專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種改進(jìn)pva固定化微生物的新方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及到一種利用PVA-卡拉膠-海藻酸復(fù)合載體固定化微生物的新方法，屬于微生物科學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：固定化技術(shù)是使生物催化劑(酶、微生物細(xì)胞、動(dòng)植物細(xì)胞、細(xì)胞器等)更廣泛、更有效應(yīng)用的一種手段。微生物固定化技術(shù)是生物工程領(lǐng)域中的一項(xiàng)新興技術(shù)，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化工和環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域。微生物細(xì)胞的固定化方法有吸附法、交聯(lián)法和包埋法。其中以包埋法最為常用，包埋材料可分為天然高分子多糖類(lèi)和合成高分子化合物。作為包埋載體，天然高分子多糖類(lèi)的海藻酸鈉和卡拉膠應(yīng)用最多，它們具有固化、成形方便，對(duì)微生物毒性小，固定化微生物密度高等優(yōu)點(diǎn)。但它們抗微生物分解性能較差，機(jī)械強(qiáng)度較低。天然卡拉膠中含有人-卡拉膠，它使凝膠強(qiáng)度降低，除去^-卡拉膠所需的費(fèi)用較高，而且凝膠對(duì)鈉離子比較敏感。海藻酸鈣凝膠在磷酸鹽溶液中不穩(wěn)定。這兩種載體的凝膠雖然可用交聯(lián)劑進(jìn)行穩(wěn)定化處理，但活力和傳質(zhì)性能又會(huì)下降。海藻酸和卡拉膠作為天然高分子材料，以其安全、環(huán)保及優(yōu)良的工藝性能，是固定化微生物常用的載體。何俊培等(包裝與食品機(jī)械，2007，25(2):25一28)利用海藻酸鈉和卡拉膠固定化乳糖酶，研究了影響固定化酶的酶活回收率和固定化酶膠粒機(jī)械強(qiáng)度的因素。結(jié)果發(fā)現(xiàn)海藻酸鈉濃度、卡拉膠濃度和固定化酶量等因素會(huì)影響固定化酶的性能，通過(guò)采用三因素二次回歸旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)得到優(yōu)化條件為海藻酸鈉濃度為2.0%、卡拉膠濃度為0.8P/。、乳糖酶的濃度0.23%。由此得到的固定化酶的酶活回收率可達(dá)89.19%，固定化酶膠粒的機(jī)械強(qiáng)度為74.74%。但顆粒的機(jī)械強(qiáng)度和抗微生物分解性有待進(jìn)一步改善。合成高分子化合物中常用的載體物質(zhì)有聚丙烯酰胺、光硬化樹(shù)脂等。它們的突出優(yōu)點(diǎn)是抗微生物分解性能好，機(jī)械強(qiáng)度高，化學(xué)性能穩(wěn)定。但是聚合物網(wǎng)絡(luò)的形成條件比較劇烈，對(duì)微生物細(xì)胞的損害較大，而且成形的多樣性和可控性不好。適用于細(xì)胞固定化的光硬化樹(shù)脂聚合物一般尚未商品化，且固定化的操作條件也較嚴(yán)格。從目前的研究看，常用的固定化載體包括瓊脂、海藻酸、卡拉膠、聚乙烯醇(PVA)、聚丙烯酰胺等。聚乙烯醇(polyvinylalcohol,簡(jiǎn)稱(chēng)PVA)是一種新型的微生物包埋固定化載體，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下(—CH2—CH~CH2—CH—)nOHOH聚乙烯醇在加熱后溶于水，在其水溶液中加入添加劑后發(fā)生凝膠化，或在低溫(-10。C)下冷凍形成凝膠，從而將微生物包埋固定在凝膠網(wǎng)絡(luò)中。常用的添加劑有硼酸和硼砂，在聚乙烯醇水溶液中加入硼酸或硼砂，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)形成凝膠，其反應(yīng)原理為(—CH2—CH—CH2_CH—)n+nH3B03——>(—CH2—CH—CH2—CH—)nOHOHOOBOHPVA凝膠具有抗微生物分解性能強(qiáng)、價(jià)格低廉等一系列優(yōu)點(diǎn)，是一種具有實(shí)用潛力的包埋材料，近年來(lái)在國(guó)內(nèi)外獲得了較廣泛的研究。目前PVA固定化方法中存在的主要問(wèn)題是PVA是一種高粘性物質(zhì)，與H3BOs反應(yīng)較慢，成形能力較差，顆粒易黏附在一起。此外，硼酸上的三個(gè)羥基只部分地進(jìn)行了反應(yīng)，反應(yīng)后形成的高分子凝膠上還殘留有親水性的一OH，使得固定化顆粒在實(shí)際應(yīng)用中存在水溶膨脹性問(wèn)題。也就是說(shuō)，固定化微生物凝膠顆粒在使用過(guò)程中，隨著使用時(shí)間的延長(zhǎng)，其機(jī)械強(qiáng)度會(huì)因?yàn)槟z顆粒的水溶膨脹性而大大減弱，甚至出現(xiàn)顆粒破碎的現(xiàn)象，縮短了其使用壽命，不利于實(shí)際應(yīng)用。因此，如何改善PVA凝膠顆粒的成形及水溶膨脹性，是促進(jìn)PAV固定化微生物向?qū)嶋H應(yīng)用邁進(jìn)的關(guān)鍵。近年來(lái)，圍繞這些問(wèn)題，人們對(duì)完善PVA—H3B03包埋固定化微生物進(jìn)行了大量的工作，主要有固定化顆粒成球性能的改進(jìn)、機(jī)械強(qiáng)度的提高、減少固定化過(guò)程中的活性損失、調(diào)節(jié)固定化顆粒的比重、改善水力性能等。干信等(湖北工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，21(2):24—27)利用PVA—卡拉膠混合膠體固定化釀酒酵母，制備出機(jī)械強(qiáng)度高、傳質(zhì)效果好的凝膠顆粒。最佳的固定化條件為聚乙烯醇濃度8。/。、卡拉膠濃度0.5%、菌體添加量0.1g/mL、固定化時(shí)間24h。固定化小球能連續(xù)反應(yīng)60h以上，腺苷三磷酸產(chǎn)量達(dá)297.1mg/L，可用作腺苷三磷酸再生體系。但固定化微生物顆粒的綜合性能有待提高。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提出了一種綜合利用PVA-卡拉膠-海藻酸復(fù)合載體固定化微生物的新方法，以改進(jìn)PVA固定化微生物顆粒的性能。其特征在于，包括以下步驟(1)稱(chēng)取PVA、卡拉膠和海藻酸鈉并與水混合，水浴加熱至完全溶化，然后靜置冷卻至405(TC，得到PVA-卡拉膠-海藻酸混合溶液，其中PVA、卡拉膠和海藻酸的含量分別為50~100g/L，2~10g/L和2~20g/L;(2)將欲固定化的微生物與上述制備的PVA-卡拉膠-海藻酸混合液混合，調(diào)節(jié)固定化微生物的量為每克固定化細(xì)胞顆粒含有0.10.5g固定化微生物菌體;(3)稱(chēng)取硼酸、KCl和CaCl2，溶解于蒸餾水，使其最終濃度分別為硼酸飽和，KC1為10~50g/L，CaCl2為525g/L，制備得到交聯(lián)劑溶液；(4)用注射器或滴管將步驟(2)制備的混合液滴加到步驟(3)制備的交聯(lián)劑溶液中，使其形成球形顆粒，并在其中浸泡210小時(shí)；(5)將步驟(4)中制備得到的固定化微生物顆粒取出，用生理鹽水洗滌，放入冰箱于4'C下保藏，完成整個(gè)固定化過(guò)程。本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明提出的利用PVA-卡拉膠-海藻酸復(fù)合載體固定化微生物的新方法，該方法制備的固定化微生物顆粒具有良好的生物活性和機(jī)械強(qiáng)度，并且可以根據(jù)實(shí)際需要，對(duì)三種載體的含量進(jìn)行優(yōu)化確定。具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供了一種改進(jìn)PVA固定化微生物的新方法，下面通過(guò)具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例l(1)稱(chēng)取5.0gPVA，0.5g卡拉膠，0.2g海藻酸鈉，與75mL去離子水相混合，水浴加熱至溶化，然后冷卻至常溫；(2)接種假單胞菌(i^W麵o"wsp.，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)進(jìn)行培養(yǎng)，然后稱(chēng)取10g菌體(濕重)，懸浮于20mL濃度為0.9n/。的NaCl溶液中，制備成微生物懸浮液；(3)將第(2)步制得的微生物懸浮液與第(1)步制得的溶液相混合；(4)稱(chēng)取一定量的硼酸、KCl和CaCl2，溶解于去離子水中，使其最終濃度分別為硼酸飽和，KCl為10g/L，CaCl2為10g/L，制備得到交聯(lián)劑溶液；(5)用0.40mmID的注射器將(3)步中的混合液滴加到第(4)步制得的交2mm直徑的球形顆粒，并在其中浸泡2h;(6)取出微生物顆粒，用生理鹽水洗滌。利用該固定化微生物顆粒進(jìn)行苯酚降解試驗(yàn)時(shí)取得了較好的效果，連續(xù)使用50批次，固定化顆粒的微生物活性和機(jī)械強(qiáng)度均保持良好。實(shí)施例2(1)稱(chēng)取10.0gPVA，0.5g卡拉膠，0.2g海藻酸鈉與75mL去離子水相混合，水浴加熱至溶化，冷卻至45'C左右；(2)稱(chēng)取10g活性污泥菌體(濕重，取自北京市高碑店污水處理廠)，懸浮于20mL去離子水中，制備成微生物懸浮液；(3)將第(2)步制得的微生物懸浮液與第(1)步制得的混合溶液相混合；(4)稱(chēng)取硼酸、KCl和CaCl2，溶解于去離子水中，使其最終濃度分別為硼酸飽和，KC1為4.0Q/^，CaCl2為2.0。/。(w/v)，制備得到交聯(lián)劑溶液；(5)用0.40mmID的注射器將(3)步中的混合液滴加到第(4)步制得的交聯(lián)劑溶液中，使其形成直徑約2mm的球形顆粒，并在其中浸泡5h;(6)取出固定化微生物顆粒，生理鹽水洗滌，記為樣品l。分別稱(chēng)取0.5g、l.Og、1.5g和2.0g海藻酸鈉，其他材料比例相同，并采用相同的制備方法和條件，制備得到樣品2、樣品3、樣品4、樣品5。利用這種固定化活性污泥顆粒作為BOD生物傳感器快速測(cè)定儀(專(zhuān)利號(hào)ZL00132125.0)的生物敏感元件。下面以50mg/L的BOD標(biāo)準(zhǔn)溶液為例，給出表150mg/L的BOD標(biāo)準(zhǔn)溶液的測(cè)量值及結(jié)果分析樣品編號(hào)___測(cè)量值(mg/L)—^__相對(duì)誤差(％)152.14.2251.83.6350.40.8447.84.4552,85.6結(jié)果表明，固定化活性污泥顆粒的生物活性良好，滿足了測(cè)定要求，并且該顆粒機(jī)械強(qiáng)度較好，連續(xù)使用3個(gè)月未出現(xiàn)顆粒破碎現(xiàn)象。實(shí)施例3(1)稱(chēng)取5.0gPVA，0.5g海藻酸鈉與75mL去離子水相混合，水浴加熱至溶化，然后冷卻至常溫；(2)接種釀酒酵母(&c/7aram_yc"cweWWae，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)進(jìn)行培養(yǎng)，離心收集菌體；(3)稱(chēng)取10g菌體(濕重)，懸浮于20mL生理鹽水中，制備成微生物懸浮液；(4)將第(3)步制得的微生物懸浮液與第(1)步制得的溶液相混合；(5)稱(chēng)取一定量的硼酸、KCl和CaCl2，溶解于去離子水中，使其最終濃度分別為硼酸飽和，KCl為10g/L，CaCl2為25g/L，制備得到交聯(lián)劑溶液；(6)用滴管將(4)步中的混合液滴加到第(5)步制得的交聯(lián)劑溶液中，使其形成約2mm直徑的球形顆粒，并在其中浸泡10h;(7)取出固定化微生物顆粒，用生理鹽水洗滌，記為樣品l。分別稱(chēng)取0.5g、l.Og、1.5g、2.0g和2.5g卡拉膠，加入到步驟(1)制備的混合溶液中，其他材料比例相同，并采用相同的制備方法和條件，制備得到樣品2、樣品3、樣品4、樣品5和樣品6。測(cè)定上述固定化微生物顆粒的抗壓強(qiáng)度，結(jié)果如表2所示。表2卡拉膠濃度對(duì)固定化微生物顆粒抗壓強(qiáng)度的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>權(quán)利要求1.一種改進(jìn)PVA固定化微生物的新方法，其特征在于，包括以下步驟(1)稱(chēng)取PVA、卡拉膠和海藻酸鈉并與水混合，水浴加熱至完全溶化，然后靜置冷卻至40～50℃，得到PVA-卡拉膠-海藻酸混合溶液，其中PVA、卡拉膠和海藻酸的含量分別為50～100g/L，2～10g/L和2～20g/L；(2)將欲固定化的微生物與上述制備的PVA-卡拉膠-海藻酸混合液混合，調(diào)節(jié)固定化微生物的量為每克固定化細(xì)胞顆粒含有0.1～0.5g固定化微生物菌體；(3)稱(chēng)取硼酸、KCl和CaCl2，溶解于蒸餾水，使其最終濃度分別為硼酸飽和，KCl為10～50g/L，CaCl2為5～25g/L，制備得到交聯(lián)劑溶液；(4)用注射器或滴管將步驟(2)制備的混合液滴加到步驟(3)制備的交聯(lián)劑溶液中，使其形成球形顆粒，并在其中浸泡2～10小時(shí)；(5)將步驟(4)中制備得到的固定化微生物顆粒取出，用生理鹽水洗滌，放入冰箱于4℃下保藏，完成整個(gè)固定化過(guò)程。全文摘要本發(fā)明提出了一種利用PVA-卡拉膠-海藻酸復(fù)合載體固定化微生物的新方法。PVA、卡拉膠和海藻酸的含量分別為50～100g/L，2～10g/L和2～20g/L，固定化顆粒中微生物的含量為每克固定化顆粒含有0.1～0.5g菌體，交聯(lián)劑溶液的成分為硼酸飽和，KCl為10～50g/L，CaCl₂為5.0～25g/L。利用注射器或滴管將固定化載體與微生物菌體的混合液滴加到交聯(lián)劑溶液中，可以形成直徑約2mm的球形顆粒，在其中浸泡2～10h使其充分反應(yīng)，然后將固定化微生物顆粒取出，用生理鹽水洗滌，即得到的固定化微生物顆粒。該方法制備的固定化微生物顆粒具有良好的生物活性、化學(xué)穩(wěn)定性合機(jī)械穩(wěn)定性，可用于廢水處理、生物檢測(cè)及食品發(fā)酵等領(lǐng)域。文檔編號(hào)C12R1/00GK101497880SQ200910079789公開(kāi)日2009年8月5日申請(qǐng)日期2009年3月11日優(yōu)先權(quán)日2009年3月11日發(fā)明者王建龍,俊胡申請(qǐng)人:清華大學(xué)