專(zhuān)利名稱(chēng)：Hpv 16型e7e6融合蛋白基因、表達(dá)載體、方法、細(xì)胞和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)生物技術(shù)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及一種表達(dá)人乳頭瘤病毒 (HPV) 16型E7E6融合蛋白的基因、表達(dá)載體、方法和免疫治療用途。
背景技術(shù)：
大量研究資料證明，生殖道的高危型人乳頭狀瘤病毒(humanpapillomavirus， HPV)感染與宮頸癌有十分密切的關(guān)系。90%的宮頸癌患者可查到HPV DNA的存在，其中 HPV16型占50%，是引起宮頸癌的主要致病因子。目前盡管早期宮頸癌患者手術(shù)及放療治 療效果較好，但中晚期患者必須在手術(shù)治療的基礎(chǔ)上給予放療和一定的化療。由于放療的 巨大副作用及宮頸癌對(duì)化療的不敏感性，仍有35%的患者出現(xiàn)目前尚無(wú)法治療的嚴(yán)重合并 癥，費(fèi)用大且復(fù)發(fā)率高。這一切表明有必要發(fā)展更有效的預(yù)防和治療性疫苗來(lái)防治HPV的 感染和宮頸癌以及相關(guān)腫瘤。由于HPV癌基因E6，E7早期蛋白在宮頸上皮中是持續(xù)表達(dá)，在正常組織中并不存 在，因此這兩種蛋白可以作為發(fā)展HPV相關(guān)宮頸癌及癌前病變治療性疫苗的理想靶抗原。 大多數(shù)腫瘤特異性抗原是正?；蛲蛔兊募?xì)胞蛋白，而E6和E7完全是外源病毒蛋白，因此可 能比突變的細(xì)胞蛋白具有更好的免疫原性。并且由于E6和E7的持續(xù)存在是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化 和維持惡性特征所必需的，因此宮頸癌細(xì)胞不可能通過(guò)抗原丟失來(lái)逃避免疫監(jiān)視。動(dòng)物實(shí) 驗(yàn)已經(jīng)顯示，以E6和E7蛋白作為靶抗原，可產(chǎn)生好的免疫治療作用。復(fù)制缺陷型重組腺病毒嗜性廣泛，是將外源基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞內(nèi)常用的載體之 一。接種后，重組腺病毒在體內(nèi)進(jìn)行核酸復(fù)制和蛋白表達(dá)，產(chǎn)生大量抗原，刺激機(jī)體產(chǎn)生特 異性免疫反應(yīng)，并且它的感染與自然過(guò)程相似，表達(dá)的抗原在宿主細(xì)胞內(nèi)被加工和呈遞，可 以產(chǎn)生強(qiáng)的體液免疫和細(xì)胞免疫，病毒載體本身還可發(fā)揮佐劑效果增強(qiáng)免疫反應(yīng)；同時(shí)由 于重組腺病毒不整合到宿主基因組中，具有良好的生物安生性；理化性質(zhì)較穩(wěn)定，易于分離 純化；這些特性都使腺病毒成為腫瘤疫苗的合適載體被廣泛用于基因治療、體外基因轉(zhuǎn)染 及基因疫苗制備等實(shí)驗(yàn)及臨床研究中。腺病毒載體疫苗有許多優(yōu)點(diǎn)，但也存在著不足，其原有的高本底感染產(chǎn)生的中和 抗體影響著它在新型疫苗中的廣泛使用，此外免疫接種后產(chǎn)生的抗病毒抗體可能抑制再次 免疫，從而影響免疫治療效果，但人們通過(guò)異源性疫苗聯(lián)合免疫的治療方法克服了這一缺 點(diǎn)。2000年He Z.等在Virology上發(fā)表了在腺病毒中分別表達(dá)E6、E7蛋白，并進(jìn)行了免 疫效果觀察。

發(fā)明內(nèi)容
下面詳細(xì)討論本發(fā)明各種技術(shù)方案的制備和使用，但應(yīng)該理解，本發(fā)明提供了許 多適用的發(fā)明構(gòu)思，其可以體現(xiàn)在各種各樣的具體方面上。為有助于理解本發(fā)明，下面定義了一些術(shù)語(yǔ)。本文定義的術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明相關(guān)領(lǐng) 域的普通技術(shù)人員通常理解的含義。術(shù)語(yǔ)可用于說(shuō)明的具體實(shí)例的一般類(lèi)別，但它們的使用不限制本發(fā)明，權(quán)利要求中所概括的除外。除非另外指出，本文所述的“HPV”是指人乳頭瘤病毒(Humanpapillomavirus)；除非另外指出，本文所述的“bp”是指堿基對(duì)(base pair)；除非另外指出，本文所述的“ELISP0T”是指酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(Enzyme-linked immunospot)；除非另外指出，本文所述的“SDS-PAGE”是指十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳 (Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)；除非另外指出，本文所述的“ IFN-Y”是指Y-干擾素(Interfern gamma)；除非另外指出，本文所述的“PBS”是指磷酸鹽緩沖液(Phosphatebuffered saline)；本發(fā)明利用腺病毒載體，將經(jīng)修飾失去轉(zhuǎn)化活性的E6、E7蛋白基因融合，并根據(jù) 融合蛋白的氨基酸序列進(jìn)行哺乳細(xì)胞密碼子優(yōu)化改造，使之在哺乳細(xì)胞能高水平表達(dá)。本 發(fā)明成功設(shè)計(jì)出E7E6融合蛋白哺乳細(xì)胞密碼子優(yōu)化基因，并成功構(gòu)建了高表達(dá)HPV16型 E7E6融合蛋白的重組腺病毒rAd5HPV16SmE7E6，該重組腺病毒疫苗具有強(qiáng)的免疫源性，可 誘發(fā)特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng)，完全保護(hù)免疫小鼠抵抗腫瘤細(xì)胞的攻擊。本發(fā)明可用于研發(fā) 宮頸癌的治療和治療性宮頸癌疫苗。具體地，本發(fā)明的一個(gè)目的在于，提供一種人乳頭瘤病毒(HPV) 16型E7E6融合蛋 白。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于，提供一種用于編碼前述的人乳頭瘤病毒(HPV)16型E7E6融 合蛋白的優(yōu)化DNA序列。本發(fā)明的又一個(gè)目的在于，提供一種表達(dá)載體及包含人乳頭瘤病 毒(HPV) 16型E7E6融合基因的重組腺病毒。本發(fā)明的再一個(gè)目的在于，提供一種用于生產(chǎn) 前述的人乳頭瘤病毒(HPV) 16型E7E6融合蛋白重組腺病毒的細(xì)胞。本發(fā)明的還一個(gè)目的在于，提供一種生產(chǎn)前述的表達(dá)人乳頭瘤病毒(HPV) 16型 E7E6融合蛋白的方法。此外，本發(fā)明還提供了上述HPV 16型E7E6融合蛋白的DNA序列、表 達(dá)載體、腺病毒及細(xì)胞的用途。針對(duì)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案一方面，本發(fā)明提供一種人乳頭瘤病毒(HPV) 16型E7E6融合蛋白，所述融合蛋白 的氨基酸序列為SQE. ID. NO. 1所示的序列。另一方面，本發(fā)明提供一種用于編碼上述人乳頭瘤病毒(HPV) 16型E7E6融合蛋白 的優(yōu)化DNA序列，所述DNA序列是根據(jù)哺乳細(xì)胞密碼子進(jìn)行優(yōu)化的序列，其核苷酸序列為 SQE. ID. NO. 2所示的序列。又一方面，本發(fā)明提供一種表達(dá)載體，所述表達(dá)載體含有上述表達(dá)人乳頭瘤病毒 (HPV) 16型E7E6融合蛋白的優(yōu)化DNA序列；優(yōu)選地，所述表達(dá)載體包括重組腺病毒。由于本 發(fā)明所提供的上述優(yōu)化DNA序列是根據(jù)哺乳細(xì)胞密碼子進(jìn)行優(yōu)化合成的，從理論上來(lái)說(shuō)， 既然其適合在腺病毒載體上表達(dá)，就應(yīng)當(dāng)可以在其它哺乳細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)。又一方面，本發(fā)明提供一種重組腺病毒質(zhì)粒，所述的質(zhì)粒含有上述編碼人乳頭 瘤病毒(HPV) 16型E7E6融合蛋白的優(yōu)化DNA序列和克隆質(zhì)?；蛳俨《敬┧筚|(zhì)粒；優(yōu)選 地，所述的克隆質(zhì)粒選自PUC18、pUC19和pUC57等；所述的腺病毒穿梭質(zhì)粒選自pDC316、 PDC311、pDC312和pDC315等；更優(yōu)選地，所述的重組腺病毒質(zhì)粒是將編碼上述人乳頭瘤病 毒(HPV) 16型E7E6融合蛋白的DNA序列插入至克隆質(zhì)粒pUC 18或腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC316的Bgl II位點(diǎn)之間來(lái)構(gòu)建的。此外，本發(fā)明提供一種用于表達(dá)上述人乳頭瘤病毒(HPV) 16型E7E6融合蛋白的 重組腺病毒，所述的重組腺病毒是復(fù)制缺陷型腺病毒，該病毒攜帶有上述表達(dá)人乳頭瘤病 毒(HPV) 16型E7E6融合蛋白的的優(yōu)化DNA序列，并能表達(dá)人乳頭瘤病毒(HPV) 16型E7E6 融合蛋白；優(yōu)選地，所述重組腺病毒是由重組腺病毒穿梭質(zhì)粒和腺病毒骨架質(zhì)粒在人胚腎 293細(xì)胞中發(fā)生同源重組后在人胚腎293細(xì)胞內(nèi)包裝形成的，其中所述腺病毒穿梭質(zhì)粒選 自pDC316、pDC311、pDC312和pDC315等，所述腺病毒骨架質(zhì)粒為復(fù)制缺陷型載體，優(yōu)選選自 pBHGloxAEl，3Cre。再一方面，本發(fā)明提供一種用于生產(chǎn)上述重組腺病毒的細(xì)胞，所述的細(xì)胞為上述 重組腺病毒的包裝細(xì)胞；優(yōu)選地，所述的細(xì)胞選自人胚腎293細(xì)胞、人胚腎293T細(xì)胞、人胚 腎293FT細(xì)胞和人胚腎293F細(xì)胞等。本發(fā)明還提供一種用于表達(dá)上述人乳頭瘤病毒(HPV) 16型E7E6融合蛋白的哺乳 動(dòng)物細(xì)胞，所述細(xì)胞是由上述表達(dá)載體感染或轉(zhuǎn)染得到的；優(yōu)選地，所述表達(dá)載體為重組腺 病毒；更優(yōu)選地，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞為人胚腎293細(xì)胞、人胚腎293T細(xì)胞、人胚腎293FT細(xì) 胞和人胚腎293F細(xì)胞。還一方面，本發(fā)明提供一種表達(dá)上述人乳頭瘤病毒(HPV) 16型E7E6融合蛋白的方 法，所述方法包括構(gòu)建含有上述編碼人乳頭瘤病毒(HPV) 16型E7E6融合蛋白的優(yōu)化DNA序 列的表達(dá)載體，并使該表達(dá)載體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中得到表達(dá)；優(yōu)選地，所述表達(dá)載體為重組 腺病毒；更優(yōu)選地，所述細(xì)胞選自人胚腎293細(xì)胞、人胚腎293T細(xì)胞、人胚腎293FT細(xì)胞和 人胚腎293F細(xì)胞等。本發(fā)明還提供了制備一種表達(dá)上述人乳頭瘤病毒(HPV) 16型E7E6融合蛋白的重 組腺病毒的方法，所述方法包括以下步驟1)將上述的人乳頭瘤病毒(HPV)16型E7E6融合 蛋白的優(yōu)化DNA序列插入到腺病毒穿梭質(zhì)粒，構(gòu)建出重組腺病毒穿梭質(zhì)粒載體；2)將步驟 1)所構(gòu)建的重組腺病毒穿梭質(zhì)粒與腺病毒骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染人胚腎293細(xì)胞；3)將步驟2) 所得到的細(xì)胞進(jìn)行離心后，用無(wú)菌PBS重懸細(xì)胞沉淀，反復(fù)凍融后，再次離心，上清液即為 含重組腺病毒的原代病毒液；4)將步驟3)中的原代病毒液進(jìn)行單斑純化，并通過(guò)鑒定篩選 出正確的重組腺病毒；5)將步驟4)中重組腺病毒在人胚腎細(xì)胞中傳代擴(kuò)增。此外，本發(fā)明還提供了一種制備用于治療人乳頭瘤病毒(HPV) 16型感染及相關(guān)疾 病(如宮頸癌)藥物的方法，所述方法包括將編碼人乳頭瘤病毒(HPV) 16型E7E6融合蛋 白的優(yōu)化DNA序列、包含編碼人乳頭瘤病毒(HPV) 16型E7E6融合蛋白的優(yōu)化DNA序列的 表達(dá)載體(包括重組腺病毒)、或者包含該重組腺病毒的包裝細(xì)胞用于表達(dá)人乳頭瘤病毒 (HPV) 16型E7E6融合蛋白。本發(fā)明還提供了上述人乳頭瘤病毒(HPV) 16型E7E6融合蛋白、編碼人乳頭瘤病毒 (HPV) 16型E7E6融合蛋白的優(yōu)化DNA序列、包含編碼人乳頭瘤病毒(HPV) 16型E7E6融合蛋 白的優(yōu)化DNA序列的表達(dá)載體(包括重組腺病毒)、或者包含該重組腺病毒的細(xì)胞在制備用 于治療人乳頭瘤病毒(HPV) 16型感染及相關(guān)疾病(如宮頸癌)藥物中的應(yīng)用；優(yōu)選地，所述 藥物為疫苗。本發(fā)明還提供了一種用于治療宮頸癌的疫苗，所述疫苗包括上述的融合蛋白、DNA 序列、表達(dá)載體、重組腺病毒或細(xì)胞。
由此可見(jiàn)，本發(fā)明采用基因工程技術(shù)方法，首先，將HPV16型早期蛋白E7、E6編碼 區(qū)基因融合，并將E7、E6編碼區(qū)基因進(jìn)行改造修飾去除其轉(zhuǎn)化活性，保留抗原性，再根據(jù)哺 乳細(xì)胞使用密碼子的偏嗜性設(shè)計(jì)其相應(yīng)的優(yōu)勢(shì)密碼子核酸序列交給公司合成。眾所周知， 從多種密碼子中選擇特定的密碼子以獲得較高蛋白產(chǎn)量稱(chēng)為“密碼子優(yōu)化”，對(duì)于分子量較 大，即組成的氨基酸數(shù)目較多的蛋白而言，尋找及確定密碼子優(yōu)化的核苷酸序列是具有相 當(dāng)難度的。然后，將合成的經(jīng)密碼子優(yōu)化過(guò)的E7E6融合基因插入到腺病毒重組載體質(zhì)粒 PCD316中，與Ad5病毒載體骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，經(jīng)純化并進(jìn)行E7E6融合基因及蛋白 的鑒定，篩選出表達(dá)人乳頭瘤病毒HPV16型E7E6融合蛋白的重組腺病毒rAd5HPV16SmE7E6， 擴(kuò)增重組病毒，經(jīng)動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)，表明所制備出的重組腺病毒rAd5HPV16SmE7E6具有 免疫活性，其能夠誘發(fā)免疫動(dòng)物產(chǎn)生針對(duì)HPV16E7的特異性T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答，對(duì) 腫瘤的生長(zhǎng)有明顯抑制作用。


以下，結(jié)合附圖來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方案，其中圖1顯示插入了密碼子優(yōu)化的HPV16型E7E6融合基因的克隆質(zhì)粒 pUC18-HPV16smE7E6 的結(jié)構(gòu)圖譜。圖2顯示腺病毒穿梭質(zhì)粒PDC316的結(jié)構(gòu)圖譜。圖3顯示插入了密碼子優(yōu)化的HPV16型E7E6融合基因的重組腺病毒穿梭質(zhì)粒 pDC-HPV16smE7E6 的結(jié)構(gòu)圖譜。圖4顯示插入了密碼子優(yōu)化的HPV16型E7E6融合基因的重組腺病毒穿梭質(zhì) 粒pDC-HPV16SmE7E6的酶切鑒定凝膠電泳結(jié)果，其中Ml為λ-EcoT14 I DNA Marker, M2 為 DNA Marer III，1 為用 Ava I 酶切的 pDC_HPV16SmE7E6 質(zhì)粒，2 為 Bgl II 酶切 的pDC-HPV16SmE7E6質(zhì)粒，3為Nsi I酶切的pDC_HPV16SmE7E6質(zhì)粒，4為未進(jìn)行酶切的 pDC-HPV16SmE7E6 質(zhì)粒。圖5顯示插入了密碼子優(yōu)化的HPV16型E7E6融合基因的重組腺病毒穿梭質(zhì)粒 pDC-HPV16SmE7E6的重組腺病毒rAd5HPV16SmE7E6的結(jié)構(gòu)圖譜。圖6顯示重組腺病毒rAd5HPV16SmE7E6的PCR鑒定結(jié)果，其中M為λ-EcoTH I DNA Marker, 1為空白對(duì)照，2為Ad5腺病毒陰性對(duì)照，3為重組腺病毒rAd5HPV16SmE7E6。圖7顯示重組腺病毒rAd5HPV16SmE7E6中的E7E6融合基因表達(dá)產(chǎn)物的 Western-blot檢測(cè)結(jié)果，其中M為寬分子量預(yù)染蛋白質(zhì)Marker，1為Ad5腺病毒陰性對(duì)照， 2為重組腺病毒rAd5HPV16SmE7E6，A圖為用抗HPV16E6抗體檢測(cè)的反應(yīng)信號(hào)，B圖為用抗 HPV16E7抗體檢測(cè)的反應(yīng)信號(hào)。圖8顯示重組腺病毒rAd5HPV16SmE7E6免疫小鼠后ELISP0T酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè)結(jié) 果圖。圖9顯示重組腺病毒rAd5HPV16SmE7E6免疫小鼠后，抗腫瘤移植實(shí)驗(yàn)的結(jié)果圖。圖10顯示重組腺病毒rAd5HPV16SmE7E6對(duì)腫瘤生長(zhǎng)抑制作用的結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式以下參照具體的實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，其不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。除非另外指明，本發(fā)明所使用的各種實(shí)驗(yàn)材料來(lái)源如下常用限制性內(nèi)切 酶、T4連接酶、Taq酶、堿性磷酸酶均為Biolabs公司產(chǎn)品，購(gòu)自北京北方儀濤商貿(mào)有 限公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒為北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine 2000為Invitrogen公司產(chǎn)品，購(gòu)自北京茂健聯(lián)星科技有限公司；鼠 ELISP0T試劑盒為荷蘭U-Cytech公司，購(gòu)自達(dá)科為生物技術(shù)有限公司；鼠抗HPV16E7單克 隆抗體為英國(guó)SantaCruz公司產(chǎn)品；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體購(gòu)自北京中杉金 橋生物技術(shù)公司；硝酸纖維素膜購(gòu)自英國(guó)Whatman公司；低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)購(gòu)自北京華 美轉(zhuǎn)導(dǎo)科技有限公司；重組腺病毒穿梭質(zhì)粒PDC316、重組腺病毒骨架質(zhì)粒pBHGloxAEl， 3Cre以及腺病毒包裝細(xì)胞人腎上293細(xì)胞均購(gòu)自加拿大Microbix Bixosystems公司。除非另外指明，本發(fā)明所使用的引物來(lái)源如下檢測(cè)引物由上海生工生物工程基 因技術(shù)有限公司合成，其中上游引物PDC316F acg tgg gta taagag gcg 3'，下游引 物 pDC316R:5' cga tgc tag acg ate cag 3'；針對(duì)HPV16E7CD8+T cell 特異性的表位肽 (氨基酸第49-57位RAHYNIVTF)由北京中科亞光生物科技有限公司合成。除非另外指明，本發(fā)明所使用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來(lái)源如下C57BL/6小鼠購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué) 科學(xué)院動(dòng)物所。除非另外指明，本發(fā)明所涉及的生物基因工程操作技術(shù)(如質(zhì)粒提取、酶切消化、 片段回收、核酸片段與質(zhì)粒載體連接反應(yīng)及克隆和篩選等)，請(qǐng)參見(jiàn)《分子生物克隆指南》， 薩姆布魯克J等，第二版(北京)科學(xué)出版社，1992。實(shí)施例1 設(shè)計(jì)并合成人乳頭瘤病毒16型E7E6融合蛋白及適于哺乳細(xì)胞表達(dá)的 密碼子優(yōu)化融合基因本實(shí)施例為設(shè)計(jì)并合成人乳頭瘤病毒16型E7E6融合蛋白，以及設(shè)計(jì)適于哺乳細(xì) 胞表達(dá)的密碼子優(yōu)化的融合基因，具體過(guò)程如下。根據(jù)HPV16型E7、E6的基因編碼區(qū)序列(Genebank號(hào)NC_001526)獲得HPV16型 E7、E6基因編碼的氨基酸序列，將E7蛋白與pRB結(jié)合位點(diǎn)的兩個(gè)關(guān)鍵氨基酸第24位半胱氨 酸和第26位谷氨酸變?yōu)楦拾彼幔珽6蛋白的P53降解活性位點(diǎn)的關(guān)鍵氨基酸第57位的亮氨 酸變?yōu)楦拾彼?，以消除其腫瘤轉(zhuǎn)化活性。再將HPV16的E7蛋白氨基酸序列C末端與HPV16E6 蛋白序列的N端相連，組合設(shè)計(jì)為如下的融合蛋白，氨基酸序列如SQE. ID. NO. 1所示，共255 個(gè)氨基酸(不含終止密碼子)。利用基因簡(jiǎn)并性，在其編碼的產(chǎn)物蛋白氨基酸序列保持不變的前提下設(shè)計(jì)出適于 哺乳細(xì)胞表達(dá)的優(yōu)勢(shì)密碼子優(yōu)化核苷酸序列，發(fā)明人將該序列命名為SmE7E6，經(jīng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè) 證明，該序列適于在哺乳細(xì)胞中表達(dá)HPV16SmE7E6融合蛋白，其序列如SQE. ID. NO. 2所示， 共77 Ibp (含兩個(gè)終止密碼子序列)。實(shí)施例2 克隆質(zhì)粒pUC18-HPV16smE7E6的構(gòu)建本實(shí)施例為構(gòu)建克隆質(zhì)粒pUC18_HPV16smE7E6。將實(shí)施例1所設(shè)計(jì)的HPV16SmE7E6融合基因核苷酸序列送北京擎科生物技術(shù)有限 公司合成，并由公司將其克隆于PUC18中，獲得合成基因的克隆質(zhì)粒pUC18-HPV16smE7E6， 經(jīng)序列測(cè)定表明合成序列與設(shè)計(jì)一致。插入了密碼子優(yōu)化的HPV16型E7E6融合基因的克 隆質(zhì)粒pUC18-HPV16smE7E6結(jié)構(gòu)圖譜如圖1所示，其序列如SQE. ID. NO. 3所示，共3475bp。
本實(shí)施例中所使用的pUC18為可商購(gòu)獲得的質(zhì)粒載體，購(gòu)自北京六合通經(jīng)貿(mào)有限 公司，其具體結(jié)構(gòu)見(jiàn)文獻(xiàn)《分子生物克隆指南》，薩姆布魯克J等，第二版(北京)科學(xué)出版 社，第9頁(yè)，1992。實(shí)施例3 重組腺病毒5型穿梭質(zhì)粒pDC-HPV16smE7E6的構(gòu)建本實(shí)施例為構(gòu)建重組腺病毒5型穿梭質(zhì)粒pDC-HPV16smE7E6，具體過(guò)程如下。首先，將實(shí)施例2中合成并克隆至pUC18上的SmE7E6優(yōu)化基因用BglII酶37°C水 浴消化2小時(shí)，然后用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收SmE7E6融合基因片段。其次，將該SmE7E6融合基因片段插入用相同內(nèi)切酶(Bgl II)消化處理，并用堿性 磷酸酶進(jìn)行去磷酸化處理過(guò)的腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC316(其具體結(jié)構(gòu)圖譜見(jiàn)圖2)中，經(jīng)Ava I、BglII和NsiI酶切鑒定(電泳結(jié)果如圖4所示)并測(cè)序篩選，獲得有正確插入的重組腺 病毒穿梭質(zhì)粒pDC-HPV16SmE7E6，其結(jié)構(gòu)圖譜如圖3所示，其序列如SQE. ID. NO. 4所示，共 4690bp。實(shí)施例4 重組腺病毒rAd5HPV16SmE的構(gòu)建本實(shí)施例為構(gòu)建表達(dá)HPV16型E7E6融合蛋白的重組腺病毒rAd5HPV16SmE7E，其結(jié) 構(gòu)圖譜見(jiàn)圖5，其序列如SQE. ID. NO. 5所示，共31762bp。具體的構(gòu)建過(guò)程包括 (1)腺病毒骨架質(zhì)粒pBHGlox Δ El, 3Cre和重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC_HPV16SmE7E6 的制備使用QIAGEN質(zhì)粒大提試劑盒(購(gòu)自北京北方儀濤商貿(mào)有限公司)分別提取 pBHGlox Δ El，3Cre 和實(shí)施例 3 所構(gòu)建的 pDC_HPV16SmE7E6，操作步驟見(jiàn) QIAGEN Plasmid Midi Kits使用手冊(cè)。(2)重組腺病毒的包裝轉(zhuǎn)染前一天傳293細(xì)胞于25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)基用不含抗生素的5% FCS的 DMEM，第二天選60% 80%鋪滿的細(xì)胞備用。配制轉(zhuǎn)染液如下A液重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC_HPV16SmE7E6和骨架質(zhì)粒pBHGlox Δ El，3Cre各 5 μ 1 (各4 μ g)加入245 μ 1 Opti-MEM培養(yǎng)基中混勻；B 液5 μ 1 LipofectamineTM2000 加入 245 μ 1 Opti-MEM 培養(yǎng)基中混勻。A液和B液室溫放置5分鐘后，將A加入B液中輕輕混勻，室溫放置20分鐘。吸 棄舊細(xì)胞培養(yǎng)液，換2ml新鮮的不含抗生素、含5% FCS的DMEM，然后將A+B混合液加入培 養(yǎng)細(xì)胞上，于37°C、5% CO2孵育8h，補(bǔ)充新鮮的培養(yǎng)基2. 5ml。24h后換含2% FCS的DMEM 維持。轉(zhuǎn)染后7 10天，用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮擦下來(lái)，SOOrpm離心5分鐘，棄上清，用2ml的 無(wú)菌PBS重懸細(xì)胞沉淀；-70°C和37°C反復(fù)凍融4次；2000rpm離心10分鐘，吸取上清即為 原代病毒液，所得重組腺病毒命名為rAd5HPV16SmE7E6，_70°C保存?zhèn)溆?。?shí)施例5 重組腺病毒rAd5HPV16SmE7E的純化和PCR鑒定本實(shí)施例為純化重組腺病毒并通過(guò)PCR鑒定該重組腺病毒，具體的實(shí)驗(yàn)操作如 下將實(shí)施例4中的原代病毒液以10倍系列稀釋?zhuān)腥?93細(xì)胞，培養(yǎng)2_4小時(shí)后鋪 斑，37°C培養(yǎng)4-6天后，經(jīng)單斑純化后進(jìn)行鑒定。將單斑病毒凍融三次后，感染在24孔板中長(zhǎng)至90%的293細(xì)胞。病毒在37°C吸 附1-2小時(shí)后補(bǔ)液，放入37°C培養(yǎng)24-48小時(shí)后，吸取感染細(xì)胞的上清液50 μ 1，加入1 μ 1蛋白酶K(10mg/ml)，37°C消化1. 5小時(shí)后煮沸10分鐘，迅速放在冰上5分鐘，做為PCR檢 測(cè)的模板。在染毒時(shí)同時(shí)做一個(gè)感染Ad5腺病毒的孔進(jìn)行相同處理后作為檢測(cè)用的陰性對(duì) 照。 取0. 01 μ 1-1 μ 1上述樣品進(jìn)行PCR反應(yīng)。樣品包括待測(cè)重組腺病毒毒株和Ad5 腺病毒對(duì)照，同時(shí)做不加DNA模板做為試劑空白對(duì)照。PCR反應(yīng)體系
樣品0. 2μ 1
10XPCR Buffer2μ 1
引物 PDC316F1 μ 1
引物 PDC316R1 μ 1
dNTP1. 6μ 1
Taq酶0. 2μ 1
H2O14μ 1 _總計(jì)20 μ 1循環(huán)參數(shù)94°C預(yù)變性10分鐘；94°C變性30秒，53°C退火30秒，72°C延伸1分30 秒，三十個(gè)循環(huán)；72°C延伸10分鐘。取5μ1 PCR反應(yīng)溶液上1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴(kuò) 增產(chǎn)物的大小，結(jié)果見(jiàn)圖6。待測(cè)樣品擴(kuò)增出1039bp左右的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符，而腺病 毒對(duì)照和空白對(duì)照在相應(yīng)位置未見(jiàn)擴(kuò)增條帶，將擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物送北京擎科生物技術(shù)有 限公司測(cè)序，序列正確與設(shè)計(jì)相符，表明目的基因正確插入腺病毒中。實(shí)施例6 重組腺病毒rAd5HPV16SmE7E6的傳代擴(kuò)增本實(shí)施例為重組腺病毒rAd5HPV16SmE7E6的傳代擴(kuò)增，具體操作如下取實(shí)施例5中經(jīng)PCR鑒定正確的重組病毒且已純化好的單斑凍存液約0. 2ml與 Iml含2%胎牛血清的DMEM混合后感染長(zhǎng)至60% 70%的293細(xì)胞，37°C孵育2小時(shí)，補(bǔ) 加2%胎牛血清的DMEM維持液5ml，至絕大部分293細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞腫脹、圓縮等典型的病變 后，收集病變細(xì)胞，細(xì)胞沉淀在PBS中重懸，在-70°C凍化三次后，按1 10接種病毒進(jìn)行擴(kuò) 增。在293細(xì)胞中傳代擴(kuò)增5-6代，直到獲得所需滴度的重組病毒(> 108pfu/ml)。實(shí)施例7 重組腺病毒rAd5HPV16SmE7E6感染的293細(xì)胞中E7E6融合蛋白的表達(dá) 檢測(cè)本實(shí)施例為重組腺病毒rAd5HPV16SmE7E6感染的293細(xì)胞中E7E6融合蛋白的表 達(dá)檢測(cè)，具體操作如下在25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中293細(xì)胞長(zhǎng)成90 %左右，用lpfu/cel滴度染毒，病毒在 37°C吸附1-2小時(shí)后補(bǔ)液，放入37°C培養(yǎng)24-48小時(shí)至細(xì)胞全病變。倒掉病毒液，用PBS輕 輕洗兩遍，用細(xì)胞刮子將細(xì)胞刮下，1000-2000轉(zhuǎn)/分，離心5分鐘，收集細(xì)胞。往細(xì)胞內(nèi)加 入50 μ 1 IX SDS-PAGE加樣緩沖液，混勻，100°C加熱3分鐘。取5_10 μ 1上樣(樣品包括待 測(cè)重組腺病毒毒株、Ad5腺病毒做陰性對(duì)照)于10%的SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，然后電轉(zhuǎn)樣 品于硝酸纖維素膜。分別使用抗HPV16E7鼠單克隆抗體和抗HPV16E6山羊多克隆抗體(為 Santa Cruz公司產(chǎn)品，購(gòu)自北京北方儀濤商貿(mào)有限公司作為第一抗體，然后用相應(yīng)的辣根 過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG和兔抗羊IgG作為第二抗體，用化學(xué)發(fā)光試劑盒(為Pierce產(chǎn)品，購(gòu)自北京北方同正生物技術(shù)發(fā)展有限公司)進(jìn)行曝光檢測(cè)信號(hào)。結(jié)果表明，重組腺病 毒約在蛋白質(zhì)預(yù)染Marker 40KD處，相當(dāng)于蛋白質(zhì)非預(yù)染Marker約35KD位置處與HPV16E7 鼠單克隆抗體和抗HPV16E6山羊多克隆抗體均有一反應(yīng)條帶，而腺病毒對(duì)照在相應(yīng)位置無(wú) 反應(yīng)條帶，與E7E6融合蛋白預(yù)計(jì)分子量相符，結(jié)果如圖7A和B所示。實(shí)施例8 重組腺病毒rAd5HPV16SmE7E6的動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)本實(shí)施例為使用本發(fā)明的重組腺病毒rAd5HPV16SmE7E6對(duì)小鼠進(jìn)行免疫后，檢測(cè) 血清特異性抗體和細(xì)胞免疫反應(yīng)，并進(jìn)行了抗腫瘤移植和抑制腫瘤生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)，具體如下。(1)重組腺病毒rAd5HPV16SmE7E6免疫小鼠后血清特異性抗體和細(xì)胞免疫反應(yīng)檢 測(cè)使用由前述實(shí)施例6制備得到的重組腺病毒rAd5HPV16SmE7E61 X 107pfu肌肉注 射免疫C57BL/6小鼠，二周后相同方式加強(qiáng)免疫一針，免疫結(jié)束后14天進(jìn)行血清特異性抗 體檢測(cè)和細(xì)胞免疫檢測(cè)。a.特異性抗體檢測(cè)取血清，用酶聯(lián)免疫法(ELISA)進(jìn)行E7抗體和E6抗體的檢 測(cè)，以試劑組PBS為陰性對(duì)照。結(jié)果重組腺病毒誘發(fā)的E7抗體水平較低，滴度為1 20，E6抗體未檢測(cè)到。b.細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測(cè)取脾細(xì)胞，用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(ELISP0T)方法進(jìn)行E7蛋白第 49-57位肽刺激產(chǎn)生的特異性分泌IFN- γ的效應(yīng)T細(xì)胞的數(shù)目檢測(cè)。結(jié)果如圖8所示，HPV16E 749_57肽刺激免疫重組腺病毒的小鼠后產(chǎn)生分泌IFN- γ的 效應(yīng)T細(xì)胞數(shù)斑點(diǎn)數(shù)為329，而PBS和對(duì)照組則沒(méi)有檢測(cè)到相應(yīng)的斑點(diǎn)數(shù)。兩者具有明顯的 差別，說(shuō)明重組腺病毒rAd5HPV16SmE7E6能夠誘發(fā)小鼠產(chǎn)生針對(duì)HPV16E7的特異性T細(xì)胞 介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答。ELISP0T 檢測(cè)方法請(qǐng)參見(jiàn) Miyahira Y, et al. Quantification of antigenspecific CD8+T cell using an ELISPOT assay. J Immunol Methods,1995, 181 (1) :45-54.以及 Murali-Krishna K, et al. Counting antigen-speific CD8 Tcells a reevaluation of bystander activation during viral infection. Immunity, 1998, 8(2) : 1771-87)。具體操作步驟請(qǐng)參見(jiàn)ELISPOT試劑盒說(shuō)明書(shū)(ELISPOT試劑盒為U-CyTech 公司產(chǎn)品，購(gòu)自深圳達(dá)科維生物技術(shù)有限公司)。(2)重組腺病毒rAd5HPV16SmE7E6的抗腫瘤移植實(shí)驗(yàn)用前述實(shí)施例6制備得到的重組腺病毒rAd5HPV16SmE7E61 X IO7Pfu肌肉注射免 疫C57BL/6小鼠，兩周后相同方式加強(qiáng)免疫，免疫結(jié)束后兩周，用5xl04TC-l腫瘤細(xì)胞(TC-1 腫瘤細(xì)胞系HPV16-E6、E7和ras基因轉(zhuǎn)化的C57BL/6小鼠肺上皮細(xì)胞，可穩(wěn)定表達(dá)和遞呈 E6、E7 蛋白，由 John Hopkins 大學(xué) Τ. C. Wu 教授饋贈(zèng)，見(jiàn)參考文獻(xiàn)Lin KY, Guarnieri FG, Stavelev-o‘Canrrol1 KF,et al. Treatment of established tumor with a novelvaccine that enhance major histocompatibility class II presentation of tumorantigen. Cancer Res, 1996, 56 (1) :21 26)皮下接種小鼠腹股溝處，觀察腫瘤生長(zhǎng)情況每周兩次。結(jié)果如圖9所示，表明經(jīng)重組腺病毒rAd5HPV16SmE7E6免疫后的小鼠對(duì)腫瘤的生 長(zhǎng)有明顯抑制作用，可完全保護(hù)小鼠免受TC-I腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)攻擊。(3)重組腺病毒rAd5HPV16SmE7E6對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用先用5xl04TC_l腫瘤細(xì)胞注射C57BL/6小鼠腹股溝處，制備出荷瘤小鼠。第二天用實(shí)施例6制備得到的重組腺病毒rAd5HPV16SmE7E61 X 107pfu肌肉注射免疫上述荷瘤小鼠， 10天后相同劑量加強(qiáng)免疫，觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，每周2次。 結(jié)果如圖10所示，表明重組腺病毒rAd5HPV16SmE7E6明顯抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)， 小鼠TC-I腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)完全抑制，保護(hù)率為100%。
0105]序列表0106]<110>中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所0107]<120>HPV 16型E7E6融合蛋白基因、表達(dá)載體、方法、細(xì)胞和用途0108]<130>DIC091101300109]<160>50110]<170>PatentIn version 3.30111]<210>10112]<211>2550113]<212>PRT0114]<213>HPV16SmE7E6 融合蛋白0115]<400>10116]Met His GlyAspThrProThrLeuHisGluTyrMetLeuAspLeuGln0117]1510150118]Pro Glu ThrThrAspLeuTyrGlyTyrGlyGlnLeuAsnAspSerSer0119]2025300120]Glu Glu GluAspGlulieAspGlyProAlaGlyGlnAlaGluProAsp0121]3540450122]Arg Ala HisTyrAsnlieValThrPheCysCysLysCysAspSerThr0123]5055600124]Leu Arg LeuCysValGlnSerThrHisValAsplieArgThrLeuGlu0125]657075800126]Asp Leu LeuMetGlyThrLeuGlylieValCysProlieCysSerGln0127]8590950128]Lys Pro HisGlnLysArgThrAlaMetPheGlnAspProGlnGluArg0129]1001051100130]Pro Arg LysLeuProGlnLeuCysThrGluLeuGlnThrThrlieHis0131]1151201250132]Asp lie lieLeuGluCysValTyrCysLysGlnGlnLeuLeuArgArg0133]1301351400134]Glu Val TyrAspPheAlaPheArgAspGlyCyslieValTyrArgAsp0135]1451501551600136]Gly Asn ProTyrAlaValCysAspLysCysLeuLysPheTyrSerLys0137]1651701750138]lie Ser GluTyrArgHisTyrCysTyrSerLeuTyrGlyThrThrLeu0139]180185190
Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu lie Arg Cys Ile
195200205
Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys ProGlu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp
210215220
Lys Lys Gln Arg Phe His Asn lie Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys
225230235240
Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg Arg Glu Thrjln Leu
245250255
<210>2
<211>771
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
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30
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3權(quán)利要求
1.一種人乳頭瘤病毒(HPV) 16型E7E6融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸 序列為SQE. ID. NO. 1所示的序列。
2.一種用于編碼權(quán)利要求1所述融合蛋白的DNA序列，其特征在于，所述DNA序列的核 苷酸序列為SQE. ID. NO. 2所示的序列。
3.一種用于表達(dá)權(quán)利要求1所述融合蛋白的表達(dá)載體，其特征在于，所述表達(dá)載體含 有權(quán)利要求2所述的DNA序列；優(yōu)選地，所述表達(dá)載體為重組腺病毒。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述重組腺病毒是復(fù)制缺陷型腺病 毒，其是由腺病毒穿梭質(zhì)粒和腺病毒骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染腺病毒包裝細(xì)胞得到的；優(yōu)選地，所述腺病毒穿梭質(zhì)粒選自pDC316、pDC311、pDC312和pDC315，其是通過(guò)將權(quán)利 要求2所述的DNA序列插入至所述腺病毒穿梭質(zhì)粒的Bgl II位點(diǎn)之間來(lái)構(gòu)建的；和/或所 述腺病毒骨架質(zhì)粒為pBHGloxAEl，3Cre ；進(jìn)一步優(yōu)選地，所述重組腺病毒所述包裝細(xì)胞優(yōu)選選自人胚腎293細(xì)胞、人胚腎293T 細(xì)胞、人胚腎293FT細(xì)胞和人胚腎293F細(xì)胞。
5.一種用于表達(dá)權(quán)利要求1所述融合蛋白的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞是 由權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體感染或轉(zhuǎn)染得到的；優(yōu)選地，所述表達(dá)載體為重組腺病毒；更優(yōu)選地，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞為人胚腎293細(xì)胞、人胚腎293T細(xì)胞、人胚腎293FT細(xì)胞 和人胚腎293F細(xì)胞。
6.一種表達(dá)權(quán)利要求1所述融合蛋白的方法，其特征在于，該方法包括構(gòu)建含有權(quán)利 要求2所述DNA序列的表達(dá)載體，并使該表達(dá)載體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中得到表達(dá)；優(yōu)選地，所述表達(dá)載體為重組腺病毒；更優(yōu)選地，所述細(xì)胞為人胚腎293細(xì)胞、人胚腎293T細(xì)胞、人胚腎293FT細(xì)胞和人胚腎 293F細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟1)將權(quán)利要求2所述的DNA序列插入至腺病毒穿梭質(zhì)粒，構(gòu)建出重組腺病毒穿梭質(zhì)粒；2)將步驟1)所構(gòu)建的重組腺病毒穿梭質(zhì)粒與腺病毒骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染人胚腎293細(xì)胞；3)將步驟2)所得到的細(xì)胞進(jìn)行離心后，用無(wú)菌PBS重懸細(xì)胞沉淀，反復(fù)凍融后，再次離 心，上清液即為含重組腺病毒的原代病毒液；4)將步驟3)中的原代病毒液進(jìn)行單斑純化，并通過(guò)PCR鑒定后篩選出正確的重組腺病5)將步驟4)中所篩選出的重組腺病毒在293細(xì)胞中傳代擴(kuò)增。
8.一種制備用于治療人乳頭瘤病毒(HPV) 16型感染及相關(guān)疾病(如宮頸癌)藥物的方 法，其特征在于，該方法包括將權(quán)利要求2所述的DNA序列、權(quán)利要求3或4所述的表達(dá)載 體、權(quán)利要求5所述的細(xì)胞用于表達(dá)權(quán)利要求1所述的人乳頭瘤病毒(HPV) 16型E7E6融合 蛋白。
9.權(quán)利要求1所述的融合蛋白、權(quán)利要求2所述的DNA序列、權(quán)利要求3或4所述的表 達(dá)載體、權(quán)利要求5所述的細(xì)胞在制備用于治療人乳頭瘤病毒(HPV) 16型感染及相關(guān)疾病(如宮頸癌)藥物中的應(yīng)用； 優(yōu)選地，所述藥物為疫苗。
10. 一種用于治療宮頸癌的疫苗，其特征在于，所述疫苗包括權(quán)利要求1所述的融合蛋 白、權(quán)利要求2所述的DNA序列、權(quán)利要求3或4所述的表達(dá)載體、或權(quán)利要求5所述的細(xì) 胞。
全文摘要
本發(fā)明提供一種編碼HPV 16型E7E6融合蛋白的基因、表達(dá)載體、方法、細(xì)胞和用途。本發(fā)明利用重組腺病毒，將經(jīng)修飾失去轉(zhuǎn)化活性的E6、E7蛋白基因融合，并根據(jù)融合蛋白的氨基酸序列進(jìn)行哺乳細(xì)胞密碼子優(yōu)化改造，使之在哺乳細(xì)胞中能高水平表達(dá)。本發(fā)明成功設(shè)計(jì)了E7E6融合蛋白哺乳細(xì)胞密碼子優(yōu)化基因，并成功構(gòu)建了高表達(dá)HPV16型E7E6融合蛋白的重組腺病毒，其具有強(qiáng)的免疫源性，可誘發(fā)特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng)，完全保護(hù)免疫小鼠抵抗腫瘤細(xì)胞的攻擊。本發(fā)明可用于研發(fā)宮頸癌的治療性宮頸癌疫苗。
文檔編號(hào)C12N15/62GK102002105SQ200910091978
公開(kāi)日2011年4月6日 申請(qǐng)日期2009年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月3日
發(fā)明者任皎, 馮靖, 吳小兵, 龐正, 田厚文, 趙莉, 阮力, 高見(jiàn) 申請(qǐng)人:中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所