專利名稱：一種不對(duì)稱轉(zhuǎn)化制備(s)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的重組大腸桿菌及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種不對(duì)稱轉(zhuǎn)化制備(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的重 組大腸桿菌及其構(gòu)建方法與其在不對(duì)稱生產(chǎn)(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
(S)-4-氯-3羥基丁酸乙酯(Ethyl 4-chloro-3-hydroxybutanoate， (S)-CHBE)是一種 重要的有機(jī)中間體，可用于很多活性藥物的合成，如他汀類藥物——羥甲基戊二酰 CoA(HMG-CoA)還原酶抑制劑和4-羥基吡啶垸酮(4-hydroxypyrrolidone)等[1]。
以4-氯乙酰乙酸乙酯(4-chloroacetoacetate Ethyl COBE)作為還原反應(yīng)的潛手性底物， 易于合成且價(jià)格低廉，以其為底物進(jìn)行不對(duì)稱還原反應(yīng)獲取(S)-CHBE是非常經(jīng)濟(jì)有效 的制備途徑。
迄今為止關(guān)于COBE不對(duì)稱還原制備手性CHBE己有許多有關(guān)研究報(bào)道。概括起 來主要有化學(xué)法和生物法。化學(xué)法合成的COBE產(chǎn)率低，并且污染大，相比之下生物法 具有更好的發(fā)展前景。
Shimizu等[2'3]用來自S/7ora6o/ow_ycM sfl/附om'co/o^尺C7 4W9的NADPH依賴的 醛基還原酶分別在單一水相體系和水/有機(jī)溶劑兩相體系催化還原COBE制備手性 CHBE，由于應(yīng)用酶催化還原反應(yīng)所用的酶要從微生物細(xì)胞中分離純化得到，過程操作 繁瑣且酶容易失活，與全細(xì)胞催化相比，應(yīng)用較少。Yasohara等[4]從400株酵母菌中 篩選得到了一株Cflm/Wamagno/Zae，在水/乙酸正丁酯體系中，在添加葡萄糖、NADP和 葡萄糖脫氫酶以及反應(yīng)過程中控制pH值的條件下，產(chǎn)物(S)-CHBE在有機(jī)相的積累濃 度可達(dá)90g/L，產(chǎn)物的光學(xué)純度對(duì)映體過量值(enantiomeric excess e.e)達(dá)到96%。由 于采用野生酵母中往往含有多種能夠催化COBE為不同構(gòu)型CHBE的還原酶，因此催 化所獲得的產(chǎn)物的光學(xué)活性往往很低，所以近來的研究著重集中于運(yùn)用重組大腸桿菌不 對(duì)稱合成具有高立體選擇性的(S)-CHBE。
本發(fā)明人在微生物法生產(chǎn)(S)-4-氯-3羥基丁酸乙酯領(lǐng)域做了大量的研究，現(xiàn)已通過 基因組探礦的方式從畢赤酵母中獲得了一條新的能夠催化底物COBE的還原酶基因 (PsCR)，并成功在大腸桿菌(pET-22b-PsCR)中進(jìn)行高活性表達(dá)，經(jīng)過發(fā)酵和催化反應(yīng) 研究，證實(shí)了該羰酰還原酶能夠催化COBE生成(S)-CHBE，并具有高催化活性和嚴(yán)格 的手性選擇性，其酶活高達(dá)32 U/mg，是文獻(xiàn)報(bào)道的兩倍(日本專利中Sl酶活為13.7 U/mg)，水相催化體系中的光學(xué)純度超過99%[5'6]。通過硫酸銨沉淀和DEAE-Sephadex離子交換樹脂對(duì)該酶進(jìn)行分離純化，并對(duì)其生化性質(zhì)進(jìn)行系統(tǒng)地研究，結(jié)果表明來源 于畢赤酵母的PsCR屬于氧化還原酶中的短鏈脫氫酶家族，僅依賴于還原型輔酶 II (NADPH)。其米氏常數(shù)為4.9 mg/mL，對(duì)應(yīng)的最大反應(yīng)速率為337 pmol/mg protein/min， 高于已報(bào)道來源于其它酵母的還原酶。同時(shí)，PsCR對(duì)酮和醛都具有較高的催化活性，特 別是在2或4的位置有氯原子取代基的乙酰乙酸乙酯或者a，p-二酮等m。
然而，以重組的還原酶進(jìn)行催化反應(yīng)，須按化學(xué)劑量添加大量昂貴的輔酶，反應(yīng)方 能持續(xù)進(jìn)行，因此，為了獲得高產(chǎn)量、高純度的(5)-CHBE，需要克隆脫氫酶基因?qū)崿F(xiàn)輔 酶的高效原位再生，以提供高效的輔酶再生循環(huán)體系。
參考文獻(xiàn)
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4Technology, 2009 (DOI: 10.1016/j.biortech.2009,06.014).

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題，是提供一種不對(duì)稱轉(zhuǎn)化制備(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯 的重組大腸桿菌，該菌株在生產(chǎn)(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯過程中不需要外加輔酶。
本發(fā)明還要解決的一個(gè)技術(shù)問題，是提供上述重組大腸桿菌的構(gòu)建方法。
本發(fā)明還要解決的一個(gè)技術(shù)問題，是提供上述重組大腸桿菌在不對(duì)稱轉(zhuǎn)化制備 (S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯中的應(yīng)用。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下
一種不對(duì)稱轉(zhuǎn)化制備(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的重組大腸桿菌，它是導(dǎo)入羰酰還原 酶PsCR(carbonyl reductase from P/cWfl幼》衍s, PsCR)基因和葡萄糖脫氫酶GDH(Glucose dehydrogenase from 5aw77〃s膨卵&"'腦，GDH)基因的大腸桿菌。
上述羰酰還原酶PsCR基因含有849bp堿基，其在Genbank中的收錄號(hào)為 XM—001387250 (http:〃www.ncbi.nlm.nih. gov/entrez/viewer.fcgi val= XM—001387250.1)， 其基因序列如SEQIDNO: l所示。由該基因編碼的羰酰還原酶，包含282個(gè)氨基酸， 其在Genbank中的收錄號(hào)為XP—001387287 ( http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez /viewer.fcgi db=protein&id=126273732)，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
上述葡萄糖脫氫酶GDH基因含有783bp堿基，其在Genbank中的收錄號(hào)為142974 (http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi db=nuccore&id=142974)， 其基因序歹!j如 SEQ ID NO: 3所示。由該基因編碼的葡萄糖脫氫酶，包含261個(gè)氨基酸，其在Genbank 中的收錄號(hào)為 729328 ( http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi db =protein&id=729328)，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 4所示。
上述重組大腸桿菌的構(gòu)建方法方法為克隆羰酰還原酶PsCR基因與葡萄糖脫氫酶 GDH基因，構(gòu)建雙酶耦合表達(dá)載體，并在大腸桿菌中進(jìn)行共表達(dá)，獲得不對(duì)稱轉(zhuǎn)化制 備(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的重組大腸桿菌。
利用上述重組大腸桿菌不對(duì)稱還原制備(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的方法如下
以4-氯乙酰乙酸乙酯為底物，以葡萄糖為輔助底物，以還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷 磷酸磷酸(氧化型輔酶n， NADP)為輔因子，由導(dǎo)入了羰酰還原酶PsCR基因和葡萄 糖脫氫酶GDH基因的重組大腸桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)制備得到(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯。
其中，加入NADP即由葡萄糖脫氫酶還原生成NADPH，并使反應(yīng)循環(huán)進(jìn)行，避免 連續(xù)投加NADPH以降低生產(chǎn)成本。
其中，底物4-氯乙酰乙酸乙酯的初始反應(yīng)濃度為1.5~300g/L，葡萄糖的初始反應(yīng)濃度為0.2 2mol/L，氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸磷酸(氧化型輔酶II， NADP)初始 反應(yīng)濃度為0.05~0.5mmol/L，重組大腸桿菌的用量以濕菌計(jì)為20~200g/L。 其中，所述的反應(yīng)溫度為20 3(TC，反應(yīng)時(shí)間為16 32h。
其中，所述的轉(zhuǎn)化反應(yīng)采用水相體系轉(zhuǎn)化法或有機(jī)溶劑/水雙相體系轉(zhuǎn)化法。所述的 水相體系轉(zhuǎn)化法為濕重組大腸桿菌在pH6 7.5的磷酸緩沖溶液中進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化；所述 的有機(jī)溶劑/水雙相體系轉(zhuǎn)化法為濕重組大腸桿菌在含有pH6~7.5的磷酸緩沖/乙酸正 丁酯的雙相體系中進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化。
有益效果本發(fā)明從pET-22b-PsCR和pET-22b-BmGDH載體中克隆帶有SD序列的 基因片段SD-PsCR和SD-BmGDH，構(gòu)建雙酶耦合表達(dá)載體，將其應(yīng)用于COBE不對(duì)稱 還原制備(S)-CHBE中，取得很好的效果，重組菌(pET-22b-BmGDH-PsCR)中PsCR的酶 活為18U/mg，BmGDH酶活為9U/mg，避免了添加昂貴的純酶和輔酶NADPH，只需添 加輔酶NADP便可以使得輔酶NADPH高效再生，大大降低了生產(chǎn)成本。


圖1為重組質(zhì)粒pET-22b- BmGDH-PsCR構(gòu)建示意圖。
具體實(shí)施例方式
根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí) 施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結(jié)果僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì) 限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。
實(shí)施例l:重組大腸桿菌的構(gòu)建。 1、羰酰還原酶基因的獲取
畢赤酵母尸/cWfl S^(p/似CBS 6054 (購(gòu)于Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) Fungal Biodiversity Centre),培養(yǎng)基YPD (g'U1):酵母提取物10g，蛋白胨20g，葡萄 糖20g，補(bǔ)蒸餾水至1L。
將畢赤酵母P^ 'a CBS 6054接種于5mLYPD液體培養(yǎng)基中30'C培養(yǎng)至對(duì)數(shù)
生長(zhǎng)期，使用基因組DNA提取試劑盒(北京天為生物工程有限公司酵母基因組提取試 劑盒)提取基因組。
構(gòu)建表達(dá)載體所用的引物加設(shè)酶切位點(diǎn)，引物序列如下
上游引物(PsCR-sense含Nde I)為GGATCCTAAGGAGGATATACATATGACCA ACAAC，
下游引物(PsCR-anti含BamHI)為CCGCTCGAGTTACTATGGCGCACAGT，所有引物均由上海申能博彩公司合成。 基因的PCR條件
94 'C變性7 min，按如下參數(shù)循環(huán)30次94 。C變性1 min， 60 。C退火50 s， 72 °C 延伸1.5 min。最后72 。C延伸10min。
凝膠電泳分離純化PCR產(chǎn)物，膠回收PsCR目的基因。將CR目的基因連接到PMD18 T-vector上，成為克隆質(zhì)粒PMD18 T-PsCR，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞， 涂布于氨芐抗性平板。
挑取LB平板上PMD18 T-PsCR重組菌的單菌落，接種到裝有5mLLB液體培養(yǎng)基 的50mL離心管中，37°C， 220rpm下培養(yǎng)8-12小時(shí)。利用博大泰克有限公司的試劑盒 按照其公司提供的操作手冊(cè)進(jìn)行質(zhì)粒抽提。
將構(gòu)建在simple T中的PMD18 T-PsCR分別進(jìn)行BamH I / Xho I雙酶切，膠回收已 雙酶切的目的片段
用BamH I和Xho I對(duì)表達(dá)載體pET-22b進(jìn)行雙酶切，膠回收已雙酶切的目的片段。 將已經(jīng)雙酶切的表達(dá)載體與目的基因GDH用T4連接酶進(jìn)行連接過夜，連接產(chǎn)物 pET-22b-PsCR轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，用質(zhì)粒電泳和酶切篩選鑒定陽性克隆。
2、葡萄糖脫氫酶基因的獲取
巨大芽孢桿菌DSMZ2894 (購(gòu)于German Collection of Microorganisms and Cell Cultures),培養(yǎng)基LB (g七")酵母提取物5g，蛋白胨10g， NaCl 5g/L，補(bǔ)蒸餾水至 1L。
將巨大芽孢桿菌接種于接種于5mLLB液體培養(yǎng)基中37'C培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，使用 基因組DNA提取試劑盒(北京天為生物工程有限公司細(xì)菌基因組提取試劑盒)提取基 因組。
構(gòu)建表達(dá)載體所用的引物加設(shè)酶切位點(diǎn)，引物序列如下
上游引物(GDH-sense含NdeI)為AATTCCATATGTATACAGATTTAAAAGAT, 下游引物(GDH-anti含BamH I)為TATGGATCCCTATTAGCCTCTTC 。 基因的PCR條件
94 。C變性7 min,按如下參數(shù)循環(huán)30次94 。C變性1 min， 60 。C退火50 s, 72 °C 延伸1.5 min。最后72 。C延伸10 min。
凝膠電泳分離純化PCR產(chǎn)物，膠回收BmGDH目的基因。將GDH目的基因連接到 PMD18 T-vector上，成為克隆質(zhì)粒PMD18 T-BmGDH，連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a 感受態(tài)細(xì)胞，涂布于氨芐抗性平板。
7挑取LB平板上PMD18 T-GDH重組菌的單菌落，接種到裝有5mLLB液體培養(yǎng)基 的50mL離心管中，37°C， 220rpm下培養(yǎng)8-12小時(shí)。利用博大泰克有限公司的試劑盒 按照其公司提供的操作手冊(cè)進(jìn)行質(zhì)粒抽提。
將構(gòu)建在simple T中的PMD18 T-BmGDH分別進(jìn)行BamH I/Xho I雙酶切，膠回收 已雙酶切的目的片段
用BamH I和Xho I對(duì)表達(dá)載體pET-22b進(jìn)行雙酶切，膠回收已雙酶切的目的片段。 將已經(jīng)雙酶切的表達(dá)載體與目的基因BmGDH用T4連接酶進(jìn)行連接過夜，連接產(chǎn)
物pET-22b-BmGDH轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，用質(zhì)粒電泳和酶切篩選鑒定陽
性克隆。
3、羰酰還原酶基因與葡萄糖脫氫酶基因的共表達(dá)
PCR擴(kuò)增帶有酶切位點(diǎn)和SD序列的PsCR基因SD-PsCR，引物序列如下 上游引物(GDH-sense含BamI)為GGATCCTAAGGAGGATATACATATGACCA
ACAAC，
下游引物(GDH-anti含XhoI)為CCGCTCGAGTTACTATGGCGCACAGT。 基因的PCR條件
94 。C變性7 min，按如下參數(shù)循環(huán)30次94 。C變性1 min， 60 。C退火50 s， 72 °C 延伸1.5 min。最后72 'C延伸10 min。
用BamH及Xho I分別酶切SD-PsCR和pET-22b-BmGDH (pET-22b-BmGDH為 已構(gòu)建好的羰酰還原酶載體)，分別膠回收已雙酶切的表達(dá)載體和目的片段，將巳雙酶 切的表達(dá)載體pET-22b-BmGDH與SD-PsCR用T4連接酶進(jìn)行連接過夜，將1 OuL的連 接產(chǎn)物pET-22b-BmGDH-PsCR加入100uL的Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，冰上放置 30min， 42。C熱激卯sec，冰上放置2min。加入預(yù)熱的900uLLB培養(yǎng)基。220rpm 37°C lh。 將200uL菌液涂布在含有10(Vg/mL的氨芐青霉素和氯霉素的LB平板上，37""C過夜培 養(yǎng)12—16h。構(gòu)建圖譜見附圖。
實(shí)施例2:酶活的測(cè)定。
挑取重組菌五.co" Rosseta(pET-22b- BmGDH -PsCR)及出發(fā)大腸桿菌Rosseta(DE3) 至含抗生素氮節(jié)青霉素和氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37'C振蕩培養(yǎng)過夜。然后按2% 接種量分別接種到新鮮培養(yǎng)液中，37 'C培養(yǎng)至OD6oo約為0.6時(shí)，加入IPTG至終濃度 O.S腿ol.L-1， 25°C， 220rpm，誘導(dǎo)表達(dá)10h后，離心(4。C， 5000rpm， 15min)，菌泥用 100mM磷酸鉀緩沖(pH7.0)重懸，超聲破碎細(xì)胞(功率300W，超聲5s，間歇5s，共5min)， 離心(4'C， 12000rpm， 15min)，測(cè)定上清中的酶活。測(cè)定PsCR的酶活，酶反應(yīng)體系包括100mM磷酸鉀緩沖液(pH6.0)， 5mMNADPH， 20mM COBE， 30°C， 340nrn處測(cè)定吸光值的下降。酶活定義為每分鐘內(nèi)氧化l[imol NADPH所需要的酶量為一個(gè)酶活單位U。
測(cè)定BmGDH的酶活，酶反應(yīng)體系包括lOOmM磷酸鉀緩沖液(pH6.0)， 5mMNADP， 2M葡萄糖，30°C， 340nm處測(cè)定吸光值的上升。酶活定義為每分鐘內(nèi)還原lnmolNADP 所需要的酶量為一個(gè)酶活單位U。蛋白采用Brandford法進(jìn)行測(cè)定。
結(jié)果顯示，重組菌(pET-22b-BmGDH-PsCR)中PsCR的酶活為18U/mg, BmGDH酶 活為9 U/mg。
實(shí)施例3:重組大腸桿菌五.co"Rosseta (pET22b-BmGDH-PsCR)的發(fā)酵。
挑取重組菌￡.co// Rosseta(pET-22b- BmGDH-PsCR)至含抗生素的LB培養(yǎng)液，37°C 振蕩培養(yǎng)過夜。然后按2 %接種量分別接種到新鮮培養(yǎng)液中，37 。C培養(yǎng)至OD6oo約為0.6 時(shí)，加入IPTG至終濃度0.8mmoH/1， 25°C， 220rpm，誘導(dǎo)表達(dá)10h后，8000rpm， 4 。C離心10min,棄上清，沉淀備用。
實(shí)施例4:
取實(shí)施例3的沉淀用磷酸鉀緩沖(IOO mmol七-l ， pH 6.5)洗漆兩次，稱取lg (干重) 的大腸桿菌菌泥，懸浮于15 mL的pH 6.5磷酸鉀緩沖中。超聲處理細(xì)胞(功率300W， 超聲5s,間歇5s，共5min)，加入葡萄糖200mmol/L， COBE 1.5g/L， NADP 0.005mmol/L， 20°C， 200rpm， 16h。產(chǎn)物(S)-CHBE的產(chǎn)量為1.47g/L，產(chǎn)物的得率為98%，光學(xué)純 度e.e。/。為100% 。輔酶的再生效率TN為1765。
(S)-CHBE的檢測(cè)方法如下，以下實(shí)施例中產(chǎn)物的檢測(cè)方法相同 對(duì)于水相反應(yīng)反應(yīng)結(jié)束后，加入等體積乙酸乙酯，劇烈振蕩10min然后放置兩 小時(shí)，8000rpm離心10min分離有機(jī)層和水層。小心吸取上層乙酸乙酯過有機(jī)膜，加 入內(nèi)標(biāo)，保存測(cè)樣。
對(duì)于水/有機(jī)兩相反應(yīng)反應(yīng)結(jié)束后8000rpm離心10min分離有機(jī)層和水層。小心 吸取上層乙酸乙酯過有機(jī)膜，加入內(nèi)標(biāo)，保存測(cè)樣。
PEG-20M毛細(xì)管柱，內(nèi)標(biāo)物為萘。程序?yàn)闄z測(cè)器FID，溫度21(TC，汽化室溫度 210°C，柱溫150。C，柱頭壓0.03MPa，氫氣0.05MPa，空氣0.1MP^尾吹0.08MPa。用 HPLC對(duì)(S)- 4-氯-3-羥基丁酸乙酯的旋光性進(jìn)行分析(手性柱Chiralcel OB，4.6x250mm; Daicel Chemical Industries,日本)，檢測(cè)條件流動(dòng)相為正己烷正己垸(9:1),波長(zhǎng)214nm， 流量為0.8mL/min， ，R型和S型CHBE的出峰時(shí)間分別為10.5min和11.6min。
實(shí)施例5:取實(shí)施例3的沉淀用磷酸鉀緩沖(IOO mmol七-l ， pH 7.5)洗滌兩次，稱取2g (干重) 的大腸桿菌菌泥，懸浮于15mL的pH7.5磷酸鉀緩沖液中。超聲處理細(xì)胞(功率300W， 超聲5s，間歇5s,共5min)，加入葡萄糖500mmol/L， COBE 20g/L(0、 2、 6、 12h各5g/L )， NADP O.05mmol/L， 25°C， 220rpm， 24h。產(chǎn)物(S)-CHBE的產(chǎn)量為16.8g/L，產(chǎn)物的得 率為84%， e.e大于〉99。/。，輔酶的再生效率TN為2017。
實(shí)施例6:
取實(shí)施例3的沉淀用磷酸鉀緩沖(100mmol丄-l， pH 7.0)洗滌兩次，稱取4g (干重) 的大腸桿菌菌泥，懸浮于50mL的pH7.0磷酸鉀緩沖液中。超聲處理細(xì)胞(功率300W， 超聲5s，間歇5s，共5min)，加入葡萄糖600mmol/L， COBE 35g/L(0、 1、 2、 8、 14h 各7g/L ), NADP0.08mmol/L， 30°C， 240rpm， 28h。產(chǎn)物(S)-CHBE的產(chǎn)量為33.8g/L， 產(chǎn)物的得率為96.6%，光學(xué)純度e.e。/。為100%。輔酶的再生效率TN為2536。
實(shí)施例7:
取實(shí)施例3的沉淀用磷酸鉀緩沖(IOO mmol丄-l， pH 6.0)洗滌兩次，稱取10g (干 重)的大腸桿菌菌泥,懸浮于50mL的pH6.0磷酸鉀緩沖液中。超聲處理細(xì)胞(功率300W， 超聲5s，間歇5s，共5min)，加入葡萄糖1.5mol/L， 50mL乙酸正丁酯(可促進(jìn)COBE 的溶解并解除底物和產(chǎn)物對(duì)酶和細(xì)胞的抑制作用)，加入COBE 100g/L(0、 2、 4、 6、 10 各20g/L )， NADP0.12mmol/L， 20。C， 240rpm， 28h。產(chǎn)物(S)-CHBE的產(chǎn)量為97.5g/L， 產(chǎn)物的得率為97.5%，光學(xué)純度e.e。/。為100%。輔酶的再生效率TN為4877。
實(shí)施例8:
取實(shí)施例3的沉淀用磷酸鉀緩沖(IOO mmol七-l ， pH 6.5)洗滌兩次，稱取5g (干重) 的大腸桿菌菌泥，懸浮于15mL的pH6.5磷酸鉀緩沖液中。超聲處理細(xì)胞(功率300W， 超聲5s，間歇5s，共5min)，加入15mL乙酸正丁酯(可促進(jìn)COBE的溶解并解除底物 和產(chǎn)物對(duì)酶和細(xì)胞的抑制作用)，加入葡萄糖lmol/L， COBE 50g/L(0、 2、 4、 6、 10各 10g/L )， NADP 0.09mmol/L， 20°C， 240rpm， 28h。產(chǎn)物(S)-CHBE的產(chǎn)量為47.5g/L， 產(chǎn)物的得率為95.0%,光學(xué)純度e.e。/。為100%。輔酶的再生效率TN為3168。
實(shí)施例9:
取實(shí)施例3的沉淀用磷酸鉀緩沖(IOO mmol丄-l， pH 6.5)洗滌兩次，稱取20g (干 重)的大腸桿菌菌泥，懸浮于200 mL的pH 6.5磷酸鉀緩沖液中。超聲處理細(xì)胞(功率 300W，超聲5s，間歇5s，共5min)，加入200mL乙酸正丁酯(可促進(jìn)COBE的溶解并 解除底物和產(chǎn)物對(duì)酶和細(xì)胞的抑制作用)，加入葡萄糖2mol/L， COBE 300g/L(0、 2、 4、6、 10各60g/L )， NADP 0.18mmol/L， 25°C， 280rpm， 32h。產(chǎn)物(S)-CHBE的產(chǎn)量為 292.7g/L，產(chǎn)物的得率為97.5%，光學(xué)純度e.e。/。為100%。輔酶的再生效率TN為9760。序 列 表
〈110>南京工業(yè)大學(xué)
南京同凱兆業(yè)生物技術(shù)有限責(zé)任公司
<120〉 一種不對(duì)稱轉(zhuǎn)化制備(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的重組大腸桿菌及其構(gòu)建方法
〈130〉 njut090709
〈160〉 4
<170> Patentln version 3.3
〈210〉 1
〈211〉 849
<212〉 DNA
〈213〉 畢赤酵母(Pichia stipitis CBS 6054)
<220>
〈221> CDS 〈222〉 (1)..(849)
<400〉 1
atg acc aac aac ccg agc atc acc tct cat ate aac get gcc gtg ggt 48 Met Thr Asn Asn Pro Ser lie Thr Ser His lie Asn Ala Ala Val Gly 15 10 15
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gcc aag acg tat ggt gta cgt tgc aga get tat aag tgt aat gtt tea 288 Ala Lys Thr Tyr Gly Val Arg Cys Arg Ala Tyr Lys Cys Asn Val Ser 85 90 95
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ggc acc ata gat ate ttt gtt gcc aat gcc ggt gtt ccc tgg act gaa 384 Gly Thr lie Asp lie Phe Val Ala Asn Ala Gly Val Pro Trp Thr Glu 115 120 125
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816
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849<210> 2 <211〉 282 〈212> PRT
〈213> 畢赤酵母(Pichia stipitis CBS 6054) <400〉 2
Met Thr Asn Asn Pro Ser lie Thr Ser His lie Asn Ala Ala Val Gly 15 10 15
Pro Leu Pro Thr Lys Ala Pro Lys Leu Ala Ser Asn Val Leu Asp Leu 20 25 30
Phe Ser Leu Lys Gly Lys Val Ala Ser lie Thr Gly Ser Ser Ala Gly 35 40 45
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Ala lie Trp Tyr Asn Ser Gin Pro Ala Lys Glu Lys Ala Asp Lys lie 65 70 75 80
Ala Lys Thr Tyr Gly Val Arg Cys Arg Ala Tyr Lys Cys Asn Val Ser 85 90 95Asp Gin Gin Asp Val Glu Thr Thr Val Ala Gin lie Glu Ala Asp Phe 100 105 110
Gly Thr lie Asp lie Phe Val Ala Asn Ala Gly Val Pro Trp Thr Glu 115 120 125
Gly Glu Ser Val Glu lie Asp Asn Phe Asp Ser Trp Lys Lys Val lie 130 135 140
Asp Leu Asp Leu Ser Gly Ala Tyr Tyr Cys Ala His Ala Ala Gly Lys 145 150 155 160
lie Phe Lys Lys Asn Gly Lys Gly Ser Met lie Phe Thr Ala Ser Met 165 170 175
Ser Gly His lie Val Asn lie Pro Gin Phe Gin Ala Pro Tyr Asn Ala 180 185 190
Ala Lys Ala Ala Val Leu His Leu Ser Lys Ser Leu Ala lie Glu Trp 195 200 205
Ala Pro Phe Ala Arg Val Asn Thr lie Ser Pro Gly Tyr lie Val Thr 210 215 220Glu lie Ser Asp Phe Val Ser Asp Asp lie Lys Ser Lys Trp Trp Gin 225 230 235 240
Phe lie Pro Leu Gly Arg Glu Gly Val Thr Gin Glu Leu Val Gly Ala 245 250 255
Tyr Leu Tyr Phe Ala Ser Asp Ala Ser Thr Tyr Thr Thr Gly Ser Asp 260 265 270
Leu lie Val Asp Gly Gly Tyr Cys Ala Pro 275 280
<210> 3
〈211〉 783
<212> 腿
<213> 巨大芽孢桿菌(Bacillus subtilis)
<220>
〈221〉 CDS <222> (l).. (783)
<400> 3
atg tat aca gat tta aaa gat aaa gta Met Tyr Thr Asp Leu Lys Asp Lys Val 1 5
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783〈210〉 4 〈211> 261 〈212〉 PRT
〈213> 巨大芽孢桿菌(Bacillus subtilis) <400> 4
Met Tyr Thr Asp Leu Lys Asp Lys Val Val Val lie Thr Gly Gly Ser 15 10 15
Thr Gly Leu Gly Arg Ala Met Ala Val Arg Phe Gly Gin Glu Glu Ala 20 25 30
Lys Val Val lie Asn Tyr Tyr Asn Asn Glu Glu Glu Ala Leu Asp Ala 35 40 45
Lys Lys Glu Val Glu Glu Ala Gly Gly Gin Ala lie lie Val Gin Gly 50 55 60
Asp Val Thr Lys Glu Glu Asp Val Val Asn Leu Val Gin Thr Ala Thr 65 70 75 80
Lys Glu Phe Gly Thr Leu Asp Val Met lie Asn Asn Ala Gly Val Glu 85 90 95
Asn Pro Val Pro Ser His Glu Leu Ser Leu Asp Asn Trp Asn Lys Val100 105 110
lie Asp Thr Asn Leu Thr Gly Ala Phe Leu Gly Ser Arg Glu Ala lie 115 120 125
Lys Tyr Phe Val Glu Asn Asp lie Lys Gly Asn Val lie Asn Met Ser 130 135 140
Ser Val His Glu Met lie Pro Trp Pro Leu Phe Val His Tyr Ala Ala 145 150 155 160
Ser Lys Gly Gly Met Lys Leu Met Thr Glu Thr Leu Ala Leu Glu Tyr 165 170 175
Ala Pro Lys Gly lie Arg Val Asn Asn lie Gly Pro Gly Ala Met Asn 180 185 190
Thr Pro lie Asn Ala Glu Lys Phe Ala Asp Pro Glu Gin Arg Ala Asp 195 200 205
Val Glu Ser Met lie Pro Met Gly Tyr lie Gly Lys Pro Glu Glu Val 210 215 220
Ala Ala Val Ala Ala Phe Leu Ala Ser Ser Gin Ala Ser Tyr Val Thr225 230 235 240
Gly lie Thr Leu Phe Ala Asp Gly Gly Met Thr Lys Tyr Pro Ser Phe 245 250 255
Gin Ala Gly Arg Gly 260
權(quán)利要求
1、一種不對(duì)稱轉(zhuǎn)化制備(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的重組大腸桿菌，其特征在于它是導(dǎo)入羰酰還原酶PsCR基因和葡萄糖脫氫酶GDH基因的大腸桿菌。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的不對(duì)稱轉(zhuǎn)化制備(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的重組大腸桿 菌，其特征在于所述的羰酰還原酶PsCR基因序列如SEQIDNO: 1所示。
3、 構(gòu)建權(quán)利要求1所述的重組大腸桿菌的方法，其特征在于該方法為克隆羰酰 還原酶PsCR基因與葡萄糖脫氫酶GDH基因，構(gòu)建雙酶耦合表達(dá)載體，并在大腸桿菌 中進(jìn)行共表達(dá)，獲得可不對(duì)稱轉(zhuǎn)化制備(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的重組大腸桿菌。
4、 權(quán)利要求1所述的可不對(duì)稱轉(zhuǎn)化制備(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的重組大腸桿菌在 4-氯乙酰乙酸乙酯不對(duì)稱還原制備(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯中的應(yīng)用。
5、 一種生產(chǎn)(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的方法，其特征在于該方法以4-氯乙酰乙酸乙 酯為底物，以葡萄糖為輔助底物，以還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸磷酸為輔因子，由 導(dǎo)入了羰酰還原酶PsCR基因和葡萄糖脫氫酶GDH基因的重組大腸桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng) 制備得到(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的生產(chǎn)(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的方法，其特征在于底物 4-氯乙酰乙酸乙酯的初始反應(yīng)濃度為1.5 300g/L，葡萄糖的初始反應(yīng)濃度為0.2 2mol/L， 氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸磷酸初始反應(yīng)濃度為0.05 0.5mmol/L，重組大腸桿菌的 用量以濕菌計(jì)為20~200g/L。
7、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的生產(chǎn)(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的方法，其特征在于所述的 反應(yīng)溫度為20 3(TC，反應(yīng)時(shí)間為16~32h。
8、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的生產(chǎn)(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的方法，其特征在于所述的 轉(zhuǎn)化反應(yīng)采用水相體系轉(zhuǎn)化法或有機(jī)溶劑/水雙相體系轉(zhuǎn)化法。
9、 根據(jù)權(quán)利要求8所述的生產(chǎn)(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的方法，其特征在于所述的 水相體系轉(zhuǎn)化法為濕重組大腸桿菌在pH6 7.5的磷酸緩沖溶液中進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化；所述 的有機(jī)溶劑/水雙相體系轉(zhuǎn)化法為濕重組大腸桿菌在含有pH6 7.5的磷酸緩沖/乙酸正 丁酯的雙相體系中進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種不對(duì)稱轉(zhuǎn)化制備(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的重組大腸桿菌，它是導(dǎo)入羰酰還原酶基因和葡萄糖脫氫酶基因的大腸桿菌。本發(fā)明還公開了上述重組大腸桿菌的構(gòu)建方法。利用上述重組大腸桿菌制備(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的方法以4-氯乙酰乙酸乙酯為底物，以葡萄糖為輔助底物，以氧化型輔酶II為輔因子，由上述重組大腸桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)得到(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯。本發(fā)明構(gòu)建的重組大腸桿菌中PsCR酶活為18U/mg，BmGDH酶活為9U/mg，避免了添加昂貴的純酶GDH和輔酶NADPH，只需添加輔酶NADP便可以使得輔酶NADPH高效再生，大大降低了生產(chǎn)成本。
文檔編號(hào)C12N1/21GK101613672SQ20091018301
公開日2009年12月30日 申請(qǐng)日期2009年8月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月4日
發(fā)明者明 嚴(yán), 齊 葉, 應(yīng)漢杰, 厚 曹, 柏建新, 健 熊, 琳 許, 勇 陳 申請(qǐng)人:南京工業(yè)大學(xué);南京同凱兆業(yè)生物技術(shù)有限責(zé)任公司