照品手性高效液相色譜圖；圖3是本發(fā)明實(shí)施例一中R-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯消旋體對(duì)照品手性 髙效液相色譜圖；圖4是本發(fā)明實(shí)施例一中S-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯消旋體對(duì)照品手性 高效液相色譜圖。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述 實(shí)施例一一種制備S-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯的方法，包括如下步驟在l ml的 反應(yīng)體系中，依次加入甲酸鈉208 mg (2M)， 2-氧代-4-苯基丁酸乙酯0.1-1.5 M, 0.1 M (pH-6.0)磷酸鉀緩沖液，NAD+20 pi (0.5 mM)，甲酸脫氫酶40^U (4 U/ml)，雙羰基還原酶上清100 pi (5 U/ml),最后加入甲苯200 在常溫、 振蕩速度為200rpm條件下反應(yīng)18小時(shí)，停止反應(yīng)后，分離提純，樣品進(jìn)行 髙效液相色譜分析底物轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物光學(xué)純度。在底物濃度小于等于0.8 M時(shí)轉(zhuǎn)化率為95.2%,產(chǎn)物S-2-羥基-4-苯基丁 酸乙酯的ee值均為99.5%。上文中，所述雙羰基還原酶可以通過下述方法得到將含有誘導(dǎo)表達(dá)的 雙羰基還原酶的大腸桿菌細(xì)胞用0.1 M (pH-6.0)磷酸鉀緩沖液，按20%的比 例重懸，髙壓破細(xì)胞，12000 rpm離心15~20 min獲得雙羰基還原酶上清， 其酶活力為57 U/ml。所述甲酸脫氫酶可以采用如下方法制備將含有甲酸脫氫酶工程質(zhì)粒的 大腸桿菌菌種于含50 pg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中37'C培養(yǎng)12小時(shí)，制 備種子液，再按5%接種量轉(zhuǎn)接到新鮮的含50 pg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基 中37^C培養(yǎng)1小時(shí)，再加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4小時(shí)，IPTG的終濃度為50 jiM, 4800 rpm離心5 min收集菌體，再將菌體用0.1 M (pH-7.0)磷酸鉀緩沖液按 20%的比例重懸，高壓破細(xì)胞，12000 rpm離心15 20 min獲得甲酸脫氫酶 上清，冷凍干燥，使用時(shí)用蒸餾水配制成55U/ml儲(chǔ)液。2-氧代-4-苯基丁酸乙酯的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物純度用反相C18柱(5 jun，64.6x250 mm, Shimadzu， Japan)進(jìn)行高效液相(Shimadzu 2010A HT， Japan) 分析，流動(dòng)相為A泵水(含0.1%三氟乙酸)，B泵乙腈(含0.1%三氟乙酸)， 25-90%的梯度洗脫時(shí)間為14 min，流速為lml/min，柱溫為40'C ，檢測(cè)波 長(zhǎng)220 urn;出峰順序依次為S-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯(10.4 min)， 2-氧代 -4-苯基丁酸乙酯(12.2 min)。產(chǎn)物的對(duì)映體過量值(ee值)用手性液相色譜柱Chiralcel OD-RH (5 jim， 150x4.6 mm， Daicel, USA)進(jìn)行分析，流動(dòng)相為A泵水(含0.1%三氟乙酸)， B泵乙腈(含0.1%三氟乙酸)，30~40%的梯度洗脫時(shí)間為25 min， 40%B保 留5min，流速為0.5 ml/min,柱溫為25",檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm。出峰順序依 次為S-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯(21.2 min)， R-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯(23.S miii)，參見附圖2~4所示。產(chǎn)物S-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯ee值的計(jì)算ee (%) = l(Cs-CR)/ (Cs+CR)xl00%底物轉(zhuǎn)化率計(jì)算轉(zhuǎn)化率(100%) = l-C/CQxl00%產(chǎn)物得率計(jì)算 得率(100%) = Ns/Nnxl00%式中Cs為反應(yīng)后S-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯的濃度，CR為反應(yīng)后R-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯的濃度；C為反應(yīng)后剩余底物2-氧代-4-苯基丁酸乙酯 的濃度，Co為反應(yīng)前底物2-氧代-4-苯基丁酸乙酯的濃度；Ns為純化后產(chǎn)物 S-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯物質(zhì)的量，Nn為反應(yīng)投入底物2-氧代-4-苯基丁酸 乙酯的物質(zhì)的量。實(shí)施例二一種制備S-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯的方法，包括如下步驟在l ml的 反應(yīng)體系中，依次加入甲酸鈉208 mg (2M), 2-氧代-4-苯基丁酸乙酯0.1-1.5 M， 0.1 M (pH-6.0)磷酸鉀緩沖液，NAD+20 pl (0.5 mM)，甲酸脫氫酶40^1 (4 U/ml),雙羰基還原酶上清100 jil (5 U/ml)，最后加入乙醇200 jil，在常溫、 振蕩速度為200rpm條件下反應(yīng)18小時(shí)，停止反應(yīng)后，分離提純，樣品利用 髙效液相色譜分析底物轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物光學(xué)純度。在底物濃度為20 mM時(shí)轉(zhuǎn)化率為99.0%， 50 mM時(shí)轉(zhuǎn)化率僅為47.7%， 產(chǎn)物S-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯的ee值為99.5%。實(shí)施例三一種制備S-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯的方法，包括如下步驟在l ml的 反應(yīng)體系中，依次加入甲酸鈉208 mg (2M), 2-氧代-4-苯基丁酸乙酯0.1-1.5 M， 0.1 M (pH-6.0)磷酸鉀緩沖液，NAD+20 (0.5 mM)，甲酸脫氫酶40pl (4U/ml)，雙羰基還原酶上清100 pl (5 U/ml)，最后加入二甲基亞砜400 pl; 在常溫，振蕩速度為200 rpm條件下反應(yīng)18小時(shí)，停止反應(yīng)后，分離提純， 樣品進(jìn)行高效液相色譜分析底物轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物光學(xué)純度。在底物濃度小于等于1.2 M時(shí)轉(zhuǎn)化率為98.1%, 1.5 M時(shí)轉(zhuǎn)化率降為 74.2°/。。產(chǎn)物ee值為99.5%。實(shí)施例四一種制備S-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯的方法，包括如下步驟在l ml的 反應(yīng)體系中，依次加入甲酸鈉208 mg (2 M), 2-氧代-4-苯基丁酸乙酯164.8 mg (0.8 M)， 0.1 M &11=6.0)磷酸鉀緩沖液，NAD+ 20 pl (0.5 mM)，甲酸脫 氫酶40 (4 U/ml),雙羰基還原酶上清100 jil (5 U/ml),最后加入甲苯200在常溫，200 rpm條件下反應(yīng)，每隔l小時(shí)取樣，乙醇停止反應(yīng)后，用 髙效液相色譜分析底物轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物光學(xué)純度；參見附圖l所示，底物轉(zhuǎn)化 率在反應(yīng)9小時(shí)后達(dá)到恒定，為95.2%,產(chǎn)物的ee為99.5。/。。實(shí)施例五一種制備S-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯的方法，包括如下步驟在50ml的 放大反應(yīng)體系中，依次加入甲酸鈉10.4 g (2 M)，2-氧代-4-苯基丁酸乙酯8.24 g (0.8 M)， 0.1 M (pH-6.0)磷酸鉀緩沖液，NAD+20 jil (0.5 mM),甲酸脫氫 酶2 ml (4 U/ml),雙羰基還原酶上清5 ml (5 U/ml)，最后加入甲苯10ml; 在常溫，200 rpm條件下反應(yīng)9小時(shí)，待反應(yīng)體系分層后取甲苯層，再將水 相用乙酸乙酯萃取三次，合并有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉干燥，過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)有 機(jī)溶劑，減壓濃縮得到油狀產(chǎn)物混合物，產(chǎn)物混合物用95/5乙酸乙酯/石油 醚(v/v)的硅膠層析柱純化，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)洗脫劑得到無(wú)色油狀S-2-羥基-4-苯 基丁酸乙酯，其純度為99%， ee值為99.5。/。，產(chǎn)物收率為88.7%。
權(quán)利要求
1.一種制備S-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)在溶劑中加入底物、雙羰基還原酶和由甲酸脫氫酶介導(dǎo)的輔酶循環(huán)再生體系，振蕩反應(yīng)1～18小時(shí)；其中，所述溶劑為有機(jī)溶劑和緩沖液的混合溶液，有機(jī)溶劑和緩沖液的體積比為1∶9～5∶5，所述有機(jī)溶劑選自乙醇、四氫呋喃、二甲基亞砜、乙酸乙酯、甲苯和正己烷中的一種或幾種，所述緩沖液的pH值為4～7.5；所述底物為 id="icf0001" file="A2009101827360002C1.tif" wi="53" he="20" top= "89" left = "62" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>其中R為H或C1～6的烷基；底物濃度為0.1～1.5M；所述雙羰基還原酶的用量為0.5～5U/mL；(2)將步驟(1)得到的產(chǎn)物進(jìn)行分離提純，即得到所述S-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備S-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯的方法，其特 征在于所述步驟(l)中的有機(jī)溶劑選自乙醇、二甲基亞砜和甲苯中的一種或 幾種。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備S-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯的方法，其特 征在于所述步驟(l)中的緩沖液為磷酸鹽緩沖液或醋酸鹽緩沖液。,其中R為H或d~6的烷基；底
全文摘要
本發(fā)明公開了一種制備S-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯的方法，包括如下步驟(1)在溶劑中加入底物、雙羰基還原酶和由甲酸脫氫酶介導(dǎo)的輔酶循環(huán)再生體系，振蕩反應(yīng)1～18小時(shí)；(2)將步驟(1)得到的產(chǎn)物進(jìn)行分離提純，即得到所述S-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯。本發(fā)明利用了新的雙羰基還原酶，配合溶劑和輔酶體系催化合成了S-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯，其光學(xué)純度ee值可達(dá)99.5％，底物濃度高達(dá)0.8M以上，具有現(xiàn)實(shí)的積極意義。
文檔編號(hào)C12P7/62GK101665811SQ20091018273
公開日2010年3月10日 申請(qǐng)日期2009年9月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月4日
發(fā)明者吳旭日, 陳依軍 申請(qǐng)人:陳依軍