專利名稱：一菌雙酶生產(chǎn)光學純l-丙氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及L-丙氨酸的生產(chǎn)方法，具體涉及一種用酶法生產(chǎn)L-丙氨酸的方法。
背景技術(shù)：
近年來，手性藥物的研究方興未艾，國內(nèi)有多家生產(chǎn)手性藥物的公司。不 同的手性藥物，表現(xiàn)在藥效、副作用上有很大的差異。L-丙氨酸是一種廣為使 用的藥物手性源，比如生產(chǎn)L-氨基丙醇、VB6、 S-2-氯乙酸、安尿通等。國內(nèi)外企業(yè)在使用L-丙氨酸的過程中，對其光學純度要求越來越高。低光 學純度的L-丙氨酸合成藥物，在使用時發(fā)現(xiàn)療效低、副作用大。因此，研究一 種高光學純度的L-丙氨酸生產(chǎn)工藝勢在必行。國內(nèi)現(xiàn)有寧波科瑞生物工程公司、北京怡康盛達生物技術(shù)有限公司、安徽 省科苑(集團)股份有限公司等多家公司均生產(chǎn)L-丙氨酸產(chǎn)品，產(chǎn)品有食品級和工業(yè)級，生產(chǎn)的方法大都是利用假單胞菌產(chǎn)生的L-天冬氨酸-e-脫羧酶，將L-天冬氨酸轉(zhuǎn)化成L-丙氨酸。南京工業(yè)大學(南京化工大學)開展L-丙氨酸酶法合成的研究較早，利用假單胞菌獲得高活性的L-天冬氨酸-e-脫羧酶，以L-天冬氨酸為底物，采用游離細胞法轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-丙氨酸，平均收率為90%，產(chǎn)品 質(zhì)量達到美國藥典XXIII版標準和日本味之素99版標準；并擁有酶法生產(chǎn)L-丙 氨酸的發(fā)明專利，該技術(shù)可生產(chǎn)得到光學純度的L-丙氨酸；同時成立了國家生 化工程技術(shù)中心，中心擁有年產(chǎn)1000噸L-丙氨酸的生產(chǎn)技術(shù)。大連輕工業(yè)學 院對中空纖維膜反應(yīng)器，利用假單胞菌轉(zhuǎn)化L-天冬氨酸生成L-丙氨酸，轉(zhuǎn)化率 超過90%。中國藥科大學也對L-丙氨酸酶法生產(chǎn)技術(shù)進行了研究，采用循環(huán)式生物反應(yīng)器，利用固定化德阿昆合假單胞菌體的L-天冬氨酸-e-脫羧酶，轉(zhuǎn)化L-天冬氨酸生成L-丙氨酸。已有的文獻及專利有如下報道1、 L-丙氨酸酶法工業(yè)生產(chǎn)的研究在800升氣升式發(fā)酵罐上配有假單胞菌Pse. NX-1 ，獲得高L-天冬氨酸-e -脫羧酶酶活。以L-天冬氨酸為底物游離細胞法轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-丙氨酸，每升培養(yǎng)液 可轉(zhuǎn)化L-天冬氨酸2kg,最高達2. 5kg,提取得到L-丙氨酸1. 2kg，平均收率90%， 產(chǎn)品質(zhì)量達到美國藥典XXIII版標準和日本味之素99版標準。(《工業(yè)微生物》 1997， 27 (2) ， 17-20頁);2、 利用假單胞菌天冬氨酸-e-脫羧酶高效生產(chǎn)L-丙氨酸 通過右邊篩選得到一株具有高活性l-asp- e -脫羧酶的菌株P(guān)seudomonasNX-1，對該株酶形成和酶反應(yīng)的條件進行了詳細的研究，該株可以 高效地轉(zhuǎn)化L-Asp生成L-Ala,轉(zhuǎn)化4-5d，每L培養(yǎng)液可轉(zhuǎn)化L-Asp量高達1400g 左右，生成L-Ala濃度高達90。/。以上，摩爾轉(zhuǎn)化率近100%。(《南京化工學院學 報》1995， 17 (1) ， 1-6頁)；3、 游離細胞法與固定化細胞法生產(chǎn)L-丙氨酸的比較利用假單胞菌的L-天冬氨酸-e -脫羧酶從L-天冬氨酸為底物生產(chǎn)L-丙氨酸， 具有2種方法， 一種為游離細胞法，另一種為固定化細胞法。該文比較這2種方 法的生產(chǎn)工藝、轉(zhuǎn)化率、提取收率和生產(chǎn)成本后得出結(jié)論采用游離細胞法生產(chǎn) L-丙氨酸優(yōu)于固定化細胞法。(《工業(yè)微生物》1998, 28 (1) ， 38-39， 44頁)；4、 D-天冬氨酸及L-丙氨酸的制備方法(《中國專利》申請(專利)號02138553. X; 公開(公告)號CN1405317;公開(公告)日2003.03.26)該制備方法是培養(yǎng)假單胞菌屬微生物，產(chǎn)生高活力的L-天冬氨酸e -脫羧酶，采用游離細胞法，將含酶細胞或培養(yǎng)液和DL-天冬氨酸或DL-天冬氨酸鹽的 溶液混合，32'C-45'C下進行酶反應(yīng)，然后用等電點結(jié)晶結(jié)合離子交換樹脂法分 離反應(yīng)生成物，得到高化學純度和光學純度的D-天冬氨酸和L-丙氮酸。5、 中空纖維膜反應(yīng)器轉(zhuǎn)化L-天冬氨酸生成L-丙氨酸 采用中空纖維膜反應(yīng)器，利用假單胞菌P. dacunhaeDQ-pl轉(zhuǎn)化L-天冬氨酸生成L-丙氨酸，最適PH6. 0，最適溫度30°C ， EDTA和Tween-80對細胞產(chǎn)酶有促進 作用，游離細胞半衰期為93h。采用對流擴散式中空纖維膜反應(yīng)器轉(zhuǎn)化L-天冬氨 酸生成L-丙氨酸，轉(zhuǎn)化率超過90%。(《食品與發(fā)酵工業(yè)》2003， 29 (1) ， 32-35 頁)；6、用循環(huán)式生物反應(yīng)器酶法生產(chǎn)L-丙氨酸
用固定化德阿昆合假單胞(Pseudomonas dacunhae)菌體的L-天冬氨酸e-脫羧酶，在新設(shè)計的生物反應(yīng)器中轉(zhuǎn)化L-天冬氨酸生成L-丙氨酸。該反應(yīng)器能 不斷緩慢溶解固體L-天冬氨酸，使反應(yīng)系統(tǒng)的pH和底物濃度維持恒定。用80g 固定化菌體為酶源，在69h內(nèi)能將4.2kgL-天冬氨酸全部轉(zhuǎn)化生成L-丙氨酸，且 僅消耗較少的PLP和氨水。(《藥物生物技術(shù)》1997， 4 (4) ， 212-215頁)。 由上可知，現(xiàn)有的酶法生產(chǎn)L-丙氨酸的研究及生產(chǎn)報道， 一般是利用假單 胞菌產(chǎn)生L-天冬氨酸-e -脫羧酶，轉(zhuǎn)化L-天冬氨酸生成L-丙氨酸，此法生產(chǎn)的 產(chǎn)品光學純度較低， 一般《95%，且生產(chǎn)環(huán)節(jié)多，成本高。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一菌雙酶生產(chǎn)光學 純L-丙氨酸的方法，采用該方法生產(chǎn)的L-丙氨酸，其光學純度及收率高、生產(chǎn)
環(huán)節(jié)簡化，成本低。
本發(fā)明為實現(xiàn)其目的所采取的技術(shù)方案包括搖瓶種子培養(yǎng)和發(fā)酵。本發(fā)明利 用一種假單胞菌產(chǎn)生兩種酶L-天冬氨酸酶和L-天冬氨酸-e-脫羧酶，以富馬 酸銨鹽為底物，直接生成L-丙氨酸，通過改變體系反應(yīng)條件，加入L-丙氨酸消 旋酶抑制劑，得到光學純度的L-丙氨酸。
L-天冬氨酸酶
■CCH=CHC00NH4--^CHfCH-C00H + C02 t
L-天冬氨酸-e-脫羧酶I
NH2
底物富馬酸銨鹽 產(chǎn)物L-丙氨酸
種子培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件(質(zhì)量百分比，以下同)富馬酸0.8 1.2%，蛋白胨 0. 8 1. 2%，菌玉米漿0. 6 0. 8%，硫酸鎂(MgS04 7H20) 0. 01 0. 03%,磷酸二 氫鉀(KH2P04 ) 0. 01 0. 02%， 余量為純凈水，用氨水調(diào)pH值至6. 0 8. 0;培 養(yǎng)溫度29±2°C;發(fā)酵培養(yǎng)基谷氨酸鈉1.0 2.0%，蛋白胨1.0 1.2%，玉米漿0.6 0.8%， 硫酸鎂0. 01 0. 02%,磷酸二氫鉀(KH2P04) 0. 01 0. 03%,余量為純凈水，用氨水 調(diào)pH值至6. 0 8. 0;
發(fā)酵培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度29士2。c，通風比i: 2，罐壓0.05MPa。
具體技術(shù)參數(shù)
① 種子培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件富馬酸1.0%，蛋白胨1.0%,玉米漿0.8%，硫 酸鎂0.02%，磷酸二氫鉀0.01%,余量為純凈水，用氨水調(diào)pH值至7.0。在 1000ml三角瓶中分裝250ML培養(yǎng)基，接種后用搖床在29±2°C條件下培養(yǎng)24小 時。
② 發(fā)酵培養(yǎng)基谷氨酸鈉2.0%，蛋白胨1.0%，玉米漿0.8%，硫酸鎂0.02%, 0.01%磷酸二氫鉀，余量為純凈水，用氨水調(diào)pH值至7.0。
③ 發(fā)酵培養(yǎng)條件定容后，12lt滅菌15分鐘，冷卻后將培養(yǎng)好的種子液按 1%接種量接種培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度29士2t，通風比l: 2，罐壓0.05MPa，培養(yǎng)過程 測定菌體生長OD值、pH值和酶活力。
④ 轉(zhuǎn)化條件
轉(zhuǎn)化溫度50。C，轉(zhuǎn)化pH值6.5。
⑤ 離心條件
轉(zhuǎn)化溫度50"C，轉(zhuǎn)化pH值6.5。
⑥ 提取條件 脫色溫度70°C。
⑦ 干燥條件
干燥溫度90°C，干燥時間15分鐘。
本發(fā)明的有益效果L-丙氨酸是一種具有光學活性的氨基酸，主要用于生產(chǎn) L-氨基丙醇、(S) -2-二氯乙酸。本發(fā)明減少整個L-天冬氨酸生產(chǎn)環(huán)節(jié)及設(shè)備投 資，減輕環(huán)境污染；L-丙氨酸收率高，光學純度>99.99%，滿足特殊要求廠家對 高光學純度L-丙氨酸的需求。
具體實施例方式
本發(fā)明先進行無菌培養(yǎng)得到一級種子，再到發(fā)酵罐進行擴大培養(yǎng)產(chǎn)酶，在反 應(yīng)罐進行轉(zhuǎn)化，然后離心、脫色、過濾、濃縮、結(jié)晶、離心、干燥，產(chǎn)品化驗合 格后入庫。
實施例1
配種子液1000ml,種子液配比(質(zhì)量百分比，以下同)富馬酸1.0%，蛋 白胨1.0%，玉米漿0.8%,硫酸鎂0.02%，磷酸二氫鉀0.01%，余量為純凈水， 用氨水調(diào)PH值至7. 0。分裝在5只1000ml三角瓶滅菌后，30°C接種斜面，搖床 培養(yǎng)15h，搖床轉(zhuǎn)速為90r/min,接種100L發(fā)酵液，發(fā)酵液配比為谷氨酸鈉2. 0%， 蛋白胨1.0%，玉米漿0.8%，硫酸鎂0. 02%,磷酸二氫鉀0. 01%，余量為純凈水， 用氨水調(diào)pH值至7.0。發(fā)酵培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度29土2。C，通風比l: 2，罐壓 0. 05MPa，培養(yǎng)26h。取發(fā)酵液配制500L轉(zhuǎn)化液，加入富馬酸銨鹽25g,轉(zhuǎn)化溫度 50°C，轉(zhuǎn)化PH值6.5。 70。C脫色，90°C干燥。得到產(chǎn)品21. 24kg，產(chǎn)品光學純度 》99. 95%.
實施例2
配種子液2000ml,種子液配比為富馬酸1.2%，蛋白胨1.1%，玉米漿0.9%， 硫酸鎂0. 03%,磷酸二氫鉀0. 02%，余量為純凈水，用氨水調(diào)pH值至7.0。分裝 在10只1000ml三角瓶滅菌后，30°C接種斜面，搖床培養(yǎng)18h，搖床轉(zhuǎn)速為 100r/min,接種100L發(fā)酵液，發(fā)酵液配比為谷氨酸鈉2.2%，蛋白胨1.1%，玉米 漿0.9%，硫酸鎂0.03%，磷酸二氫鉀0.02%,余量為純凈水，用氨水調(diào)pH值至 7.0。發(fā)酵培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度29土2U通風比l: 2，罐壓0.05MPa，培養(yǎng)28h。 取發(fā)酵液配制500L轉(zhuǎn)化液，加入富馬酸銨鹽25g,轉(zhuǎn)化溫度55°C，轉(zhuǎn)化PH值6. 8。 8(fC脫色，100°C干燥。得到產(chǎn)品20. 22kg，產(chǎn)品光學純度》99. 95%.
實施例3
配種子液800ml，種子液配比為富馬酸0.8%，蛋白胨0.8%,玉米漿0. 6%，硫酸鎂0. 01%，磷酸二氫鉀0. 01%，余量為純凈水，用氨水調(diào)pH值至7.0。分裝 在4只1000ml三角瓶滅菌后，30"C接種斜面，搖床培養(yǎng)14h，搖床轉(zhuǎn)速為110r/min, 接種100L發(fā)酵液，發(fā)酵液配比為谷氨酸鈉1.8%，蛋白胨0.9%，玉米漿0.6%, 硫酸鎂0. 01%,磷酸二氫鉀0. 01%，余量為純凈水，用氨水調(diào)pH值至7.0。發(fā)酵 培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度29±2°(]，通風比l: 3，罐壓0.05MPa，培養(yǎng)20h。取發(fā)酵 液配制500L轉(zhuǎn)化液，加入富馬酸銨鹽25g，轉(zhuǎn)化溫度45°C，轉(zhuǎn)化PH值6. 0。 60°C 脫色，80°C干燥。得到產(chǎn)品20. Olkg，產(chǎn)品光學純度》99. 95%. 本發(fā)明的優(yōu)點如下
(1) 利用一種微生物(假單胞桿菌)產(chǎn)生兩種酶，即L-天冬氨酸酶和L-天門 冬氨酸-P -脫羧酶，利用全細胞作為催化劑生產(chǎn)光學純L-丙氨酸。
(2) 利用該種微生物，以富馬酸銨鹽為底物，直接生產(chǎn)光學純L-丙氨酸。
(3) 通過改變體系反應(yīng)條件，加入抑制L-丙氨酸消旋酶活性的物質(zhì)，生產(chǎn)的 產(chǎn)品光學純度》99. 99%。
本發(fā)明與國內(nèi)外同類技術(shù)主要區(qū)別在于
(1) 本技術(shù)只需要培養(yǎng)一種微生物，產(chǎn)生兩種酶，而國內(nèi)外同類技術(shù)利用兩種 微生物，分別產(chǎn)生兩種酶。
(2) 本技術(shù)反應(yīng)物直接使用富馬酸銨鹽作為原料，而國內(nèi)外同類技術(shù)利用L-天門冬氨酸作為原料。
(3沐技術(shù)生產(chǎn)的產(chǎn)品光學純度》99. 99%,而國內(nèi)外同類技術(shù)生產(chǎn)的產(chǎn)品光學 純度《95%。
(4)其它由于本技術(shù)使用一菌雙酶技術(shù)，與國內(nèi)外同類技術(shù)相比減少了 生產(chǎn)過程，節(jié)約設(shè)備投資，減少環(huán)境污染，降低了生產(chǎn)成本。
權(quán)利要求
1、一菌雙酶生產(chǎn)光學純L-丙氨酸的方法，包括搖瓶種子培養(yǎng)和發(fā)酵，其特征在于a、利用一種假單胞菌產(chǎn)生兩種酶L-天冬氨酸酶、L-天冬氨酸-β-脫羧酶，以富馬酸銨鹽為底物，加入L-丙氨酸消旋酶抑制劑，得到光學純度的L-丙氨酸；b、種子培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件(質(zhì)量百分比)富馬酸0.8～1.2％，蛋白胨0.8～1.2％，菌玉米漿0.6～0.8％，硫酸鎂0.01～0.03％，磷酸二氫鉀0.01～0.02％，余量為純凈水，用氨水調(diào)pH值至6.0～8.0；培養(yǎng)溫度29±2℃；c、發(fā)酵培養(yǎng)基(質(zhì)量百分比)谷氨酸鈉1.0～2.0％，蛋白胨1.0～1.2％，玉米漿0.6～0.8％，硫酸鎂0.01～0.02％，磷酸二氫鉀0.01～0.03％，余量為純凈水，用氨水調(diào)pH值至6.0～8.0；發(fā)酵培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度29±2℃，通風比1∶2，罐壓0.05MPa。
全文摘要
本發(fā)明公開了一菌雙酶生產(chǎn)光學純L-丙氨酸的方法，包括搖瓶種子培養(yǎng)和發(fā)酵，利用一種假單胞菌產(chǎn)生兩種酶L-天冬氨酸酶和L-天冬氨酸-β-脫羧酶，以富馬酸銨鹽為底物，直接生成L-丙氨酸，通過改變體系反應(yīng)條件，加入L-丙氨酸消旋酶抑制劑，得到光學純度的L-丙氨酸。本發(fā)明減少整個L-天冬氨酸生產(chǎn)環(huán)節(jié)及設(shè)備投資，減輕環(huán)境污染；L-丙氨酸收率高，光學純度≥99.99％，滿足特殊要求廠家對高光學純度L-丙氨酸的需求。
文檔編號C12P13/06GK101580864SQ200910117048
公開日2009年11月18日 申請日期2009年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月11日
發(fā)明者唐思青, 張曉斌, 蔣光玉, 黃建坡 申請人:安徽華恒生物工程有限公司