專利名稱：：豬繁殖與呼吸綜合征病毒rt-lamp檢測試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及豬繁殖與呼吸綜合征病毒RT-LAMP檢測試劑盒及其檢測方法，屬于獸用生物制品領(lǐng)域中的疫病診斷技術(shù)。
背景技術(shù)：
：豬繁殖與呼吸綜合征，又稱藍(lán)耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirus,PRRSV)弓i起一種以母豬繁殖障礙和仔豬呼吸道疾病為特征的傳染病，是對養(yǎng)豬業(yè)威脅較大的傳染病。PRRSV屬于套式病毒目，動脈炎病毒科。此囊膜病毒為正股單鏈RNA病毒，其基因長度為15kb。目前中國流行的PRRSV病毒毒株為美洲型及NSP2變異的美洲型PRRSV毒株(高致病性藍(lán)耳病毒株)。目前該病毒的檢測方法有RT-PCR方法、細(xì)胞分離鑒定和ELASA等方法。但在實(shí)際PRRSV檢測工作中，所采用的檢測技術(shù)手段存在的如下問題-.普通的PCR方法容易產(chǎn)生假陽性，對模板質(zhì)量要求高；普通的血清學(xué)方法敏感度不夠，操作繁瑣，不適合更高要求的抗原檢測工作；細(xì)胞分離培養(yǎng)鑒定周期長，對實(shí)驗(yàn)條件要求苛刻。環(huán)介導(dǎo)的等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)是由T.Notomi等發(fā)明的一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)(Notomi,T.，etal.,Loop-mediatedisothermalamplificationofDNA.NucleicAcidsRes.2000,28,e63.),該技術(shù)依賴4條特異設(shè)計(jì)的引物和一種具有鏈置換特性的DNA聚合酶，在等溫條件下可以高效、高特異地?cái)U(kuò)增靶序列。近年來，國外已將該技術(shù)廣泛應(yīng)用于病原體檢測。MasakiImai等人(2007)針對四種香酒酵母的ITS序列設(shè)計(jì)了LAMP特異性引物，建立了高效的LAMP檢測體系。LAMP還可以檢測其他與人類相關(guān)的病毒，如病毒性出血性敗血病(VHS)、巨細(xì)胞病毒(CMV)、埃博拉病毒(EBOV)、慢性伯基特淋巴瘤病毒(EBV)、彩虹病毒、人類皰疹病毒8型、造血組織壞死病毒(IHHNV)、番茄斑萎病毒、番茄黃化曲葉病毒等。目前國內(nèi)外均未見有用于檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的RT-LAMP試劑盒及LAMP方法在豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測中的應(yīng)用，也未見有針對PRRSV美洲型經(jīng)典毒株和高致病性藍(lán)耳病病毒(NSP2變異的美洲型PRRSV)毒株有效區(qū)分的LAMP檢測方法的報(bào)道。本發(fā)明的豬繁殖與呼吸綜合征病毒RT-LAMP檢測試劑盒及其檢測方法避免了上述檢測手段存在的問題，相較其他的檢測手段，建立的PRRSVRT-LAMP方法具有特異性強(qiáng)、敏感度高、檢測周期短、操作簡單方便的特點(diǎn)，有效的解決了在檢測工作中使用的其他技術(shù)手段存在的問題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是建立檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒，特別是可用于區(qū)分PRRSV美洲型經(jīng)典株和NSP2變異株的RT-LAMP檢測方法，并提供一種用于以上目的的RT-LAMP試劑盒。本發(fā)明的技術(shù)方案本發(fā)明的原理及技術(shù)路線本發(fā)明將建立針對PRRSV美洲型經(jīng)典毒株及PRRSVNSP2變異株(高致病性藍(lán)耳病毒株)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)檢測方法，本方法具有多引物同時(shí)擴(kuò)增，并在兩端形成了帶有引物功能的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，這種多引物結(jié)合和可自產(chǎn)生引物的原理使其具有了靈敏度高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，由于RT和LAMP反應(yīng)在同管中同時(shí)進(jìn)行簡化了操作步驟，同時(shí)因?yàn)镽T-LAMP反應(yīng)的產(chǎn)物中包含大量核酸和焦磷酸鎂的沉淀，可以用熒光劑顯色來驗(yàn)證，并且反應(yīng)物中的目的片段含有酶切位點(diǎn)，可以用酶切鑒定、瓊脂糖凝膠電泳等辦法來驗(yàn)證反應(yīng)結(jié)果，適用于各種實(shí)驗(yàn)條件下檢測工作的使用。本發(fā)明的方法具體實(shí)施1豬PRSSVRT-LAMP檢測方法的建立和驗(yàn)證(1)反應(yīng)用試劑的制備1)引物設(shè)計(jì)、篩選PRRSVRT-LAMP引物設(shè)計(jì)與篩選根據(jù)GenBank公布的經(jīng)典的PRRSV(美洲株VR-2332)、其他4株美洲型毒株及NSP2變異的美洲型PRRSV毒株(高致病性藍(lán)耳病GD株、北京株)基因序列為模板，在高致病性藍(lán)耳病病毒NSP2變異株缺失90bp核苷酸序列兩側(cè)設(shè)計(jì)RT-LAMP檢測引物，利用LAMPTubidimeter分析儀對不同引物的結(jié)果反應(yīng)進(jìn)行篩選，由其中選出兩對引物F3:CAGATCCGATTGCGGCAGB3:TTCTACGCGGTGCAGGAAFIP:CATCGGCTCGGATGGTGTCGATGGGCGACAATGTCCCTABIP:ACCCATGAGTGAGCCCGTACTCGACCCACTCAAAGGTTTCA2)RT-LAMP反應(yīng)體系中試劑的配制(50個(gè)反應(yīng)量)①引物混合液(PM):取100pmollF32.5^1、100pmol/nlB32.5)nl、lOOpmol/plFIP20|al，100pmol爾lBIP20^1P混合后加滅菌去離子水5^1，總體系50pl。每個(gè)反應(yīng)需取PB。②反應(yīng)緩沖混合液(RM):取4mmoll硫酸鎂取50W、1.6moll甜菜堿5(Vl、lOmmol/pldNTPs50pl，溶于475nlPCR級水中定溶至625pl。每個(gè)反應(yīng)需取12.5plRB。③反應(yīng)酶混合液(EM):取16UlBst大片段DNA聚合酶2化1，400U1AMV反轉(zhuǎn)錄酶24nl，1^imol/nlDTT2pl。每個(gè)反應(yīng)需要取1^1EB。④顯色劑，取1plSYBRgreenl(購自Invitrogen公司)溶于49nlPCR級水。每個(gè)反應(yīng)加1^1。⑤限制性內(nèi)切酶SpuI:Spu11000u/ml(購自NEB公司)。(2)樣品RNA的制備1)RNA提取試劑(LBBII-RNA)RA:取1%2-巰基乙醇0.60ml、l%Tris-HCL(pH8.0)0.60ml、10mmol/mlEDTAlml溶于5.0ml滅菌雙蒸水中。RB:6mmol/ml異硫氰酸胍35ml.RC:無水乙醇15ml。RD:1OOu爾lDNAseA20^1溶于1OmlDEPCH20。2)樣品RNA的提取取100^d細(xì)胞培養(yǎng)物(或血清樣品、組織研磨樣品)，經(jīng)反復(fù)凍融3次后，按如下步驟進(jìn)行操作樣品中加入樣品等體積RA，渦旋15s，12000g離心lmin，取上清置于新管中；在1中上清液中加入3倍的RB溶液，渦旋或劇烈震蕩90s，靜置3min;加入1/3體積的RC溶液，渦旋lmin，12000g離心lmin。棄去上清液；放置5min后樣品干燥，再加入11^1RD，溶解沉淀，即為樣品RNA，作為擴(kuò)增用的RNA模板。(3)樣品檢測1)第一步(反應(yīng)體系為2(Hil)①配制RT-LAMP反應(yīng)液RM12.5pl，EMl.Onl，PM1.0^1;②取5.5nl樣品RNA加到①項(xiàng)配制的RT-LAMP反應(yīng)液中；③混和后在6065°C恒溫水浴鍋中作用45min。④結(jié)果判定反應(yīng)后在PRSSVRT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物中加入lnL的顯色劑，反應(yīng)結(jié)束后肉眼觀察反應(yīng)液顏色變化。陰性反應(yīng)的反應(yīng)液呈現(xiàn)橘紅色，陽性樣品的反應(yīng)液呈綠色(見附圖1)。2)第二步，當(dāng)?shù)谝徊浇Y(jié)果為陽性并需進(jìn)一步確定其產(chǎn)物是PRRSV美洲型經(jīng)典毒株或是PRRSVNSP2變異的高致病性藍(lán)耳病毒株時(shí)進(jìn)行①在PRRSVRT-LAMP反應(yīng)的陽性產(chǎn)物取出lpL中加入Spul酶體系9pL，共10pL體系于37。C溫浴作用lh。②制備1%的瓊脂糖凝膠。③將①中酶切產(chǎn)物在②中所述的凝膠中進(jìn)行電泳。使用Marker2000plus作為電泳參照標(biāo)準(zhǔn)。④觀察結(jié)果判評定標(biāo)準(zhǔn)為出現(xiàn)附圖8所示lane1為豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型NSP2變異株(高致病性藍(lán)耳病毒株)RT-LAMP產(chǎn)物經(jīng)Spul酶作用后電泳結(jié)果；出現(xiàn)附圖8所示Lane2為經(jīng)典型美洲株RT-LAMP產(chǎn)物經(jīng)Spul酶作用后電泳結(jié)果。(4)反應(yīng)結(jié)果的驗(yàn)證1)RT-LAMP產(chǎn)物的電泳鑒定結(jié)果在生物安全柜中，取10PRRSVRT-LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠上電泳檢測，100U30min觀察結(jié)果。PRRSV美洲型經(jīng)典毒株(VR-2332)和NSP2變異株的RNA樣品RT-LAMP檢測，結(jié)果均呈陽性，RT-LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物中核酸電泳條帶呈階梯狀分布(lane2、3、4、5),與理論結(jié)果相符。陰性(lanel)對照未見特異性產(chǎn)物出現(xiàn)(見圖2)。2)RT-LAMP產(chǎn)物的酶切鑒定將RT-LAMP產(chǎn)物采用限制性內(nèi)切酶Spul進(jìn)行酶切鑒定。按說明書配制反應(yīng)液，37'C作用1h后，取lOpL反應(yīng)產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳并觀察結(jié)果(如圖3)。lane2為VR-2332毒株RT-LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)內(nèi)切酶Spul消化后，形成以條帶約為160bp和120bp為主的電泳帶型，而NSP2變異的高致病性藍(lán)耳病病毒(GD株)擴(kuò)增產(chǎn)物不受影響，與預(yù)期結(jié)果相符。3)RT-LAMP產(chǎn)物的可視化鑒定結(jié)果在RT-LAMP反應(yīng)結(jié)束后，在PRSSVRT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物中加入lpL的顯色劑，肉眼觀察反應(yīng)液顏色變化。陰性反應(yīng)的反應(yīng)液呈現(xiàn)橘紅色，陽性樣品的反應(yīng)液呈綠色(見附圖4)。4)PRRSVRT-LAMP特異性試驗(yàn)抽提PRSSVVR-2332毒株、GD株等病毒核酸，按照所建立的PRRSVRT-LAMP檢測方法，進(jìn)行特異性試驗(yàn)。分別提取豬瘟病毒、豬流感病病毒、豬圓環(huán)病毒、豬細(xì)小病病毒對照樣品核酸，以豬繁殖與呼吸綜合征病毒RNA作為陽性對照，以DEPC處理的水作為陰性對照，檢測所建立RT-LAMP方法的特異性，結(jié)果陽性對照和陰性對照均成立，PRRSV呈陽性，其它試驗(yàn)樣品呈陰性(見附圖5)，結(jié)果表明該方法對PRRSV具有特異性。5)PRRSVRT-LAMP敏感性試驗(yàn)提取PRRSVGD株(滴度為100TCID5G)的RNA，進(jìn)行10倍系列稀釋(11.0x10—6等7個(gè)稀釋度)，用所建立的RT-LAMP檢測方法進(jìn)行敏感性試驗(yàn)，對反應(yīng)產(chǎn)物用凝膠電泳來驗(yàn)證。電泳結(jié)果顯示，隨著模板濃度的降低，擴(kuò)增產(chǎn)物條帶的亮度從差異不顯著，至10—6稀釋度時(shí)沒有擴(kuò)增產(chǎn)物也無條帶出現(xiàn)(見圖6)。6)PRRSVRT-LAMP田間應(yīng)用結(jié)果采集30份PRRS高發(fā)地區(qū)的豬血清和發(fā)病豬病料，并用Marcl45細(xì)胞分離培養(yǎng)，同時(shí)提取30份樣品的總RNA，用建立的RT-LAMP檢測方法和RT-PCR方法同時(shí)進(jìn)行檢測，并用Spul酶切RT-LAMP的產(chǎn)物。結(jié)果顯示30份樣品中RT-LAMP檢測出有7份樣品為PRRSV陽性，與Marcl45細(xì)胞培養(yǎng)、RT-PCR檢測(用中國動物疾病控制中心研制的專門針對變異株的試劑盒)的綜合結(jié)果吻合率為100%。其中5份陽性樣品中的RT-LAMP產(chǎn)物可被SpuI酶切，初步確定為美洲型經(jīng)典毒株，結(jié)果見表l。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>2試劑盒的制備(50個(gè)反應(yīng)量/盒)(1)提取樣品RNA的所需試劑LBBII-RNA的配制RA:取P/o2-巰基乙醇0.6ml、pH8.0l%Tris-HCL0.6ml、10纖ol/mlEDTAlml溶于5.0ml滅菌雙蒸水中，裝至無核酶的塑料容器中。RB:6mmol/ml異硫氰酸胍35ml，裝至無核酶的塑料容器中。RC:無水乙醇15ml，裝至無核酶的塑料容器中。RD:100u^lDNAseA2(Vl溶于10mlDEPCH2O,裝至無核酶的塑料容器中。(2)反應(yīng)用試劑的制備①PM:取2.5pllOOpmol/plF3、2.5^1lOOpmol/plB3、2(^1lOOpmol/plFIP，20(^1100pmol/plBIP混合后加滅菌去離子水5^1，總體系50^1，裝至無核酶的塑料容器中。②RM:取4mmol4tl硫酸鎂取5(^1、1.6mol4d甜菜堿50pl、10mmol/pldNTPs50pl，溶于475nlPCR級水中定溶至625pl，裝至無核酶的塑料容器中。③EM:取16U/plBst大片段DNA聚合酶24pl，400U/nlAMV反轉(zhuǎn)錄酶24pl，1nmol/plDTT2pl，裝至無核酶的塑料容器中。④顯色劑取1plSYBRgreenl(購自Invitrogen公司)溶于49plPCR級水，裝至無核酶的塑料容器中。⑤限制性內(nèi)切酶Spul:Spu11000uAnl(購自NEB公司)。3.試劑盒的使用1)使用LBBII-RNA提取樣品RNA取100pl細(xì)胞培養(yǎng)物(或血清、組織研磨樣品)，經(jīng)反復(fù)凍融3次后，按如下步驟操作-樣品中加入樣品等體積RA，渦旋15s，12000g離心lmin，取上清置于小管中；在上清液中加入3倍的RB溶液，渦旋或劇烈震蕩90s，靜置3min;加入1/3體積的RC溶液，渦旋lmin,12000g離心lmin。棄去上清液；待樣品干燥后加入11plRD，溶解沉淀，即為樣品RNA。2)RT-LAMP反應(yīng)①配制RT-LAMP反應(yīng)液RM12.5pl，EM1.0|J，PM1.0pl;②取5.5nl樣品RNA加到l)項(xiàng)配制的反應(yīng)液中③混和后在6065。C恒溫水浴鍋中作用45min。3)結(jié)果判定反應(yīng)后在PRRSV-RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物中加入1的顯色劑，肉眼觀察反應(yīng)液顏色變化。陰性反應(yīng)的反應(yīng)液呈現(xiàn)橘紅色，陽性樣品的反應(yīng)液呈綠色(見附圖7)。當(dāng)?shù)谝徊浇Y(jié)果為陽性并需進(jìn)一步確定其產(chǎn)物是PRRSV美洲型經(jīng)典毒株或是PRRSVNSP2變異的高致病性藍(lán)耳病毒株時(shí)進(jìn)行①從PRRSVRT-LAMP反應(yīng)的陽性產(chǎn)物取出lpL中加入Spul酶體系9pL，共10pL體系于37'C溫浴作用lh。②制備1%的瓊脂糖凝膠。③將①中酶切產(chǎn)物在②中所述的凝膠中進(jìn)行電泳。使用Marker2000plus作為電泳參照標(biāo)準(zhǔn)。④觀察結(jié)果判評定標(biāo)準(zhǔn)為出現(xiàn)附圖8所示lane1為豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型NSP2變異株(高致病性藍(lán)耳病毒株)RT-LAMP產(chǎn)物經(jīng)Spul酶作用后電泳結(jié)果；出現(xiàn)附圖8所示Lane2、3為經(jīng)美洲典型株RT-LAMP產(chǎn)物經(jīng)Spul酶作用后電泳結(jié)果。圖h反應(yīng)產(chǎn)物加入顯色劑顯色結(jié)果1.陽性樣品2.陰性樣品。圖2.RT-LAMP產(chǎn)物的電泳鑒定結(jié)果M:DL2000PlusMarkerlane1:陰性對照lane2、3:PRRSV(VR-2332)lane4、5:PRRSVGDstrain圖3PRRSV的RT-LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物限制性內(nèi)切酶Spul酶切電泳成像laneM:DL2000Plus,lanel:GD株RT-LAMP產(chǎn)物，lane2:VR-2332株RT-LAMP產(chǎn)物。圖4:反應(yīng)產(chǎn)物加入顯色劑顯色結(jié)果1、3為陽性樣品2、4為陰性樣品圖5:PRRSVRT-LAMP特異性試驗(yàn)結(jié)果13:PRRSV(GDstrain)lane46:PRRSV(VR-2332)lane7:CHLVLane8:SIVlane9:PCV2laneIO:PPV圖6:VR-2332株RT-LAMP敏感性試驗(yàn)產(chǎn)物凝膠電泳成像laneM:DL2000PlusMarker,lanel:陰性對照，Lane2國9:病毒稀釋度分別為10-8、10-7、10-6、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5。圖7:反應(yīng)產(chǎn)物加入顯色劑顯色結(jié)果l為陰性樣品2、3、4和5為陽性樣品圖8RT-LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物Spul酶切電泳成像結(jié)果Lanel:SD2(酶切陰性)，Lane2:HN13、lane3:SD1。圖9:反應(yīng)產(chǎn)物加入顯色劑顯色結(jié)果1、2、3為陽性樣品4為陰性樣品本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其積極效果表現(xiàn)在本發(fā)明涉及一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒RT-LAMP檢測試劑盒及其檢測方法。根據(jù)GenBank公布的豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRSSV)序列，設(shè)計(jì)了PRSSVRT-LAMP反應(yīng)系統(tǒng)所需引物；采用本發(fā)明人設(shè)計(jì)并配制的病毒RNA提取試劑提取PRSSV病毒RNA，使用本發(fā)明建立的PRSSVRT-LAMP反應(yīng)體系進(jìn)行檢測，反應(yīng)結(jié)束后加入顯色劑判定結(jié)果，結(jié)果顯示在63°C45min，PRSSV病毒RNA獲得了高效的特異性擴(kuò)增；再利用Supl酶切進(jìn)行豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型經(jīng)典株和NSP2變異株的快速檢測。相較現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有檢測速度快，靈敏度強(qiáng)并能區(qū)分檢測美洲型經(jīng)典毒株和NSP2變異株，而且反應(yīng)成本低、操作便捷，適合多層次的檢領(lǐng)孺求。實(shí)施例以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不作為對本發(fā)明的限制。實(shí)施例1PRRSVRT-LAMP引物設(shè)計(jì)與篩選根據(jù)GenBank公布的經(jīng)典的PRRSV(美洲株VR-2332)、其他4株美洲型毒株及NSP2變異的美洲型PRRSV毒株(高致病性藍(lán)耳病GD株、北京株)基因序列為模板，在高致病性藍(lán)耳病病毒NSP2變異區(qū)所缺失卯bp核苷酸序列兩側(cè)設(shè)計(jì)RT-LAMP檢測引物，利用LAMPTubidimeter對不同引物的結(jié)果反應(yīng)進(jìn)行篩選，由其中選出序列以下所示2對引物F3:CAGATCCGATTGCGGCAGB3:TTCTACGCGGTGCAGGAAFIP:CATCGGCTCGGATGGTGTCGATGGGCGACAATGTCCCTABIP:ACCCATGAGTGAGCCCGTACTCGACCCACTCAAAGGTTTCA并確定以上引物在引物混合液(PrimerMix，PM)各成分的比例100pmo，F(xiàn)32.5^1、100pmo,B32.5^1、畫pmo攀FIP20^1，100pmol/(ilBIP20^1混合后加滅菌去離子水5pl，總體系5(Vl。實(shí)施例2試劑盒內(nèi)組分的配制按以下各種組分的配方(50個(gè)反應(yīng)量)配制成各種組分并分裝到玻璃或塑料小容器中并用相應(yīng)的塞子密封1.LBBII-RNA，本試劑組由RA、RB、RC、RD四部分構(gòu)成RA:取1。/02-巰基乙醇0.6ml、pH8.0l%Tris-HCL0.6ml、10mmol/mlEDTAlml溶于5.0ml滅菌雙蒸水中。RB:6mmol/ml異硫氰酸胍35ml。RC:無水乙醇15ml。RD:100u小lDNAseA20nl溶于10mlDEPCH2O，2.LAMP反應(yīng)試劑1)PM:取2.5pl100pmol/plF3、2.5^1100pmol/nlB3、20^1lOOpmo,FIP，20nl100pmol/nlFIP混合后加滅菌去離子水5pl，總體系50W。每個(gè)反應(yīng)需取1^1PB。2)RM:取4mmol/nl硫酸鎂取5(Vl、1.6mol/nl甜菜堿5(Vl、10mmol/WdNTPs50W，溶于475plPCR級水中定溶至625pl。每個(gè)反應(yīng)需取12.5plRB。3)EM:取16U"lBst大片段DNA聚合酶24W，400U/plAMV反轉(zhuǎn)錄酶2化1，1pmol/VlDTT2(il。每個(gè)反應(yīng)需要取lplEB。4)顯色劑顯色劑由單一試劑SYBRgreenI熒光素構(gòu)成(購自Invitrogen公司)，取1lilSYBRgreenI溶于49plPCR級水。每個(gè)反應(yīng)加1^1。3.限制性內(nèi)切酶SpuI1000u/ml(購自NEB公司)。實(shí)施例3PPRSVRT-LAMP試劑盒的使用1.使用LBBII-RNA提取樣品RNA取lOOpl細(xì)胞培養(yǎng)物(或血清、組織研磨樣品)，經(jīng)反復(fù)凍融3次后，按如下步驟操作樣品中加入樣品等體積RA，渦旋15s，12000g離心lmin，取上清置于小管中；在上清液中加入3倍的RB溶液，渦旋或劇烈震蕩90s，靜置3min;加入1/3體積的RC溶液，渦旋lmin，12000g離心lmin。棄去上清液；待樣品干燥后加入RD，溶解沉淀，即為樣品RNA。2.PRSSVRT-LAMP反應(yīng)①配制RT-LAMP反應(yīng)液將RM12.5^1，EMl.Opl，PMl.Opl加到反應(yīng)管中；②取5.5itd樣品RNA加到①項(xiàng)配制的反應(yīng)液的管中；③混和后將反應(yīng)管置于6065。C恒溫水浴鍋中作用45min。3結(jié)果判定反應(yīng)后在PRRSV-RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物中加入1nL的顯色劑，肉眼觀察反應(yīng)液顏色變化。陰性反應(yīng)的反應(yīng)液呈現(xiàn)橘紅色，陽性樣品的反應(yīng)液呈綠色(見附圖9)。實(shí)施例4當(dāng)實(shí)施例3的檢測結(jié)果為陽性時(shí)，如需進(jìn)一步鑒別是PRRSV美洲型經(jīng)典毒株或是PRRSVNSP2變異的高致病性藍(lán)耳病毒株時(shí)進(jìn)行①在PRRSVRT-LAMP反應(yīng)的陽性產(chǎn)物取出lpL中加入Spul酶體系9pL，共lO^L體系于37'C溫浴作用lh。②制備1%的瓊脂糖凝膠。③將①中酶切產(chǎn)物在②中所述的凝膠中進(jìn)行電泳。使用Marker2000plus作為電泳參照標(biāo)準(zhǔn)。④觀察結(jié)果判評定標(biāo)準(zhǔn)為出現(xiàn)附圖8所示lane1為豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型NSP2變異株(高致病性藍(lán)耳病毒株)RT-LAMP產(chǎn)物經(jīng)Spul酶作用后電泳結(jié)果；出現(xiàn)附圖8所示Lane2為美洲型經(jīng)典株RT-LAMP產(chǎn)物經(jīng)Spul酶作用后電泳結(jié)果。序列表<110>中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所<120>豬繁殖與呼吸綜合征病毒LAMP檢測試劑盒及其檢測方法<160>4<210>1<211>18<212>DNA<213>ForwardOuterF3<223>人工序列<400>1CAGATCCGATTGCGGCAG18<210>2<211>18<212>DNA<213>ReverseOuterB3:<223>人工序列<400>2TTCTACGCGGTGCAGGAA18<210>3<211>39<212>DNA<213>ForwardInnerFIP:<223>人工序列<400>3CATCGGCTCGGATGGTGTCGATGGGCGACAATGTCCCTA39<210>4<211>41<212>DNA<213>ReverseInnerBIP14<223>人工序列<400>4ACCCATGAGTGAGCCCGTACTCGACCCACTCAAAGGTTTCA權(quán)利要求1.一種檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的RT-LAMP檢測試劑盒，其特征包含提取RNA試劑LBBII-RNA；RT-LAMP反應(yīng)試劑和限制性內(nèi)切酶SpuI三個(gè)組分。2.如權(quán)利要求1所述的一種檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的RT-LAMP試劑盒，其特征在于所述的提取RNA試劑LBBII-RNA含有以下溶液組成RA:取P/。2-巰基乙醇0.6ml、pH8.0l%Tris-HCL0.6ml、10mmol/mlEDTA1ml滅菌雙蒸水5.0ml;RB:6mmol/ml異硫氰酸胍35ml;RC:無水乙醇15ml;RD:lOOu/^ilDNAseA20nl、10mlDEPCH2O。3.如權(quán)利要求1所述的一種檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒RT-LAMP試劑盒，其特征在于所述的反應(yīng)試劑含以下溶液1)引物混合液PM:lOOpmol/plF32.5pl、lOOpmol/plB32.5^1、lOOpmol/plFIP20nl，100pmol/nlBIP20^1，去離子水5^1，總體系5(Hil;2)反應(yīng)緩沖混合液RM;取4mmol/^il硫酸鎂取5(Vl、1.6mol/nl甜菜堿50pl、10mmol/|aldNTPs50pl，溶于475plPCR級水中定溶至625nl。每個(gè)反應(yīng)需取12.5plRB。3)反應(yīng)酶混合液EM;取16U&1Bst大片段DNA聚合酶24^1，400U&1AMV反轉(zhuǎn)錄酶24pl，lnmol/nlDTT2pl。每個(gè)反應(yīng)需要取1^UEB。4)顯色劑顯色劑由單一試劑SYBRgreenI熒光素構(gòu)成(購自Invitrogen公司)，取lplSYBRgreenI溶于49plPCR級水。每個(gè)反應(yīng)加1^1。5)限制性內(nèi)切酶SpuI:Spu11000u/ml(購自NEB公司)。4.如權(quán)利要求1，3所述的一種用于檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的RT-LAMP試劑盒，其特征在于其中反應(yīng)引物混合液(PM)所使用的引物為F3:CAGATCCGATTGCGGCAGB3:TTCTACGCGGTGCAGGAAFIP:CATCGGCTCGGATGGTGTCGATGGGCGACMTGTCCCTABIP:ACCCATGAGTGAGCCCGTACTCGACCCACTCAAAGGTTTCA5.—種檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的RT-LAMP試劑盒的檢測方法，其特征是包括以下步驟1)提取待測樣品中的核酸；2)配制LAMP反應(yīng)液；3)取5.1)所述核酸5.加入步驟2)配制的反應(yīng)液中，終始反應(yīng)體積為20W，10000rpm瞬時(shí)離心30s以混勻反應(yīng)液；4)置6S"C恒溫45min進(jìn)行擴(kuò)增；5)判斷結(jié)果，判評定標(biāo)準(zhǔn)為出現(xiàn)綠色為待測樣品中存在豬繁殖與呼吸綜合征病毒；出現(xiàn)橙黃色為待測樣品中不存在豬繁殖與呼吸綜合征病毒。6)在PRRSV-RT-LAMP反應(yīng)的陽性產(chǎn)物取出lpL中加入Spul酶體系9pL，共10pL體系于37"C溫浴作用lh。7)制備1%的瓊脂糖凝膠。8)將6)中酶切產(chǎn)物在7)中所述的凝膠中進(jìn)行電泳。使用Marker2000plus作為電泳參照標(biāo)準(zhǔn)。9)觀察結(jié)果，判評定標(biāo)準(zhǔn)為出現(xiàn)附圖8所示kne1為豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型NSP2變異株(高致病性藍(lán)耳病毒株)RT-LAMP產(chǎn)物經(jīng)Spul酶作用后電泳結(jié)果；出現(xiàn)附圖8所示Lane2為美洲型經(jīng)典株RT-LAMP產(chǎn)物經(jīng)Spul酶作用后電泳結(jié)果。6.—種檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的RT-LAMP試劑盒的檢測方法，其特征是用LBBII-RNA提取樣品RNA包括以下步驟取100W細(xì)胞培養(yǎng)物或血清樣品或組織研磨樣品，經(jīng)反復(fù)凍融3次后，樣品中加入樣品等體積RA，渦旋15s，12000g離心lmin，取上清置于新管中；在上清液中加入3倍的RB溶液，渦旋或劇烈震蕩90s，靜置3rain;加入1/3體積的RC溶液，渦旋lmin,12000g離心lrain，棄去上清液放置5min后樣品干燥，再加入RD，溶解沉淀，即為樣品RNA。全文摘要本發(fā)明涉及一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒RT-LAMP檢測試劑盒及其檢測方法。根據(jù)GenBank公布的豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRSSV)序列，設(shè)計(jì)了PRSSVRT-LAMP反應(yīng)系統(tǒng)所需引物；采用本發(fā)明人設(shè)計(jì)并配制的病毒RNA提取試劑(LBBII-RNA)提取PRSSV病毒RNA，使用本發(fā)明建立的PRSSVRT-LAMP反應(yīng)體系進(jìn)行檢測，反應(yīng)結(jié)束后加入顯色劑判定結(jié)果，結(jié)果顯示在63℃45min，PRSSV病毒RNA獲得了高效的特異性擴(kuò)增；再利用SpuI酶切進(jìn)行豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型經(jīng)典株和NSP2變異株(高致病性藍(lán)耳病毒株)的快速檢測。相較現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有檢測速度快，靈敏度強(qiáng)并能區(qū)分檢測美洲型經(jīng)典毒株和NSP2變異株(高致病性藍(lán)耳病毒株)，而且反應(yīng)成本低、操作便捷，適合多層次檢測需求。文檔編號C12R1/93GK101575650SQ200910087099公開日2009年11月11日申請日期2009年6月24日優(yōu)先權(quán)日2009年6月24日發(fā)明者劉業(yè)兵,寧宜寶,磊張,堅(jiān)陳申請人:中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所