專利名稱：一種靶向冠狀病毒蛋白酶的藥物篩選模型及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物工程類檢測產(chǎn)品及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
冠狀病毒是導(dǎo)致呼吸道感染的主要病毒之一。目前引起人類呼吸道感染的冠狀 病毒已達(dá)五種，229E，OC43，SARS-CoV, NL63和HKU1。人類呼吸道感染中約30% 由229E和OC43兩種冠狀病毒引起；SARS-CoV是2003年初新出現(xiàn)的引起人類急性呼吸 道綜合癥(SARS)的一種高致病性呼吸道病原，感染死亡率約9%，是目前感染性和致病 性最強的一種新發(fā)人類冠狀病毒。隨后的三年內(nèi)又從呼吸道感染病人中相繼發(fā)現(xiàn)了兩種 人類新型冠狀病毒NL63(2004年)和11尺111(2005年)?？梢灶A(yù)測，許多不明原因的呼吸 道感染可能是由其他未發(fā)現(xiàn)的人類新型冠狀病毒引起。目前，臨床上還沒有治療冠狀病毒引起呼吸道感染的特異性治療藥物，針對個 別冠狀病毒的疫苗研究(如SARS滅活疫苗)僅在進行中。冠狀病毒引起的呼吸道感染尤 其兒童呼吸道感染是一種常年(春秋季為主)頻發(fā)性傳染病，對人類健康構(gòu)成巨大威脅， 嚴(yán)重影響生活質(zhì)量，對醫(yī)療衛(wèi)生和疾病防治工作形成巨大壓力。特異性抗冠狀病毒病毒 藥物具有巨大市場應(yīng)用潛力。蛋白酶在冠狀病毒復(fù)制周期中具有重要功能，是抗冠狀病毒藥物研究的重要靶 蛋白。冠狀病毒感染細(xì)胞后，基因組(+)RNA首先翻譯形成la/labdab由Ia經(jīng)-1移 碼翻譯形成)多聚蛋白(polyprotein)。Ia蛋白含有木瓜樣蛋白酶(papain-like protease, PLP)和3CLpro蛋白酶。Ia(Iab)蛋白在PLP和3CLpro病毒蛋白酶作用下，加工裂解成 16個非結(jié)構(gòu)蛋白(nspl_nspl6)。nspl nspl6主要定位于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜(ER膜)中，與 ER膜相互作用形成病毒復(fù)制酶復(fù)合體(Replicase Complex，RC)，參與病毒基因組復(fù)制和 亞基因組RNA (subgenomic RNA, sgRNA)轉(zhuǎn)錄。最后，由病毒SgRNA翻譯形成的結(jié)構(gòu) 蛋白(S，M，N，HE)和基因組復(fù)制形成的子代基因組RNA，組裝成新生病毒粒子，完 成病毒復(fù)制周期。從冠狀病毒復(fù)制過程可以發(fā)現(xiàn)，病毒蛋白酶PLP和3CLpro在冠病毒 復(fù)制酶復(fù)合體(RC)形成和病毒RNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程中具有重要作用，是冠狀病毒完成 復(fù)制周期的關(guān)鍵蛋白，是目前最受關(guān)注的一種重要抗冠狀病毒藥物靶標(biāo)。藥物篩選模型是抗冠狀病毒藥物研究的關(guān)鍵技術(shù)之一。目前的研究現(xiàn)狀是，首 先，在靶標(biāo)選擇上主要集中在冠狀病毒的3CLpro蛋白酶。其次，藥物篩選模型主要有兩 種。一是基于3CLpro蛋白酶對冠狀病毒復(fù)制酶多聚蛋白的裂解特性，建立的體外分子水 平篩選模型；這種模型僅能反映病毒蛋白酶體外活性。二是病毒感染的細(xì)胞模型作為藥 物篩選模型。病毒感染的細(xì)胞模型，對SARS-CoV等高致病性病毒必需使用BSL3實驗 室，對實驗人員危險性大，操作不方便，且有病毒泄漏的危險。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供基于細(xì)胞(Cell-based assay)的靶向冠狀病毒蛋白酶新型藥物篩選模型。冠狀病毒多聚蛋白Ia(Iab)加工產(chǎn)物中nsp3，nsp4和nSp6含有轉(zhuǎn)膜(TM) 結(jié)構(gòu)域，這些轉(zhuǎn)膜結(jié)構(gòu)域可介導(dǎo)蛋白質(zhì)定位于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)膜上。本發(fā)明利用nSp3， nsp4和nsp6含有轉(zhuǎn)膜結(jié)構(gòu)域和在細(xì)胞內(nèi)定位等特征，使用分泌性報告基因，構(gòu)建由冠狀 病毒蛋白酶-蛋白酶識別位點-分泌性報告基因組成的真核表達(dá)DNA構(gòu)建體，轉(zhuǎn)染細(xì)胞 后既可用于抗冠狀病毒藥物的篩選。
具體的說，本發(fā)明構(gòu)建了一種靶向冠狀病毒PLP蛋白酶的藥物篩選模型克隆 冠狀病毒的PLP-TM片段到真核表達(dá)載體中，在PLP的N段帶上PLP識別的nsp2/3位點 氨基酸序列-FTKLAG丨GK-，再把分泌型報告基因克隆到真核表達(dá)載體中PLP-TM片段 的5’端，獲得冠狀病毒蛋白酶-蛋白酶識別位點-分泌性報告基因組成的真核表達(dá)DNA 構(gòu)建體，將該DNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，既可用于篩選靶向冠狀病毒PLP蛋白酶的藥物。
本發(fā)明還構(gòu)建了一種靶向冠狀病毒3CLpro蛋白酶的藥物篩選模型克隆冠狀病 毒的nsp4-nsp5 (3CLpro)或nsp5 (3CLpro) _nsp6片段到真核表達(dá)載體中，在nsp5的N端 或C端帶上3CLpro識別位點氨基酸序列-GVNLQ丨SGKVI-，再把分泌型報告基因克隆 到真核表達(dá)載體中nsp4-nsp5 (3CLpro)或nsp5 (3CLpro) _nsp6片段的3，端或5，端，獲 得冠狀病毒3CLpro蛋白酶-蛋白酶識別位點-分泌性報告基因，將該DNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 細(xì)胞，既可用于篩選靶向冠狀病毒3CLpro蛋白酶的藥物。
本發(fā)明還構(gòu)建了一種靶向冠狀病毒PLP和3CLpro蛋白酶的雙靶標(biāo)(dual-targets) 藥物篩選模型將冠狀病毒PLP蛋白酶-蛋白酶識別位點-分泌性報告基因DNA構(gòu)建體 和冠狀病毒3CLpro蛋白酶-蛋白酶識別位點-分泌性報告基因DNA構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染Hela 細(xì)胞，既可用于篩選靶向兩種蛋白酶的藥物。
發(fā)明中使用的分泌性報告基因可以是任何具有分泌性表達(dá)性能的報告基因，如 堿性磷酸酶SEAP報告基因和分泌性熒光素酶報告基因等。在本發(fā)明提供的一個實施例 中，利用堿性磷酸酶SEAP報告基因?qū)崿F(xiàn)了發(fā)明目的，在檢測該活性產(chǎn)物時不需要制備細(xì) 胞裂解物，只要收聚細(xì)胞培養(yǎng)液上清即可。
本發(fā)明的另一目的是提供基于該模型的藥物篩選方法在轉(zhuǎn)染后得到的細(xì)胞模 型中加入不同濃度的待篩選化合物，于不同時間點收聚上清，用化學(xué)發(fā)光技術(shù)檢測上清 中的報告基因活性，計算給藥后報告基因活性變化，判斷待測化合物抑制蛋白酶(抑制 其中一種或同時抑制兩種)活性效果，選擇出候選藥物。通過多時間點收集細(xì)胞培養(yǎng)上 清可以動態(tài)檢測冠狀病毒蛋白酶活性，用多孔板(96或384孔板)形式可以實現(xiàn)冠狀病毒 蛋白酶活性的高通量檢測。該方法原理是利用轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的冠狀病毒蛋白酶切割活性， 釋放報告基因表達(dá)產(chǎn)物并分泌到細(xì)胞上清中，通過細(xì)胞上清中報告基因活性來檢測冠狀 病毒蛋白酶活性，用于冠狀病毒藥物篩選。
本發(fā)明的優(yōu)點表現(xiàn)在(1)特異性基于病毒蛋白酶酶解機制；(2)真實性 細(xì)胞水平上的篩選模型；(3)高通量以分泌性報告基因作為篩選標(biāo)記，可以實現(xiàn)高通 量快速、動態(tài)篩選；(4)安全性對SARS-CoV等高感染性病毒，避免了接觸活病毒和 使用BSL3實驗室引起病毒感染的危險。


圖1為NL63冠狀病毒nsp3，nsp4和nsp6蛋白的轉(zhuǎn)膜(TM)結(jié)構(gòu)域。PLPl和PLP2指木瓜樣蛋白酶的兩個酶活性功能結(jié)構(gòu)域，TM指蛋白轉(zhuǎn)膜結(jié)構(gòu)域。圖2為靶向冠狀病毒PLP蛋白酶的藥物篩選模型。SEAP指分泌性報告基因，PLP2為木瓜樣蛋白酶，TM指蛋白轉(zhuǎn)膜結(jié)構(gòu)域圖3為靶向冠狀病毒3CLpro蛋白酶的藥物篩選模型。Nsp4指冠狀病毒非結(jié)構(gòu) 蛋白，3CLpro指冠狀病毒3CLpro蛋白酶，SEAP指分泌性報告基因。圖4為本模型中SEAP活性高通量檢測實驗流程。圖5為靶向冠狀病毒蛋白酶的雙靶標(biāo)藥物篩選模型。圖6為靶向冠狀病毒蛋白酶的藥物篩選模型驗證。
具體實施例方式1.靶向冠狀病毒PLP蛋白酶的藥物篩選模型克隆NL63的PLP2-TM片段到載 體 pcDNA3.1-V5/His B 中(Xho I and Apa I)。在 PLP2 的 N 段帶上 PLP2 識別的 nsp2/3 位點氨基酸序列-FTKLAG丨GK-。 以SEAP-basic vector (Clontech)為模板，PCR獲得 SEAP片段(5，端帶上EcoR I和Kozak序列以及SEAP的ATG，3，端帶上XhoI)，克隆 到 pcDNA-V5/HisB 中 PLP2-TM 片段的 5，端，獲得 5，-SEAP-PLP2-TM-3，DNA 構(gòu)建 體(pcDNA-SEAP-PLP2-TM)。將該DNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染后12h，24h， 36h，48h和60h各時間點收聚50μ1上清。用化學(xué)發(fā)光技術(shù)(ChemiluminescentAssay)(試 劑為 Great EscAPe SEAP Chemiluminescent andFluorescence Detection Kits，Clontech 公司) 檢測上清中的SEAP活性。為了證實PLP2發(fā)揮活性時能將SEAP釋放到上清中，將 pcDNA-SEAP-PLP2-TM DNA中PLP2蛋白酶催化性關(guān)鍵氨基酸進行突變(C1678A)。將 野生型和突變體分別轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染后12h，24h，36h，48h和60h各時間點收聚 50 μ 1上清，按上述方法檢測SEAP活性。2.靶向冠狀病毒3CLpro蛋白酶的藥物篩選模型克隆NL63的 nsp4-nsp5 (3CLpro)片段到 pcDNA3.1_V5/His B 中(5，端帶上 EcoR I 和 Kozak 序 列以及ATG，3’端帶上Xho I)。 在nsp5的C段帶上3CLpro識別位點氨基酸 序列-GVNLQ I SGKVI-。 以 SEAP-basic vector (Clontech)為模板，PCR 獲 得SEAP片段(5，端帶上XhoI，3，端帶上ApaI)，克隆到pcDNA_V5/HisB中 nsp4-nsp5(3CLpro)片段的 3，端，獲得 5，-nsp4-nsp5 (3CLpro) -SEAP 3' DNA 構(gòu)建體 (pcDNA-nsp4-nsp5-SEAP)。將該DNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染后12h，24h， 36h，48h和60h各時間點收聚50μ1上清。用化學(xué)發(fā)光技術(shù)(ChemiluminescentAssay)(試 齊Ll為 GreatEscAPe SEAP Chemiluminescent and Fluorescence Detection Kits，Clontech 公司) 檢測上清中的SEAP活性。為了證實3CLpro發(fā)揮活性時能將SEAP釋放到上清中，將 pcDNA-nsp4-nsp5 (3CLpro)-SEAP DNA 中 3CLpro 蛋白酶(nsp5)的催化性關(guān)鍵氨基酸進 行突變(H41A)。將野生型和突變體分別轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染后12h，24h，36h，48h 和60h各時間點收聚50 μ 1上清，按上述方法檢測SEAP活性。3.靶向冠狀病毒PLpro和3CLpro蛋白酶的雙靶標(biāo)(dual-targets)藥物篩選模型 將 DNA 重組質(zhì)粒 pcDNA-SEAP_PLP2-TM 和 pcDNA-nsp4_nsp5 (3CLpro) -SEAP 共轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染后12h，24h，36h，4Sh和60h各時間點收聚50 μ 1上清。應(yīng)用于藥 物篩選時，在轉(zhuǎn)染后加入不同濃度的待篩選化合物，在轉(zhuǎn)染后12h，24h，36h，4Sh和 60h各時間點收聚50 μ 1上清。用化學(xué)發(fā)光技術(shù)(Chemiluminescent Assay)(試劑為Great EscAPe SEAP Chemiluminescent andFluorescence Detection Kits, Clontech 公司)檢測上清 中的SEAP活性，計算給藥后SEAP活性變化，判斷待測化合物抑制蛋白酶(抑制其中一 種或同時抑制兩種)活性效果。然后再應(yīng)用上面( 和(3)中的單靶標(biāo)藥物篩選模型證 實待測化合物對哪種蛋白酶(或兩種)具有特異性抑制作用。
4.模型驗證
蛋白酶活性驗證時， 將pcDNA-SEAP_PLP2-TM和 pcDNA-nsp4-nsp5 (3CLpro) -SEAP以及相應(yīng)的突變體轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，48小時后收聚上清，制備細(xì)胞裂解液。用Western Blotting對上清和細(xì)胞裂解液中的前體蛋白和蛋白酶 加工產(chǎn)物進行檢測。對nsp4和nsp5檢測，我們已制備了針對這兩種產(chǎn)物的兔多克隆抗 體。由于所有重組體蛋白的C端與V5短肽融合，C端加工產(chǎn)物可以用商用抗V5抗體 (Invitrogen)進行檢測。
應(yīng)用陽性冠狀病毒蛋白酶抑制劑驗證模型時，將PLP2抑制劑應(yīng)用我們基于 SARS PLPro高級結(jié)構(gòu)設(shè)計的并在體外病毒感染細(xì)胞模型中證實具有明顯抗病毒活性的 化合物 GRL0346。3CLpro 抑制劑使用文獻(xiàn)報道的 Cinanserii^SQ 10，643) (Chen L.，et al.J.Virol.2005Jun ； 79(11) 7095-103)或者其他 3CLpro 抑制劑(Blanchard JE.et al.Chem Biol.20040ct ； 11(10) 1445-53)。
將pcDNA-SEAP_PLP2-TM 和 pcDNA-nsp4-nsp5_SEAP 分別或共轉(zhuǎn)染 Hela 細(xì)胞，加入不同濃度的PLpro和3CLpro陽性抑制劑，同時設(shè)立熔劑(DMSO)對照。 在轉(zhuǎn)染后12h，24h，36h，4Sh和60h各時間點收聚50μ1上清。用化學(xué)發(fā)光技術(shù) (Chemiluminescent Assay)(試齊Ll 為 GreatEscAPe SEAP Chemiluminescent and Fluorescence Detection Kits, Clontech公司)檢測上清中的SEAP活性。分析陽性蛋白酶抑制劑對SEAP 活性的影響。
權(quán)利要求
1.一種基于細(xì)胞的靶向冠狀病毒蛋白酶的藥物篩選模型，由真核表達(dá)DNA載體轉(zhuǎn)染 細(xì)胞后通過細(xì)胞上清測定獲得，其特征為真核表達(dá)DNA載體由冠狀病毒蛋白酶-蛋白 酶識別位點_分泌性報告基因組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞篩選模型，其特征為真核表達(dá)DNA載體由冠狀病毒 蛋白酶PLP和分泌型報告基因組成，蛋白酶PLP和分泌型報告基因之間帶有PLP蛋白酶 識別的nsp2/3位點氨基酸序列-FTKLAG丨GK-。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞篩選模型，其特征為真核表達(dá)DNA載體由冠狀病 毒的nsp4-nsp5 (3CLpro)或nsp5 (3CLpro) _nsp6片段和分泌型報告基因組成，nsp5的N 端或C端帶有3CLpro識別位點氨基酸序列-GVNLQ丨SGKVI-，分泌型報告基因位于 nsp4-nsp5 (3CLpro)或 nsp5 (3CLpro) _nsp6 片段的 3，端或 5，端。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞篩選模型，其特征為由PLP蛋白酶-蛋白酶識別位 點_分泌性報告基因DNA構(gòu)建體和3CLpro蛋白酶-蛋白酶識別位點_分泌性報告基因 DNA構(gòu)建體，共轉(zhuǎn)染細(xì)胞得到靶向冠狀病毒兩種蛋白酶的雙靶標(biāo)藥物篩選模型。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞篩選模型，其特征為分泌性報告基因是具有分泌性 表達(dá)性能的報告基因。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞篩選模型，其特征為分泌性報告基因是堿性磷酸酶 SEAP和分泌性熒光素酶報告基因。
7.—種篩選靶向冠狀病毒蛋白酶化合物的方法，其特征為在權(quán)利要求1 6所述細(xì) 胞模型中加入不同濃度的候選選化合物，于不同時間點收聚上清，用化學(xué)發(fā)光技術(shù)檢測 上清中的報告基因活性，判斷待測化合物抑制蛋白酶活性效果。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的篩選方法，其特征為該操作過程用多孔板形式實現(xiàn)。
全文摘要
本發(fā)明提供一種基于細(xì)胞的靶向冠狀病毒蛋白酶新型藥物篩選模型。冠狀病毒多聚蛋白1a(1ab)加工產(chǎn)物中nsp3，nsp4和nsp6含有轉(zhuǎn)膜(TM)結(jié)構(gòu)域，這些轉(zhuǎn)膜結(jié)構(gòu)域可介導(dǎo)蛋白質(zhì)定位于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)膜上。本發(fā)明利用nsp3，nsp4和nsp6含有轉(zhuǎn)膜結(jié)構(gòu)域和在細(xì)胞內(nèi)定位等特征，使用分泌性報告基因，構(gòu)建由冠狀病毒蛋白酶-蛋白酶識別位點-分泌性報告基因組成的真核表達(dá)DNA構(gòu)建體。轉(zhuǎn)染細(xì)胞后通過冠狀病毒蛋白酶切割活性釋放報告基因表達(dá)產(chǎn)物并分泌到細(xì)胞上清中，通過細(xì)胞上清中報告基因活性來檢測冠狀病毒蛋白酶活性，用于冠狀病毒藥物篩選。
文檔編號C12R1/93GK102021145SQ20091009231
公開日2011年4月20日 申請日期2009年9月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月10日
發(fā)明者楊宇東, 邢雅玲, 陳忠斌, 陳曉娟 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所