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低分子量葡聚糖、其制備方法及用途的制作方法

文檔序號(hào):574675閱讀:321來源:國(guó)知局

專利名稱::低分子量葡聚糖、其制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
:本發(fā)明涉及一種低分子量葡聚糖、所述低分子量葡聚糖的制備方法及其用途。
背景技術(shù)
:黃芪(i^AxJWraga/M)是豆科植物膜莢黃芪或蒙古黃芪的干燥根,味甘、性溫,歸肺、脾經(jīng),是重要的益氣中藥。黃芪多糖是其主要有效成分之一,現(xiàn)代藥理研究證明,黃芪多糖具有提高人體免疫功能、抗腫瘤、抗輻射損傷、調(diào)節(jié)血糖、抗衰老等作用(張小梅.黃芪多糖的免疫調(diào)節(jié)作用及抗腫瘤作用研究進(jìn)展.大連大學(xué)學(xué)報(bào),2003,24(6):101-104;包文奇,呂美,王志祥.黃芪多糖的藥理研究進(jìn)展.河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2005,(4):78-80)。目前對(duì)黃芪多糖的研究主要集中在分子量較大的多糖上(李鵬飛,杜海燕,趙孟春.黃芪多糖的化學(xué)和免疫學(xué)研究.上海畜牧獸醫(yī)通訊,2005,(5):4-6;單俊杰,王順春,劉滌,胡之璧.黃芪多糖的化學(xué)和藥理研究進(jìn)展.上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2000,14(3):61-65),而對(duì)低分子量多糖的研究幾乎處于空白。
發(fā)明內(nèi)容為解決上述的黃芪中低分子量多糖的研究處于空白的技術(shù)問題,本發(fā)明從黃芪中分離純化獲得一種低分子量葡聚糖,經(jīng)化學(xué)分析和光譜分析相結(jié)合的方法確定出其化學(xué)結(jié)構(gòu),并通過藥理實(shí)驗(yàn)證明該類結(jié)構(gòu)的葡聚糖具有明顯的免疫增強(qiáng)活性,可應(yīng)用于藥品或保健食品中。因此,本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種低分子量葡聚糖,其特征在于,其是從黃芪中分離得到的。所述低分子量葡聚糖的重均分子量為4010,其僅由葡萄糖組成,不含蛋白質(zhì)和核酸。發(fā)明人將該葡聚糖命名為MAPS-1-W3-1G。MAPS-1-W3-1G具有如下通式(l)所示的重復(fù)單元a—D—Glc1a—D—Glc1^a-D-Glc、、a—D-Glcl(、a—D—Glc、4一『D-Glc^其中x+y=ll。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供該低分子量葡聚糖的制備方法,為采用柱層析的分離純化方法制備。所述方法可包括如下步驟a.取黃芪多糖,溶解、離心,上清液透析并濃縮,得到濃縮物;b.取濃縮物,溶解、離心,上清液用陰離子交換樹脂或離子交換凝膠柱層析進(jìn)行初步分離,將所得流分分別濃縮、透析并干燥,得到若干組分;c.繼續(xù)用凝膠柱反復(fù)層析上述組分,得到純化的低分子量葡聚糖。其中,b步驟中所述的陰離子交換樹脂可以選自DEAE-CelluloseDE52、DEAE-CelluloseDE32、CM-CelluloseCM52或CM-CelluloseCM32,優(yōu)選DEAE-CelluloseDE52;所述的離子交換凝膠柱可以選自DEAESepharoseF.F.、CMSepharoseF.F.、DEAESepharoseCL-6B或CMSepharoseCL-6B;而c步驟中所述的凝膠柱可以選自SephadexG25、SephadexG50、S印hadexG75、SephadexG100、SephacrylS-100HR、SephacrylS-200HR、SephacrylS-300HR、SephacrylS-400HR、ToyopealHW-40、Toyopeal鼎-50、ToyopealHW-55、Superdex30、Superdex75、Superdex200、Superdex6或Superdex12,優(yōu)選自SephadexG25、SephadexG50、SephadexG75或SephadexG100,最優(yōu)選SephadexG50。由于通過藥理實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明從黃芪中分離得到的低分子量葡聚糖具有明顯的免疫增強(qiáng)活性,因此,本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供所述的低分子量葡聚糖在制備免疫增強(qiáng)及腫瘤輔助治療藥物或保健食品中的應(yīng)用。本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種藥物組合物或保健食組合物,其由所述的低分子量葡聚糖和藥學(xué)上或食品學(xué)上可接受的賦形劑組成。圖1為低分子量葡聚糖MAPS-1-W3-1G在高效凝膠色譜柱上的色譜圖;圖2為低分子量葡聚糖MAPS-1-W3-1G的單糖組成分析結(jié)果;圖3為低分子量葡聚糖MAPS-1-W3-1G的紫外掃描圖譜;圖4為低分子量葡聚糖MAPS-1-W3-1G的^C-NMR譜圖;圖5為低分子量葡聚糖MAPS-1-W3-1G的IR譜圖;圖6為低分子量葡聚糖MAPS-1-W3-1G的甲基化分析結(jié)果。具體實(shí)施方式實(shí)施例1:黃芪多糖分離純化(1)黃芪多糖(MAPS)按專利楊義芳,許海燕,黃春躍.一種精制黃芪多糖的方法.中國(guó)發(fā)明專利200610024178.5所述方法分離提取,得率為8.37%,純度為85.74%。(2)取(1)中得到的MAPS50g,溶于適量的蒸餾水,5000rpm離心20min,上清液對(duì)水透析(截留分子量3500),透析袋內(nèi)溶液濃縮得到MAPS陽1C12.6g)。(3)取(2)中得到的MAPS-14.0g,分5次,加入10ml蒸餾水溶解,離心,上清液用DEAE-CelluloseDE52柱(OH-型,40x4.Ocm,填料高30cm)層析進(jìn)行初步分離。首先以蒸餾水作為洗脫液,然后用0.01mol/L和O.lmol/L的NaCl溶液洗脫,自動(dòng)部分收集儀分別收集各流分,示差儀和苯酚-硫酸法平行跟蹤檢測(cè),并且根據(jù)檢測(cè)的結(jié)果合并相同流分,經(jīng)濃縮,蒸餾水透析及冷凍干燥得到5個(gè)組分MAPS-1-W1(808.8mg),MAPS-l-W2(383.2mg),MAPS-1-W3(341.8mg),MAPS-l-0.01M(1477.4mg),MAPS-1-0.1M(227.9mg)。(4)組分MAPS-1-0.1M多糖含量較低,棄去。MAPS-1-W1,MAPS-1-W2,MAPS-1-W3部分分別繼續(xù)用SephadexG-50凝膠柱(100x2.6cm,填料高卯cm)反復(fù)層析,MAPS-1-0.01M繼續(xù)用SephacrylS-400HR凝膠柱(100x2.6cm,填料高90cm)反復(fù)層析,分別用蒸餾水洗脫,示差儀和苯酚-硫酸法平行跟蹤檢測(cè),合并流分,冷凍干燥。MAPS-1-W1部分純化得到一個(gè)純葡聚糖MAPS-1-W1-1G(1);MAPS-1-W2部分純化得到兩個(gè)純多糖MAPS-1-W2-1G(2)和MAPS-1-W2陽2G(3);MAPS-1-W3部分純化得到兩個(gè)純多糖MAPS-1-W2-2G(3)禾卩MAPS-1-W3-1G(4);MAPS-1-0.01M部分純化得到一個(gè)純多糖MAPS-1-0.01M-1S(5)。實(shí)施例2:黃芪多糖分離純化(1)黃芪多糖(MAPS)按專利楊義芳,許海燕,黃春躍.一種精制黃芪多糖的方法.中國(guó)發(fā)明專利200610024178.5所述方法分離提取,得率為8.37%,純度為85.74%。(2)取(1)中得到的MAPS50g,溶于適量的蒸餾水,5000rpm離心20min,上清液對(duì)水透析(截留分子量3500),透析袋內(nèi)溶液濃縮得到MAPS-1(12.6g)。(3)取(2)中得到的MAPS-14.0g,分5次,加入10ml蒸餾水溶解,離心,上清液用DEAE-CelluloseDE52柱(OH-型,40x4.Ocm,填料高30cm)層析進(jìn)行初步分離。首先以蒸餾水作為洗脫液,然后用0.01mol/L和0.1moI/L的NaCl溶液洗脫,自動(dòng)部分收集儀分別收集各流分,示差儀和苯酚-硫酸法平行跟蹤檢測(cè),并且根據(jù)檢測(cè)的結(jié)果合并相同流分,經(jīng)濃縮,蒸餾水透析及冷凍干燥得到5個(gè)組分MAPS-1-W1(808.8mg),MAPS-l-W2(383.2mg),MAPS-1-W3(341.8mg),MAPS-1-0,01M(1477.4mg),MAPS-1-0.1M(227.9mg)。(4)組分MAPS-1-0.1M多糖含量較低,棄去。MAPS-1-W1,MAPS-1-W2,MAPS-1-W3部分分別繼續(xù)用ToyopealHW-40F凝膠柱(100x2.6cm,填料高90cm)反復(fù)層析,MAPS-1-0.01M繼續(xù)用ToyopealHW-50F凝膠柱(100x2.6cm,填料高90cm)反復(fù)層析,分別用蒸餾水洗脫,示差儀和苯酚-硫酸法平行跟蹤檢測(cè),合并流分,冷凍干燥。MAPS-1-W1部分純化得到一個(gè)純葡聚糖MAPS-1-W1-1G(1);MAPS-1-W2部分純化得到兩個(gè)純多糖MAPS-1-W2-1G(2)和MAPS-1-W2-2G(3);MAPS-1-W3部分純化得到兩個(gè)純多糖MAPS-1-W2-2G(3)禾PMAPS-1-W3-1G(4);MAPS-1-0.01M部分純化得到一個(gè)純多糖MAPS-1-0.01M-1S(5)。實(shí)施例3:黃芪多糖分離純化7(1)黃芪多糖(MAPS)按專利楊義芳,許海燕,黃春躍.一種精制黃芪多糖的方法.中國(guó)發(fā)明專利200610024178.5所述方法分離提取,得率為8.37%,純度為85.74%。(2)取(1)中得到的MAPS50g,溶于適量的蒸餾水,5000rpm離心20min,上清液對(duì)水透析(截留分子量3500),透析袋內(nèi)溶液濃縮得到MAPS-1(12.6g)。(3)取(2)中得到的MAPS-14.0g,分5次,加入10ml蒸餾水溶解,離心,上清液用DEAESepharoseF.F.柱(40x4.0cm,填料高30cm)層析進(jìn)行初步分離。首先以蒸餾水作為洗脫液,然后用0.01mol/L的NaCl溶液洗脫,自動(dòng)部分收集儀分別收集各流分,示差儀和苯酚-硫酸法平行跟蹤檢測(cè),并且根據(jù)檢測(cè)的結(jié)果合并相同流分,經(jīng)濃縮,蒸餾水透析及冷凍干燥得到5個(gè)組分。將水洗脫得到的四個(gè)組分繼續(xù)分別用SephacrylS-100HR凝膠柱(100x2.6cm,填料高90cm)反復(fù)層析,得到四個(gè)純多糖MAPS-1-W1-1G(1)、MAPS-1-W2-1G(2)、MAPS-1-W2-2G(3)和MAPS-1-W3-1G(4);將0.01mol/LNaCl溶液洗脫得到的組分繼續(xù)用SephadexG-100凝膠柱(100x2.6cm,填料高90cm)反復(fù)層析,得到一個(gè)純多糖MAPS-1-0.01M-1S(5)。實(shí)施例4:黃芪多糖分離純化(1)黃芪多糖(MAPS)按專利楊義芳,許海燕,黃春躍.一種精制黃芪多糖的方法.中國(guó)發(fā)明專利200610024178.5所述方法分離提取,得率為8.37%,純度為85.74%。(2)取(1)中得到的MAPS50g,溶于適量的蒸餾水,5000rpm離心20min,上清液對(duì)水透析(截留分子量3500),透析袋內(nèi)溶液濃縮得到MAPS-1(12.6g)。(3)取(2)中得到的MAPS-14.0g,分5次,加入10ml蒸餾水溶解,離心,上清液用DEAESepharoseCL-6B柱(40x4.0cm,填料高30cm)層析進(jìn)行初步分離。首先以蒸餾水作為洗脫液,然后用0.01mol/L的NaCl溶液洗脫,自動(dòng)部分收集儀分別收集各流分,示差儀和苯酚-硫酸法平行跟蹤檢測(cè),并且根據(jù)檢測(cè)的結(jié)果合并相同流分,經(jīng)濃縮,蒸餾水透析及冷凍干燥得到5個(gè)組分。將水洗脫得到的四個(gè)組分繼續(xù)分別用Superdex30凝膠柱(100x2.6cm,填料高90cm)反復(fù)層析,得到四個(gè)純多糖MAPS-1-W1-1G(1)、MAPS-1-W2-1G(2)、MAPS-1-W2-2G(3)禾口MAPS-1-W3-1G(4);將0.01mol/LNaCl溶液洗脫得到的組分繼續(xù)用Superdex6凝膠柱(100x2.6cm,填料高90cm)反復(fù)層析,得到一個(gè)純多糖MAPS-1-0.01M-1S(5)。實(shí)施例5:低分子量葡聚糖MAPS-1-W3-1G的化學(xué)結(jié)構(gòu)的鑒定葡聚糖MAPS-1-W3-1G,經(jīng)高效凝膠色譜柱色譜(PolySep-GFC-P200,300x7.8mm),譜圖出現(xiàn)單一對(duì)稱峰(圖1),表明純度已達(dá)到對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)、藥理研究的要求,同時(shí)測(cè)定其重均分子量為4010,經(jīng)氣相色譜圖分析(圖2),MAPS-1-W3-1G僅由葡萄糖組成,為一葡聚糖。經(jīng)紫外掃描圖譜(圖3),MAPS-1-W3-1G在260nm和280nm附近均無蛋白質(zhì)和氨基酸的特征吸收峰,同時(shí)茚三酮反應(yīng)、考馬斯亮藍(lán)反應(yīng)均呈陰性,表明其不含蛋白質(zhì)和核酸。MAPS-1-W3-1G的^C-NMR譜圖中(圖4),端基碳的化學(xué)位移均在103ppm以下,其中94-103ppm信號(hào)峰為C-l信號(hào),表明其構(gòu)型為a構(gòu)型,這與IR譜圖(圖5)分析結(jié)果是一致的。根據(jù)NMR譜峰的歸屬、甲基化分析(圖6)以及高碘酸氧化和Smith降解結(jié)果,證明多糖MAPS-1-W3-1G的一級(jí)結(jié)構(gòu)是具有分支的(1—4)-a-葡聚糖,主鏈上平均約每13個(gè)糖殘基中有2個(gè)糖殘基的C-6位被末端葡萄糖取代,其重復(fù)單元可表示如下a—D—Glca—D—GlcA『D—Glc1)、a—D—Glc~L~(^a—D—Glc13"~^a—D—Glc1x、、x+y=ll實(shí)施例6無菌條件下取低分子量葡聚糖MAPS-1-W3-1G5g,加入注射用水2000ml中,經(jīng)G4漏斗過濾后,分裝滅菌,制得1000支注射液。取低分子量葡聚糖MAPS-1-W3-1G10g,藥用淀粉60g,糊精60g,50%9乙醇適量,將上述原料充分?jǐn)嚢杌旌现瞥深w粒,在60-7(TC干燥2-4小時(shí),制成1000片。實(shí)施例8取低分子量葡聚糖MAPS-1-W3-1G10g,藥用淀粉100g,50%乙醇適量,制粒,整粒,烘干,裝成1000個(gè)膠囊。實(shí)驗(yàn)例l:本發(fā)明化合物MAPS-l-W3-lG在體外對(duì)刀蛋白(ConA)或脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖的影響對(duì)照物為黃芪多糖AG-l、AG-2和A2Nb,其中黃芪多糖AG-1和AG-2按文獻(xiàn)黃喬書,呂歸寶,李雅臣,等.黃芪多糖的研究[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),1982,17(3):200-206所述方法分離純化得到。其中,AG-1為水溶性多糖,結(jié)構(gòu)為a-(1—4)(1—6)-葡聚糖,(1—4)和(1—6)糖苷鍵的糖基組成比例為5:2;AG-2為水不溶性多糖,結(jié)構(gòu)為a-(l—4)-葡聚糖;黃芪多糖A2Nb按文獻(xiàn)王瑩,趙毅民,張起鳳,等.黃芪中一種新葡聚糖的分離純化與化學(xué)結(jié)構(gòu)研究[J].中草藥,2001,32(11):962-964所述方法分離純化得到。A2Nb的平均分子量為3.6X105,主要連接方式為a-(1—4)-D-Glc,在每25個(gè)葡萄糖中有一個(gè)C-6位上的分支。按照文獻(xiàn)(徐叔云.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)(第三版)[M].北京人民衛(wèi)生出版社,2001,1426-1427;ZhaoC,LiM,LuoYF,etal.IsolationandstructuralcharacterizationofanimmunostimulatingpolysaccharidefromFuziAconitumcarmichaeli[J].CarbohydrateResearch,2006,341(4):485-491)的方法,將小鼠脾細(xì)胞懸液點(diǎn)于96孔培養(yǎng)板上,每孔lOO)iL,設(shè)一個(gè)對(duì)照組,再加入50|aL的ConA或LPS(終濃度為2.5(ig/mL或10|_ig/mL),最后加入不同量的多糖樣品(終濃度為10,50,100pg/mL),每孔培養(yǎng)液補(bǔ)足為200jiL。將細(xì)胞培養(yǎng)板置于含有5%C02,37。C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。72h后,加入MTT溶液(5mg/mL)lQ)iL,置于5°/。C02,37。C培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h。取出反應(yīng)物,離心(2000rpm,5min),棄上清,每孔加入15Q(iLDMSO,充分振蕩,待凝塊完全溶解后在酶標(biāo)測(cè)定儀上570nm讀出A值。所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用meaniS.D.表示,測(cè)試樣品與對(duì)照組的顯著性差異與否用t-檢驗(yàn)來評(píng)價(jià)。結(jié)果如表l所示。表lMAPS-l-W3-lG在體外對(duì)ConA或LPS誘導(dǎo)的小鼠脾臟淋巴細(xì)胞<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注與空白比較,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。從上表可以看出葡聚糖MAPS-1-W3-1G具有顯著的促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖活性,且活性較未經(jīng)分離純化的黃芪多糖MAPS以及多糖AG-1、AG-2和A2Nb活性好;而對(duì)于LPS誘導(dǎo)小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng),葡聚糖MAPS-1-W3-1G對(duì)細(xì)胞增殖沒有明顯的影響。權(quán)利要求1、低分子量葡聚糖,其特征在于,其是從黃芪中分離得到的。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的低分子量葡聚糖,其特征在于,其重均分子量為4010。3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的低分子量葡聚糖,其特征在于,其具有如下通式(l)所示的重復(fù)單元<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>其中x+y=ll。4、根據(jù)權(quán)利要求1至3任一所述的低分子量葡聚糖的制備方法,其特征在于,該方法采用柱層析分離純化制得所述低分子量葡聚糖。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法,其特征在于,該方法包括如下步驟a.取黃芪多糖,溶解、離心,上清液透析并濃縮,得到濃縮物;b.取濃縮物,溶解、離心,上清液用陰離子交換樹脂或離子交換凝膠柱層析進(jìn)行初步分離,將所得流份分別濃縮、透析并干燥,得到若干組分;c.繼續(xù)用凝膠柱反復(fù)層析上述組分,得到純化的低分子量葡聚糖。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法,其特征在于,b步驟中所述的陰離子交換樹脂選自DEAE-CelluloseDE52、DEAE-CelluloseDE32、CM-CelluloseCM52或CM-CelluloseCM32,單獨(dú)或混合使用。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法,其特征在于,b步驟中所述的陰離子交換樹脂選自DEAE-CelluloseDE52。8、根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法,其特征在于,b歩驟中所述的離子交換凝膠柱選自DEAESepharoseF.F.、CMSepharoseF.F.、DEAESepharoseCL-6B或CMSepharoseCL-6B,單獨(dú)或混合使用。9、根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法,其特征在于,c步驟中所述的凝膠柱選自SephadexG25、SephadexG50、SephadexG75、SephadexG100、SephacrylS-100HR、SephacrylS-200HR、SephacrylS-300HR、SephacrylS-400HR、ToyopealHW-40、ToyopealHW-50、ToyopealHW-55、Superdex30、Superdex75、Superdex200、Superdex6或Superdex12,單獨(dú)或混合使用。10、根據(jù)權(quán)利要求9所述的制備方法,其特征在于,c步驟中所述的凝膠柱選自SephadexG25、SephadexG50、SephadexG75或SephadexG100。11、根據(jù)權(quán)利要求10所述的制備方法,其特征在于,c步驟中所述的凝膠柱是SephadexG50。12、權(quán)利要求1至3任一所述的低分子量葡聚糖在制備免疫增強(qiáng)及腫瘤輔助治療藥物或保健食品中的應(yīng)用。13、一種組合物,其由權(quán)利要求1至3任一所述的低分子量葡聚糖和藥學(xué)上可接受的賦形劑組成。全文摘要本發(fā)明公開一種低分子量葡聚糖,其特征在于,其是從黃芪中分離得到的。本發(fā)明也公開上述低分子量葡聚糖的分離純化方法。本發(fā)明還公開所述低分子量葡聚糖在制備免疫增強(qiáng)及腫瘤輔助治療藥物或保健食品中的應(yīng)用。文檔編號(hào)A23L1/30GK101676305SQ20091013325公開日2010年3月24日申請(qǐng)日期2009年4月1日優(yōu)先權(quán)日2008年9月16日發(fā)明者楊義芳,林夢(mèng)感申請(qǐng)人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院
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