專利名稱：基于顏色的環(huán)介導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄等溫擴(kuò)增技術(shù)檢測人甲型h1n1流感病毒基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是用基于HNB顏色的環(huán)介導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄等溫擴(kuò)增技術(shù)檢測人甲型Hmi流感病 毒HA基因。用于各級疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)，流感檢測網(wǎng)絡(luò)實驗室，哨點醫(yī)院對人甲型Hmi流 感病毒的檢測和監(jiān)測。
背景技術(shù)：
甲型Hmi流感(原稱人感染豬流感病毒)是一種新的甲型Hmi病毒引起的急性 呼吸道傳染病，具有較強(qiáng)的傳染性，可通過近距離飛沫和接觸傳播，這種新型病毒是美國于 2009年4月在人體中首次檢出的。目前，甲型Hmi流感疫情已在全球較大范圍內(nèi)傳播，世 界衛(wèi)生組織已將流感大流行預(yù)警級別提至5級。截止2009年5月21日，世界衛(wèi)生組織共接 到41個國家累計報告甲型Hmi流感確診病例11034例，死亡85人。我國內(nèi)地累計報告甲 型Hmi流感確診病例5例(北京2例，四川、山東、廣東各1例)，均為輸入性病例。鑒于我 國已出現(xiàn)輸入型甲型Hmi流感病例，為有效阻止疫情的傳入和發(fā)生疫情后的應(yīng)急處置，根 據(jù)衛(wèi)生部應(yīng)對甲型Hmi流感疫情防控要求，我國已決定在各地增加病毒檢測實驗室和哨 點醫(yī)院，擴(kuò)大監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)的覆蓋范圍。將網(wǎng)絡(luò)實驗室擴(kuò)大到整個地市一級，目標(biāo)是使全國300 多個地市都具備能夠進(jìn)行病毒檢測的能力，及早發(fā)現(xiàn)可能出現(xiàn)的輸入性病例和內(nèi)地人傳人 病例，切實做到早發(fā)現(xiàn)、早報告、早處置。本專利成功建立的基于顏色的RT-LAMP檢測人甲 型Hmi流感病毒基因方法，將為提高我國流感監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)實驗室和哨點醫(yī)院的監(jiān)測能力，實 現(xiàn)對發(fā)熱病人的快速篩查提供了有力的技術(shù)保障?；陬伾腞T-LAMP技術(shù)在RNA病毒的檢測方面應(yīng)該有著傳統(tǒng)基因診斷方法無法 比擬的優(yōu)勢，與一些常規(guī)的基因檢測手段相比，該技術(shù)在可操作性和檢測時間及設(shè)備要求 方面具有更大的優(yōu)勢。這主要體現(xiàn)在以下幾個方面。首先，它的檢測時間可以縮短到兩小時 以內(nèi)，靈敏度可達(dá)到檢測十個拷貝以上的病毒核酸分子。除了應(yīng)用一些常用聚合酶外，對硬 件設(shè)備基本無特殊要求，在普通的生物實驗室就可完成這項檢測工作。在試驗實施中只需 一步就可完成實驗操作，減少了污染機(jī)會并方便了實驗過程中的質(zhì)控工作。第二，該技術(shù)省 略了單獨的逆轉(zhuǎn)錄和巢式PCR的二次擴(kuò)增步驟，加之?dāng)U增反應(yīng)在65°C等溫條件下進(jìn)行，沒 有核酸的變復(fù)性過程，不但節(jié)省了大量的時間又減少了 RNA酶和擴(kuò)增核酸的污染機(jī)會。第 三，擴(kuò)增反應(yīng)只有在六條引物完全與識別的靶序列中八個結(jié)合區(qū)匹配的情況下才能順利進(jìn) 行，所有這些特性都在很大程度上減少了擴(kuò)增反應(yīng)的背景，從而使檢測特異性得到改善。第 四，RT-LAMP的擴(kuò)增反應(yīng)中可以形成可視的焦磷酸鎂白色沉淀，HNB染料在擴(kuò)增前加入，因 此肉眼也可觀察到陽性反應(yīng)管中的白色混濁物和反應(yīng)管內(nèi)顏色的變化，可以直接判定檢測 結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容
1.本發(fā)明是對目前對RNA病毒檢測技術(shù)手段的改進(jìn)和補(bǔ)充，它具有安全、特異、靈 敏、便捷的優(yōu)勢。這主要體現(xiàn)在以下幾個方面。首先，擴(kuò)增反應(yīng)只有在六條引物完全與識別的靶序列中八個結(jié)合區(qū)匹配的情況下才能順利進(jìn)行，所有這些特性都在很大程度上減少了 擴(kuò)增反應(yīng)的背景，從而使檢測特異性得到改善。第二，該技術(shù)省略了單獨的逆轉(zhuǎn)錄和巢式 PCR的二次擴(kuò)增步驟，只需一步就可完成實驗操作，沒有核酸的變復(fù)性過程，減少了 RNA酶 和擴(kuò)增核酸的污染機(jī)會，提高了檢測的敏感性和安全性。第三，所有的擴(kuò)增過程都可在65°C 同溫下完成，無需PCR儀，降低了對實驗硬件的要求。第四，較RT-PCR縮短了檢測所需的時 間。2.選擇人甲型Hmi流感HA基因的756-956位的相對保守區(qū)設(shè)計相應(yīng)的RT-LAMP 引物，其中包括兩條外引物(F3、B3)和兩條內(nèi)引物(FIP、BIP)，兩條環(huán)結(jié)合引物(Loopl、 Loop2)。所有引物的具體序列見表1。表1 :RT-LAMP檢測人甲型Hmi流感HA基因的引物序列 3.建立了如下的檢測過程，詳見如下(1)合成探針使用北京英杰生命技術(shù)有限公司合成儀合成并純化。 (2)將待測標(biāo)本按Qiagen公司的病毒RNA提取試劑盒步驟處理，獲得樣本的RNA。(3) RT-LAMP 反應(yīng)。(4)陽性反應(yīng)結(jié)果用肉眼可觀察到白色沉淀和顏色從紫色變成天藍(lán)色，也可用 650nm的吸光值判定
具體實施例方式實施方案1 基于顏色的RT-LAMP檢測人甲型Hmi流感的特異性按Qiagen試劑盒說明提取不同來源和亞型的流感病RNA。建立如下擴(kuò)增反應(yīng)體 系1μ1 RNA 樣品、2. 5 μ IBst DNA 聚合酶緩沖液(10X)、1 μ 1 Bst DNA 聚合酶(8U/μ L)、 1 μ 1 AMV 反轉(zhuǎn)錄酶(lOU/μ L)、2· 5μ ldNTP(lOmmo 1/L)、8μ 1 Betaine (250mmol/L)、1 μ 1 MgSO4 (150mmo 1/L)Uy 1 HNB (3mmol/L)，對應(yīng)于HA基因的六條引物各1 μ 1 (引物濃度為F3 與 Β3 :5pmol/ μ L、BIP 與 FIP :40pmol/ μ L、Loop-l 與 Loop-2 :20pmol/ μ L)、1 μ 1 dH20o 混勻，65°C，水浴1. 5h，85°C，2min終止反應(yīng)，，觀察顏色變化和白色沉淀。只有此次流行的人 甲型Hmi流感病毒有特異性擴(kuò)增。實施方案2 基于顏色的RT-LAMP檢測人甲型Hmi流感病毒的靈敏度系列稀釋純化和定量后的體外轉(zhuǎn)錄的人甲型Hmi流感HA全基因的RNA至10，20， 40，60，80，100，1000和10000拷貝，RT-LAMP檢測的體系同實施方案1。檢測的靈敏度可達(dá) 到60拷貝RNA的水平。實施方案3 基于顏色的RT-LAMP檢測人甲型Hmi流感病毒的結(jié)果可用肉眼(觀 察顏色變化和白色沉淀)或比色值判定RT-LAMP反應(yīng)完成后，用肉眼觀察顏色的變化和管底的白色沉淀，也可取20 μ 1測 定650nm的吸收值。陽性反應(yīng)管用肉眼可在管底觀察到白色沉淀，管內(nèi)顏色從反應(yīng)前的紫 色變成了反應(yīng)后的天藍(lán)色，650nm的吸光值彡0. 31。
權(quán)利要求
一種用于人甲型H1N1流感病毒HA基因檢測的基于HNB顏色的環(huán)介導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄等溫擴(kuò)增技術(shù)(RT LAMP)，其中包括用于人甲型H1N1流感病毒HA基因檢測的6條寡核苷酸引物和HNB(羥基萘酚藍(lán))染料。
2.權(quán)力要求1所述的人甲型Hmi流感病毒檢測的環(huán)介導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄等溫擴(kuò)增技術(shù) (RT-LAMP)的引物包括表1所列的基因序列及其每種序列的互補(bǔ)序列或變體。
3.權(quán)力要求1所述的人甲型Hmi流感病毒檢測的環(huán)介導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄等溫擴(kuò)增技術(shù) (RT-LAMP)包括人甲型Hmi流感病毒及其變異株。
4.權(quán)力要求3所述的本發(fā)明的應(yīng)用范圍包括各級疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)，流感檢測網(wǎng)絡(luò)實 驗室，哨點醫(yī)院用于人甲型Hmi流感病毒HA基因的檢測和監(jiān)測。
5.權(quán)力要求1所述的人甲型Hmi流感病毒HA基因檢測的基于HNB顏色的環(huán)介導(dǎo)逆轉(zhuǎn) 錄等溫擴(kuò)增技術(shù)(RT-LAMP)的反應(yīng)程序和檢測程序。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，涉及各級疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)，流感檢測網(wǎng)絡(luò)實驗室，哨點醫(yī)院等用于對發(fā)熱病人咽拭子等標(biāo)本的人甲型H1N1流感病毒HA基因的檢測和監(jiān)測。具體是應(yīng)用基因顏色的環(huán)介導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄等溫擴(kuò)增技術(shù)(RT-LAMP)，通過計算機(jī)軟件分析人甲型H1N1流感病毒HA基因的保守序列，設(shè)計出六條引物完全與識別的HA靶序列中八個結(jié)合區(qū)匹配，省略了單獨的逆轉(zhuǎn)錄和巢式PCR的二次擴(kuò)增步驟，反應(yīng)前加入HNB(羥基萘酚藍(lán))染料，只需一步就可完成在65℃等溫環(huán)境中擴(kuò)增1.5小時，最后用肉眼觀察顏色變化和管底的白色沉淀判定檢測結(jié)果，與傳統(tǒng)的RT-PCR方法比較，它具有更安全、特異、靈敏、便捷的優(yōu)勢。
文檔編號C12Q1/68GK101899529SQ200910143718
公開日2010年12月1日 申請日期2009年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月26日
發(fā)明者李德新, 聶凱, 舒躍龍, 董小平, 馬學(xué)軍 申請人:中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所