專利名稱：一種提高肉蓯蓉培養(yǎng)細(xì)胞苯乙醇糖甙含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用超聲波提高滇肉蓯蓉培養(yǎng)細(xì)胞苯乙醇糖甙含量的方法。
背景技術(shù)：
肉蓯蓉(。^te/ c/ e 6feser"coh Y.- C. Ma)為列當(dāng)科肉蓯蓉屬多年生高等寄生植物，其味甘咸微辛酸、微溫，在《神農(nóng)百草經(jīng)》中列為上品，具有補(bǔ)中、入肝、益精、滋腎、壯陽等功效。肉蓯蓉中的化學(xué)成分非常復(fù)雜，目前已經(jīng)從中分離鑒定出40余種，主要的活性成分是苯乙醇糖甙類化合物(Phenylethanoid Glycosides, PeG)，主要包括海膽甙、麥角甾甙、乙酰麥角甾甙和肉蓯蓉甙A，有調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、促進(jìn)代謝、清除自由基和抗衰老等藥用功效。由于長期無節(jié)制的濫采亂挖，肉蓯蓉的野生資源破壞嚴(yán)重，市場上供需矛盾凸顯。而利用植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)在反應(yīng)器中直接培養(yǎng)細(xì)胞獲得藥用次生代謝產(chǎn)物是將來生產(chǎn)植物藥最直接、最有效的手段。開展細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)來生產(chǎn)藥用次生代謝產(chǎn)物，首先要獲得一種能快速提高培養(yǎng)細(xì)胞有效藥用成分含量的方法，以保證高效的生產(chǎn)效率，縮短生長周期，降低生產(chǎn)成本。
超聲波在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)診斷治療上的應(yīng)用已經(jīng)有幾十年歷史，前人的一些研究結(jié)果表明低強(qiáng)度的超聲波刺激能夠影響細(xì)胞的生長，使細(xì)胞膜和細(xì)胞器的形態(tài)發(fā)生變化，這些變化可導(dǎo)致細(xì)胞代謝和膜通透性的改變。己有許多研究表明超聲波能夠提高酶以及微生物細(xì)胞在反應(yīng)器中的生物轉(zhuǎn)化效率，但是生物反應(yīng)過程中超聲波的影響機(jī)理仍然不十分清楚，大多數(shù)情況下認(rèn)為是超聲波的機(jī)械刺激強(qiáng)化了生物轉(zhuǎn)化過程中傳質(zhì)和混合，甚至提高了酶的活性，使細(xì)胞內(nèi)代謝反應(yīng)更加旺盛。過去有關(guān)超聲波生物學(xué)效應(yīng)的研究大多集中于人和動物細(xì)胞及微生物，應(yīng)用于植物細(xì)胞的研究較少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能有效提高肉蓯蓉離體培養(yǎng)細(xì)胞苯乙醇糖甙含量的方法。
該方法的操作步驟如下
1)肉蓯蓉細(xì)胞的繼代培養(yǎng)繼代培養(yǎng)基為B5基礎(chǔ)培養(yǎng)基+ 6-BA 0. 5 mg/L + GA3 10mg/L +水解酪蛋白800 rag/L。培養(yǎng)條件為固體培養(yǎng)，pH值5. 6，溫度25 °C，每天光照16 h，光照強(qiáng)度3000 Lux，培養(yǎng)周期30天(肉蓯蓉細(xì)胞繼代培養(yǎng)的目的是為了獲得足夠的細(xì)胞生物量用于研究超聲波對細(xì)胞合成苯乙醇糖甙能力的影響)； 2)肉蓯蓉細(xì)胞超聲波處理
a. 用超聲波清洗器來實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞的超聲刺激作用；
b. 將繼代培養(yǎng)15天的細(xì)胞接種在裝有40mL液體繼代培養(yǎng)基的三角瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫 度為25 °C，搖床轉(zhuǎn)速IIO r/min，每天光照16 h，光照強(qiáng)度3000 Lux，細(xì)胞培養(yǎng)周期為20 d;
c. 在細(xì)胞培養(yǎng)過程的第2 — 10天中，選取超聲波功率80—200 W、超聲波處理時間1一5 min，對肉蓯蓉培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行超聲波刺激；
3) 超聲波刺激后繼續(xù)培養(yǎng)，直到完成18天的培養(yǎng)周期；
4) 苯乙醇糖甙含量的測定培養(yǎng)結(jié)束后的肉蓯蓉愈細(xì)胞在6(TC的條件下烘干至恒重， 然后粉碎成40目，并用甲醇浸提24h，過濾后濃縮提取液，然后用水稀釋，通過大孔吸附 樹脂AB-8柱，先后用水和甲醇洗脫，收集甲醇洗脫部分用于測定苯乙醇糖甙的含量。
苯乙醇糖甙在332 nm處有強(qiáng)吸收峰，由此可繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到C二81. 43X—0. 69， R=0.9991，其中C為甲醇溶液中的苯乙醇糖甙濃度(rag/L)， X為該測定溶液的吸光度值， ^相關(guān)系數(shù)。
S= (CNV/W) X100%; P=1000 SW
其中，S為苯乙醇糖甙含量(％ )， P為苯乙醇糖甙產(chǎn)量(mg/L)， W為愈傷組織干重(g/L)， V為萃取液體積(L)， N為稀釋倍數(shù)。(該測定方法為現(xiàn)有技術(shù))
本發(fā)明內(nèi)容的關(guān)鍵點(diǎn)在于1.超聲波功率的選取；2.超聲波處理時間的確定；3.超 聲波處理時刻的選取。以上關(guān)鍵點(diǎn)如能把握好，可以顯著提高細(xì)胞苯乙醇糖甙的含量。 本發(fā)明操作簡便，效果良好，擴(kuò)展性強(qiáng)，可應(yīng)用于肉蓯蓉細(xì)胞生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)
過程，提高培養(yǎng)細(xì)胞藥用次生代謝產(chǎn)物苯乙醇糖甙類化合物的含量。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不是對本發(fā)明的限制。 實(shí)施例l:
1) 肉蓯蓉細(xì)胞的繼代培養(yǎng)繼代培養(yǎng)基為B5基礎(chǔ)培養(yǎng)基+ 6-BA 0. 5 mg/L + GA; 10 mg/L +水解酪蛋白800 mg/L。培養(yǎng)條件為固體培養(yǎng)，pH值5. 6，溫度25 。C ，每天光照 16 h，光照強(qiáng)度3000 Lux;
2) 將繼代培養(yǎng)15天的細(xì)胞接種在裝有40 niL液體繼代培養(yǎng)基的三角瓶中懸浮培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25 °C，搖床轉(zhuǎn)速110 r/min，每天光照16 h，光照強(qiáng)度3000 Lux;
3) 在培養(yǎng)的第2天，對懸浮培養(yǎng)細(xì)胞施加功率為80 W、時長為5 min的超聲波刺激， 細(xì)胞經(jīng)超聲波剌激后，繼續(xù)培養(yǎng)，直到完成18天的培養(yǎng)周期。
4) 培養(yǎng)結(jié)束后測定細(xì)胞苯乙醇糖甙的含量為8.4%，比不經(jīng)過任何超聲刺激的對照組 提高了18. 3%。
實(shí)施例2:
1) 肉蓯蓉細(xì)胞的繼代培養(yǎng)繼代培養(yǎng)基為B5基礎(chǔ)培養(yǎng)基+ 6-BA 0. 5 mg/L + GA3 10 mg/L +水解酪蛋白800 mg/L。培養(yǎng)條件為固體培養(yǎng)，pH值5. 6，溫度25 °C，每天光照 16 h，光照強(qiáng)度3000 Lux;
2) 將繼代培養(yǎng)15天的細(xì)胞接種在裝有40 mL液體繼代培養(yǎng)基的三角瓶中懸浮培養(yǎng)，培 養(yǎng)溫度為25 °C，搖床轉(zhuǎn)速IIO r/min，每天光照16 h，光照強(qiáng)度3000 Lux;
3) 在培養(yǎng)的第6天，對懸浮培養(yǎng)細(xì)胞施加功率為140 W、時長為3 min的超聲波刺激， 細(xì)胞經(jīng)超聲波刺激后，繼續(xù)培養(yǎng)，直到完成18天的培養(yǎng)周期。
4) 培養(yǎng)結(jié)束后測定細(xì)胞苯乙醇糖甙的含量為9.5%,比不經(jīng)過任何超聲刺激的對照組 提高了33.8%。
實(shí)施例3:
1) 肉蓯蓉細(xì)胞的繼代培養(yǎng)繼代培養(yǎng)基為B5基礎(chǔ)培養(yǎng)基+ 6-BA 0. 5 mg/L + GA, 10 mg/L +水解酪蛋白800 mg/L。培養(yǎng)條件為固體培養(yǎng)，pH值5. 6，溫度25 °C，每天光照 16 h，光照強(qiáng)度3000 Lux;
2) 將繼代培養(yǎng)15天的細(xì)胞接種在裝有40 mL液體繼代培養(yǎng)基的三角瓶中懸浮培養(yǎng)，培 養(yǎng)溫度為25 。C，搖床轉(zhuǎn)速IIO r/rain，每天光照16 h，光照強(qiáng)度3000 Lux;
3) 在培養(yǎng)的第10天，對懸浮培養(yǎng)細(xì)胞施加功率為200W、時長為l min的超聲波刺激， 細(xì)胞經(jīng)超聲波刺激后，繼續(xù)培養(yǎng)，直到完成18天的培養(yǎng)周期。
4) 培養(yǎng)結(jié)束后測定細(xì)胞苯乙醇糖甙的含量為9.3%，比不經(jīng)過任何超聲刺激的對照組 提高了31.0%。
權(quán)利要求
1、一種提高肉蓯蓉培養(yǎng)細(xì)胞苯乙醇糖甙含量的方法，其特征在于按以下步驟進(jìn)行1)肉蓯蓉細(xì)胞的繼代培養(yǎng)使用繼代培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為固體培養(yǎng)，pH值5.6，溫度25℃，每天光照16h，光照強(qiáng)度3000Lux；2)將繼代培養(yǎng)15天的肉蓯蓉細(xì)胞接種在裝有40mL液體繼代培養(yǎng)基的三角瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25℃，搖床轉(zhuǎn)速110r/min，每天光照16h，光照強(qiáng)度3000Lux，；3)在細(xì)胞培養(yǎng)過程的第2-10天中，選取超聲波功率80-200W、超聲波處理時間1-5min，對肉蓯蓉培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行超聲波刺激；4)超聲波刺激后繼續(xù)培養(yǎng)，直到完成18天的培養(yǎng)周期。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種提高肉蓯蓉培養(yǎng)細(xì)胞苯乙醇糖甙含量的方法。其操作步驟主要包括1.肉蓯蓉細(xì)胞的繼代培養(yǎng)；2.肉蓯蓉細(xì)胞的液體培養(yǎng)和超聲波處理過程；3.苯乙醇糖甙含量測定過程。利用超聲波對懸浮培養(yǎng)的肉蓯蓉細(xì)胞進(jìn)行刺激，是提高細(xì)胞苯乙醇糖甙含量的有效手段。本發(fā)明操作簡便，效果良好，擴(kuò)展性強(qiáng)，可應(yīng)用于肉蓯蓉細(xì)胞生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)過程，提高培養(yǎng)細(xì)胞藥用次生代謝產(chǎn)物的含量。
文檔編號C12P19/00GK101629202SQ20091009485
公開日2010年1月20日 申請日期2009年8月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月20日
發(fā)明者劉迪秋, 熊向峰, 鋒 葛, 陳朝銀, 韓本勇 申請人:昆明理工大學(xué)