專利名稱：檢測t細胞微小rna150相對含量反映個體免疫狀態(tài)的技術的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術，是一種基于聚合酶鏈反應(PCR)的分子生物學方法，特別 是涉及熒光定量的聚合酶鏈反應Ο -PCR)。通過微小RNA150(microRNA-150，miR-150)相 對含量反映個體的T細胞免疫狀態(tài)。在莖環(huán)引物3’端引入8個特異性核苷酸序列可以逆 轉錄miR-150，并通過Q-PCR技術對miR-150進行擴增。在與U6非編碼RNA的含量進行比 較后，得出miR-150的相對含量。miR-150的相對含量可反映個體T細胞免疫狀態(tài)。此方法 可在72小時內對個體T細胞免疫狀態(tài)進行評估，而且可以通過分選技術對不同的T細胞類 型進行分析，達到更準確的評估效果。優(yōu)化實驗條件后，構建簡單、準確的miR-150的相對 定量檢測試劑盒。
背景技術：
microRNAs是機體對mRNA翻譯出蛋白質的調節(jié)分子之一，成熟的microRNAs具有 這種調節(jié)功能。microRNAs在細胞發(fā)育、腫瘤的發(fā)生、疾病進展等重要的生理、病理過程發(fā)揮 了重要的作用。靜止與激活的T細胞中microRNAs表達譜也不同，表現出顯著的表達差異。 microRNAs差異表達在T細胞的發(fā)育、免疫性疾病進展、免疫抑制等生理、病理過程中發(fā)揮 了重要的影響作用。microRNAs的檢測有可能成為診斷、治療和預后判斷的靶分子，在惡性 腫瘤、免疫性疾病和病原體感染等常見疾病的病理過程和分子機制中有突出的研究價值。評價個體免疫狀態(tài)主要依賴以T細胞功能檢測為基本的生物技術，但是目前各種 檢測方法都有明顯缺陷，臨床實驗室主要通過檢測淋巴細胞的比例來完成，突出的缺陷是 不能反映老年人、免疫抑制藥物治療患者的免疫狀態(tài)。國外開發(fā)出一種immimknow的檢測 方法，主要檢測T細胞受刺激后ATP生成數量來評價免疫抑制治療患者的免疫抑制程度，需 要花費時間15-18小時的體外培養(yǎng)，而且需要特殊的儀器設備檢測細胞ATP含量。總體來 說，T細胞功能檢測存在實驗時間長、無法標準化、需要特殊儀器、價格昂貴等情況。通過建 立開放的熒光定量PCR技術平臺，結合創(chuàng)新的non-coding RNA檢測方案，開發(fā)全新的檢測 方法。此方法依靠PCR技術的高靈敏性和熒光定量的效果，同時T細胞受刺激后non-coding RNA可以在細胞內快速生成，將整個實驗的時間縮短為72小時，并可通過熒光定量PCR進行 量化評分達到評價免疫狀態(tài)的效果。T細胞作為評價免疫狀態(tài)的關鍵細胞，是各種免疫評價指標檢測的主要對象。通 過全血培養(yǎng)系統(tǒng)可以明顯縮短標本處理時間，在刺激培養(yǎng)的時間內，通過磁珠陽選CD4+的 T細胞，快速分離目的細胞并完成總RNA或短片段RNA的提取，并于熒光PCR儀器上進行檢 測?？偨Y以上過程可以發(fā)現此方法可以有效的縮短實驗時間、減少經濟費用，試劑和儀器可 開放使用。對個體免疫功能研究依賴快速、準確、簡單的篩選技術和定量檢測技術。但是成 熟microRNAs僅有21-23個堿基片段，很難采用常規(guī)的核酸擴增技術進行表達差異分析和 定量檢測。通過芯片技術可以區(qū)分拷貝數大的microRNAs表達差異，但是需要大量的標本 提取RNA。Q-PCR技術可以定量檢測低拷貝的核酸片段，首先通過莖環(huán)引物對miR-150進行 逆轉錄成cDNA，再通過Q-PCR進行相對定量。
目前，還未開發(fā)出準確、快速、簡單、費用低廉的個體免疫狀態(tài)評價技術。本發(fā)明基 于Q-PCR技術，通過莖環(huán)引物3’端引入8個特異性核苷酸，可以逆轉錄miR-150，并通過一 套引物進行Q-PCR分析，進行相對定量的檢測，解決目前個體免疫狀態(tài)評價的技術瓶頸。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是克服現有免疫診斷技術和分子診斷技術中對個體免疫狀態(tài)評價 技術存在的不足，包括分析耗時長、不能高通量、對標本要求高等缺陷。提供了一種檢測 miR-150相對含量的技術，可反映個體免疫狀態(tài)。miR-150莖環(huán)引物在3’端引入8個特異 性核苷酸，可以逆轉錄成熟的miR-150，并通過莖環(huán)引物引入通用引物進行Q-PCR分析，對 miR-150的差異表達進行相對定量的檢測。莖環(huán)引物包含來源于水稻序列，為SEQ ID NO. 1, 其3’端含有8個針對miR-150的特異性核苷酸序列；及用于對miR-150進行相對定量的一 對引物，miR-150特異性引物SEQ ID NO. 2，5，端有帶尾的結構，其3，端針對miR-150的18 個特異性序列；用于Q-PCR的對側引物由莖環(huán)引物內包含一個高質量的引物位置為SEQ ID NO. 3。本發(fā)明第二個目的是提供一套配套miR-150檢測的引物，為對內對照目的基因U6 進行定量檢測的三條引物，包括SEQ ID NO. 4,SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 3。SEQ ID NO. 4為 逆轉錄U6的引物，其特征是莖環(huán)引物3，端帶9個與U6的5’端特異性互補的核酸序列。U6 特異性引物SEQ ID N0. 5，其含TO的特異性序列。用于Q-PCR的對側引物由莖環(huán)引物內包 含一個高質量的引物位置為SEQ ID N0. 3。本發(fā)明第三個目的是提供一種用于miR150相對定量檢測的試劑盒。試劑A :5μΜ 逆轉錄miR-150、U6的莖環(huán)引物混合液50 μ L ；試劑B :20υ/μ L M-MuLV逆轉錄酶，50 μ L ； 試劑C:5X逆轉錄緩沖液，200yL含dNTP濃度為5mM(包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP)， Tris-HCl 濃度為 250mM，KCl 濃度為 250mM，MgCl2 濃度為 20mM，50nM DTT。試劑 D :2 μ M 通用引物100 μ L ；試劑E :2yMmiR-150特異性引物100 μ L ；試劑F :2μΜ U6特異性引物 100 μ L ；試劑G :5U/y LTaq DNA聚合酶，20 μ L ；試劑H :2 XPCR緩沖液組成，包含600ηΜ R0X, 1 X SYBR Green I dye, 2mM dNTPs (包括 dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、80mM Tris-HCl, 80mM KCl、40mM (NH4) 2S04、6mM MgSO4。本發(fā)明第四個目的是提供一種用于miR150相對定量檢測的評分表，由下述評分 組成；評分ι :τ細胞免疫狀態(tài)過激；評分2 :Τ細胞免疫狀態(tài)正常；評分3 :Τ細胞免疫狀態(tài)抑 制；評分4 =T細胞免疫狀態(tài)過度抑制。本發(fā)明的技術方案概述如下一套用于對miR-150核苷酸片段進行相對定量檢測的引物，及配套此檢測的一套 檢測TO內對照的引物。包括一條3’端引入8個針對miR-150互補核苷酸序列的莖環(huán)引物 SEQ ID NO. 1 ；一對擴增 miR-150 的引物 SEQ ID NO. 2,SEQ ID NO. 3 ；一條 3，端引入 9 個針 對U6互補核苷酸序列的莖環(huán)引物SEQ ID N0. 4 ；一對擴增U6的引物SEQ ID N0. 5、SEQ ID NO. 3。一種對miR150進行相對定量的一套試劑盒，其特征包括1，由下述試劑組成試劑A :5 μ M逆轉錄miR-150、U6的莖環(huán)引物混合液50 μ L ；試劑B :20U/ μ L M-MuLV 逆轉錄酶，50 μ L ；
試劑C :5X逆轉錄緩沖液，200 μ L含dNTP濃度為5mM(包括dATP、dCTP、dGTP、 dTTP)，Tris-HCl 濃度為 250mM，KCl 濃度為 250mM，MgCl2 濃度為 20mM，50nM DTT。試齊[JD:2μΜ 通用引物 100μ L ；試齊[JE :2 μ M miR-150 特異性引物 100 μ L ；試劑F :2 μ M U6特異性引物100 μ L ；試劑G :5U/ μ L Taq DNA 聚合酶，20 μ L ；試劑H :2XPCR 緩沖液組成，包含 600nM ROX, IX SYBR Green I dye,2mM dNTPs (包括 dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、80mM Tris_HCl、80mM KCl、40mM (NH4)2 SO4、6mM MgSO40一種對miR150相對定量進行評估的評分表，由下述評分組成評分1 :T細胞免疫狀態(tài)過激；評分2 =T細胞免疫狀態(tài)正常；評分3 =T細胞免疫狀 態(tài)抑制；評分4 =T細胞免疫狀態(tài)過度抑制。本發(fā)明優(yōu)點T細胞作為評價免疫狀態(tài)的關鍵細胞，是各種方法檢測的主要對象。已經表明T細 胞活化過程中出現新的物質的合成，其順序為non-coding RNA合成-mRNA合成-蛋白質合 成-DNA合成。目前各種方法的檢測時間均為在蛋白質合成或DNA合成階段，本發(fā)明能夠建 立在mi croRNA的技術平臺，不僅可以縮短實驗時間，同時可以提高開放性儀器的使用率， 減少經濟費用、提供一個全新的檢測標準和評估體系。通過全血培養(yǎng)系統(tǒng)可以明顯縮短標 本處理時間，在刺激培養(yǎng)的時間內，可通過磁珠陽選CD4+的T細胞，快速分離目的細胞并完 成總RNA提取，并于熒光PCR儀器上進行檢測?？偨Y以上過程可以發(fā)現此方法可以有效的縮 短實驗時間、減少經濟費用，試劑和儀器可開放使用。通過優(yōu)化實驗反應體系和反應條件， 組成檢測靈敏、方便的試劑盒，為個體免疫狀態(tài)的評估提供可靠的檢測技術。


圖1為miR-150的檢測效果(左1為刺激培養(yǎng)72小時U6結果、左2為未刺激培 養(yǎng)U6結果、左3為未刺激培養(yǎng)的miR-150結果、右1為刺激培養(yǎng)72小時miR-150結果)。
具體實施例方式下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。實施例1首先，用肝素潤濕注射針筒后，常規(guī)取靜脈血約:3ml，轉動針筒混勻血液。在超凈 工作臺中加全血到培養(yǎng)瓶中(含20%血清的1640培養(yǎng)液5ml，PHA 5mg, pH7. 2)，加入全血 0. 5ml (7號針頭13 15滴)，蓋緊膠塞，輕輕搖勻。將培養(yǎng)瓶放在37°C恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng) 5、8、16、24、72小時。分別將未培養(yǎng)和培養(yǎng)后的血細胞收集在離心管中，平衡后IOOOrpm離 心5min，去上清液留下Iml，充分混勻。加入混勻后的T細胞磁珠25 μ L，反復顛倒2_3次，使 磁性微珠分散開。在室溫輕輕的旋轉3分鐘，讓微珠附著到T細胞上(不要超過4分鐘)。 可以使用一種顛倒的裝置或手動混勻。放到磁力架上3分鐘，用移液管移去上清液，移離磁 力架。加Ι-aiilPBS清洗細胞。輕擊管子使微珠散開，再次將管子放到磁力架上1分鐘，移 棄上清液。重復洗兩次后，直接加入Iml Trizol，振蕩器振蕩或移液器吸打數次混勻，放置 5min。加入氯仿200，劇烈混勻，靜置5分鐘。12000rpm離心10分鐘后，取上層液體500 μ L，加入500 μ L異丙醇-20度放置2小時。12000rpm離心15分鐘后，棄上清液。用75%乙醇 洗滌，12000rpm離心15分鐘后，棄上清液。重復洗2次后，室溫下放置10分鐘，加入DEPC 處理的水30 μ L。充分溶解，-80度保存。實施例2一種配套此方法檢測miR-150的逆轉錄操作程序。20 μ L體系中含2 μ L mRNA(0. 5pg-l μ g)，miR-150、U6的莖環(huán)引物混合液試劑A 2 μ L(終濃度為500ηΜ)，逆轉 錄緩沖液試劑B 4 μ L(終濃度dNTP為ImM，M-MuLV逆轉錄酶濃度為40U，Tris-HCl濃度 為50mM，KCl濃度為50mM，MgCl2濃度為4mM)，加水12 μ L。逆轉錄程序為冰上放置5min， 15°C 15min,30°C 15min，95°C 5min。逆轉錄完成后，試管內加入180 μ L水，進行10倍的稀 釋。實施例3一種檢測miR-150的Q-PCR方法，及操作過程和反應程序。每個標本需要進行 2個重復管的miR-150檢測和2個重復管的U6檢測，共4個反應管，每反應管反應系為 10 μ L-50 μ L。在10 μ L Q-PCR體系中，首先加入1 μ L稀釋后的cDNA和1 μ L特異性引物 (終濃度200ηΜ)。其他試劑混合后共同加入，其中通用引物4μ L(終濃度200nM)，Q-PCR緩 沖液 20μ L(終濃度為 300nM R0X，0. 5X SYBR Green I dye, ImM dNTPs,40mM Tris-HCl, 40mM KCl，20mM (NH4) 2S04, 3mM MgSO4)，Taq 酶 0. 4 μ L (終濃度 0. 05U/ μ L)，加入水 8 μ L。混 勻試劑后，每孔加入8 μ L混合試劑，蓋上蓋子在ABI 7500上進行檢測。對cDNA擴增及定量 程序如下95°C預變性:3min后；進行40-50個循環(huán)，95°C變性kec，62°C退火延伸35sec (此 步驟采集熒光值)。通過常規(guī)方法對各PCR管的Ct值進行分析，經與內對照進行比較后得 出結果ο實施例4用于miR150相對定量檢測的評分表，由下述評分組成。評分1 :miR150相對含量在48小時前下降到初始含量的10%以下，定義為T細胞 免疫狀態(tài)過激；評分2 :miR150相對含量在72小時時下降到初始含量的10%以下，定義為T細胞
免疫狀態(tài)正常；評分3 :miR150相對含量在72小時時下降到初始含量的10%到50%之間，定義為 T細胞免疫狀態(tài)抑制；評分4 :miR150相對含量在72小時時未下降到初始含量的50%以下，定義為T細 胞免疫狀態(tài)過度抑制。
權利要求
1.一條用于微小RNA(microRNA，miR) 150相對定量的引物，其特征是一條莖環(huán)引物， 3，端帶8個與micrORNA150的5，端特異性互補的核酸序列SEQ ID NO. 1，可用于逆轉錄 miR-150。
2.根據權利要求1所述的用于對miR-150進行相對定量的一對引物，miR-150特異性 引物SEQ ID N0.2，5’端有帶尾的結構，其3’端與miR-150的5’端18個特異性序列相同; 用于Q-PCR的對側引物由莖環(huán)引物內包含一個高質量的引物位置為SEQ ID NO. 3。
3.根據權利要求1所述的用于對miR-150進行相對定量而配套的，對內對照基因非編 碼 RNA (non-coding RNA) U6 進行檢測的三條引物，包括 SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 3。SEQ ID NO. 4為逆轉錄TO的引物，其特征是莖環(huán)引物3，端帶9個與TO的5，端特異 性互補的核酸序列。TO特異性引物SEQ ID NO. 5，其5，端有帶尾的結構，其3，端針對TO 的特異性序列。用于Q-PCR的對側引物由莖環(huán)引物內包含的一個高質量的引物位置，序列 為 SEQ ID NO. 3。
4.根據權利要求1所述的對miR150進行相對定量的一套試劑盒，其特征包括1，由下 述試劑組成試劑A :5 μ M逆轉錄miR-150、U6的莖環(huán)引物混合液50 μ L ；試劑 B :20U/ μ L M-MuLV 逆轉錄酶，50 μ L ；試劑C :5Χ逆轉錄緩沖液，200 μ L含dNTP濃度為5mM(包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP)， Tris-HCl 濃度為 250mM，KCl 濃度為 250mM，MgCl2 濃度為 20mM，50nM DTT。試齊[J D :2 μ M通用引物IOOyL ；試劑E :2 μ M miR-150特異性引物100 μ L ；試劑F :2 μ M U6特異性引物100 μ L ；試劑 G :5U/ μ L Taq DNA 聚合酶，20 μ L ；試劑 H :2XPCR 緩沖液組成，包含 600nM R0X, 1 X SYBR Green I dye,2mM dNTPs (包括 dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、80mM Tris_HCl、80mM KCl、40mM(NH4)2SO4、6mM MgSO40
5.根據權利要求1所述的對miR150進行相對定量的一張評分表，其特征包括1，由下 述評分組成評分ι :τ細胞免疫狀態(tài)過激；評分2 =T細胞免疫狀態(tài)正常；評分3 =T細胞免疫狀態(tài)抑 制；評分4 =T細胞免疫狀態(tài)過度抑制。
全文摘要
本發(fā)明公開了可用于對微小RNA150核苷酸片段進行相對定量檢測的一條莖環(huán)引物和多條配套擴增的引物、試劑盒和評價表。試劑盒包括試劑A5μM逆轉錄miR-150、U6的莖環(huán)引物混合液50μL；試劑B20U/μL M-MuLV逆轉錄酶，50μL；試劑C5×逆轉錄緩沖液，200μL含dNTP濃度為5mM(包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP)，Tris-HCl濃度為250mM，KCl濃度為250mM，MgCl2濃度為20mM，50nM DTT。試劑D2μM通用引物100μL；試劑E2μM miR-150特異性引物100μL；試劑F2μM U6特異性引物100μL；試劑G5U/μL Taq DNA聚合酶，20μL；試劑H2×PCR緩沖液組成，包含600nM ROX，1×SYBR Green I dye，2mM dNTPs(包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、80mM Tris-HCl、80mM KCl、40mM(NH4)2SO4、6mM MgSO4。本發(fā)明所提供的整套試劑盒可對不同類型T細胞的微小RNA150核苷酸片段進行相對定量分析，并對個體免疫狀態(tài)進行評估。
文檔編號C12Q1/68GK102134592SQ201010601970
公開日2011年7月27日 申請日期2010年12月15日 優(yōu)先權日2010年12月15日
發(fā)明者周蒙滔, 楊麗紅, 潘曉東, 陳必成 申請人:周蒙滔, 楊麗紅, 陳必成