專利名稱：嗜熱糖化酶表達(dá)盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種嗜熱糖化酶表達(dá)盒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
糖化酶，系統(tǒng)名為a -1， 4-葡聚糖葡萄糖水解酶(a -1， 4-glucan-glucohydrolase (EC. 3. 2. 1.3))，又名葡萄糖淀粉酶(glucoamylase)，是一種外切型糖苷酶，它 能夠從淀粉、糖原或寡聚麥芽糖的非還原性末端釋放a-D-葡萄糖。糖化酶的底物專 一性較低，除了能從非還原性末端依次水解a-l、 4-糖苷鍵，還可以水解a-1、 6-糖 苷鍵，因此能將支鏈淀粉全部水解成葡萄糖。此外，糖化酶還能微弱水解a-1、 3-連 接的碳鏈，它一般都能將淀粉百分百地水解生成葡萄糖。因此糖化酶是淀粉糖化發(fā)酵 生產(chǎn)酒精、葡萄糖漿的主要酶類。
國內(nèi)外葡萄糖生產(chǎn)大多采用酶法，酶法制糖工藝一般采用兩步法。第一步用a-淀粉酶將淀粉水解成低分子量的糊精，稱為液化；第二步用糖化酶將糊精水解成葡萄 糖，稱為糖化。濃度較高的淀粉液糊化時(shí)，必須迅速液化，否則淀粉液粘度上升使設(shè) 備無法運(yùn)行，已糊化的淀粉在溫度降低后會(huì)發(fā)生老化而無法液化，目前制糖工藝廣泛 釆用噴射液化，噴射溫度一般在105 108"，現(xiàn)在使用的a-淀粉酶主要為來源于地 衣芽孢桿菌的耐高溫a-淀粉酶，最適作用溫度9(TC以上，最適pH為5.5 7.0。但 是糖化酶的最適作用溫度、pH等均與淀粉酶不同，因此需要調(diào)整溫度和pH后才能進(jìn) 入糖化過程。
糖化酶在微生物中的分布很廣，屬于糖苷水解15 (GH15)蛋白質(zhì)家族，至今已有 近40個(gè)來源于絲狀真菌、酵母菌、真細(xì)菌和古菌的開放閱讀框被劃分到此家族。目 前我國常用的是黑曲霉的糖化酶，最適pH4.5，最適溫度6(TC，因此液化完成后，需 將液化淀粉冷卻至55 60°C， pH調(diào)至4. 5 5. 0后，加入適量的糖化酶。保持糖化48h 左右，糊精就基本上轉(zhuǎn)化成葡萄糖。有時(shí)為了縮短糖化時(shí)間，在糖化過程中，常常采 用高溫(88-IO(TC)，這就要求有耐高溫的酶系來參與糖化作用。
目前，已從許多微生物中分離出多種類型的耐高溫的糖化酶，有關(guān)糖化酶的熱穩(wěn) 定性報(bào)告很多。Zeikus等發(fā)現(xiàn)Clostridium thermohydro-sulfuricum糖化酶在50% 的淀粉溶液中，7(TC下酶完全穩(wěn)定，而且在10%酒精液中仍很穩(wěn)定，即使在85。C下處 理lh其酶活性仍保持50°/。，而且這種酶不受Cf、 EDTA和a-、 p -、 Y-環(huán)狀糊精的 影響。Tomoko. TA薩ASHI等報(bào)道來自于A. saitoi的糖化酶GLUMI在50°C以上仍保
3持其全部活性，但該酶的活性易受Hg"的抑制。陳冠軍等報(bào)道從黑曲霉As 3. 4809變 異株B-11發(fā)酵液中獲得的3種類型糖化酶GI、 GII、 GIII的最適溫度均為7(TC。 a-環(huán)狀糊精在6(TC下可使糖化酶的熱穩(wěn)定性提高。 一般糖化酶都具有較窄的pH值適應(yīng) 范圍，但最適pH—般為4. 5 6. 5。 Tomoko. TAKAHASHI等報(bào)道來自于A. saitoi的 糖化酶GLUMI其最適pH范圍為2. 5 7. 5，最適pH為4. 5。 Hyun H H等曾報(bào)道A. niger 產(chǎn)生的糖化酶pH值穩(wěn)定范圍為2 11。 Mi Sun Kira等報(bào)道來自于sulfolobus solfataricus的糖化酶基因在大腸桿菌中表達(dá)后重組蛋白的最適溫度為9CTC，最適 pH5. 5 6. 0。 Bjarne Ronfeldt Nielsen等發(fā)現(xiàn)在酵母中表達(dá)的重組Talaromyces eraersonii葡糖淀粉酶的T1/2在70'C下約為110分鐘。
硫磺礦硫化葉菌(sulfolobus solfataricus)屬于泉古菌中的極端嗜熱菌，首 次分離于意大利的一個(gè)硫磺礦熱泉中，形態(tài)為球狀，有葉狀分裂，嗜熱嗜酸，最佳生 長溫度為8(TC，最適pH值為3.0，兼性自養(yǎng)，可以硫磺或其他簡單有機(jī)物為養(yǎng)分。 作為研究古菌的模式菌，sulfolobus solfataricus P2的基因組全序列測(cè)定于2001 年已經(jīng)全部完成，其基因組為2， 992， 245bp，編碼2977個(gè)蛋白。這些蛋白有三分之 -是硫磺礦硫化葉菌所特有，40%是古菌所特有，12%與細(xì)菌有同源性，2%與真菌有同 源性。
絲狀真菌作為轉(zhuǎn)化的宿主菌，有許多其他微生物如細(xì)菌、酵母等不可比擬的優(yōu)點(diǎn) 1)絲狀真菌具有很強(qiáng)的分泌胞外蛋白的能力，而細(xì)菌表達(dá)的重組蛋白往往以無活性 的、難溶的包含體形式存在；2)當(dāng)細(xì)菌表達(dá)外源真核基因時(shí)，因其翻譯和轉(zhuǎn)錄不同 于真核生物，因此即便真核基因轉(zhuǎn)入細(xì)菌，也有可能不表達(dá)，但絲狀真菌不存在類似 的情況；3)絲狀真菌能對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行正確的翻譯后加工，包括肽鏈的剪切和糖基 化等翻譯后加工；4)絲狀真菌具有像細(xì)菌一樣的快速繁殖能力和短的生活周期，比 動(dòng)植物的細(xì)胞培養(yǎng)要簡單；5)許多絲狀真菌，如黑曲霉(Aspergillus niger)、米 曲霉(Aspergillu oryzae)等長期被用在食品工業(yè)，被公認(rèn)是安全的；6)絲狀真菌 具有成熟的發(fā)酵工藝和后處理工藝。由此可以看出，絲狀真菌是一個(gè)具有吸引力的異 源基因表達(dá)系統(tǒng)。尤其是今年來，隨著絲狀真菌轉(zhuǎn)化技術(shù)的迅猛發(fā)展，許多絲狀真菌 被應(yīng)用到工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥行業(yè)中，生產(chǎn)出了許多真菌或非真菌來源的重組蛋白，如 葡糖淀粉酶(glucoamylase)、牛凝乳酶原(bovine chymosin)、人體乳鐵蛋白(human lact2 oferrin)、雞蛋清溶菌酶(hen egg-white lysozyme)禾n人體白細(xì)胞介素6 (human interleukin-6)等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種嗜熱糖化酶表達(dá)盒及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的嗜熱糖化酶表達(dá)盒，依次含有黑曲霉糖化酶基因5'側(cè)翼區(qū)、嗜 熱糖化酶基因、黑曲霉糖化酶基因3'側(cè)翼區(qū)、啟動(dòng)子、篩選標(biāo)記基因、終止子和所 述黑曲霉糖化酶基因3'側(cè)翼區(qū)；所述黑曲霉糖化酶基因5'側(cè)翼區(qū)選自黑曲霉糖化
酶基因5'端至少1500bp的DNA片段；所述黑曲霉糖化酶基因3'側(cè)翼區(qū)選自黑曲 霉糖化酶基因3'端至少1500bp的DNA片段；所述黑曲霉糖化酶基因5'側(cè)翼區(qū)含 有黑曲霉糖化酶基因啟動(dòng)子。
其中，所述黑曲霉糖化酶基因5'側(cè)翼區(qū)的核苷酸序列具體可為序列表中的序列 1。所述黑曲霉糖化酶基因3'側(cè)翼區(qū)的核苷酸序列具體可為序列表中的序列2。所述 嗜熱糖化酶基因的核苷酸序列具體可為序列表中的序列3。所述篩選標(biāo)記基因具體為 乙酰胺酶基因；所述乙酰胺酶基因的核苷酸序列具體為序列表中的序列4。所述啟動(dòng) 子的核苷酸序列為GeneBankZ32524自5'端第138-2186位。所述終止子的核苷酸序 列為GeneBank X02390自5，端第3406-4168位。
含有所述表達(dá)盒的重組表達(dá)載體也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種生產(chǎn)嗜熱糖化酶的方法。
本發(fā)明所提供的生產(chǎn)嗜熱糖化酶的方法，是將所述的表達(dá)盒導(dǎo)入黑曲霉中，獲得 重組菌，發(fā)酵所述重組菌生產(chǎn)嗜熱糖化酶。
本發(fā)明的嗜熱糖化酶表達(dá)載體導(dǎo)入黑曲霉中，可敲除其糖化酶基因代替以硫磺礦 硫化葉菌P2的嗜熱糖化酶基因，利用黑曲霉生產(chǎn)嗜熱糖化酶，每升發(fā)酵液中嗜熱糖 化酶的含量達(dá)到l g/L發(fā)酵液，酶活為3500U/ml發(fā)酵液；生產(chǎn)的嗜熱糖化酶的最適 pH為6.0，最適溫度為8(TC，且酶的穩(wěn)定性高，在工業(yè)生產(chǎn)中使用該嗜熱糖化酶可節(jié) 省成本，節(jié)約能源。本發(fā)明的嗜熱糖化酶表達(dá)載體還含有乙酰胺酶基因，乙酰胺酶能 分解乙酰胺為乙酸及銨，作為細(xì)胞生長的碳源，通過在只含有乙酰胺為唯一碳源供給 的培養(yǎng)基上生長從而篩選出發(fā)生同源重組的克隆，有利于重組菌的篩選。本發(fā)明的嗜 熱糖化酶表達(dá)載體具有廣泛的應(yīng)用前景。


圖l為pWWdir載體的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2為不同pH值下轉(zhuǎn)pWWdir載體的黑曲霉的發(fā)酵液中嗜熱糖化酶的酶活 重組糖化酶GASS的最適pH。
圖3為不同溫度下轉(zhuǎn)pWWdir載體的黑曲霉的發(fā)酵液中嗜熱糖化酶的酶活。 圖4為不同處理后轉(zhuǎn)pWWdir載體的黑曲霉的發(fā)酵液中嗜熱糖化酶酶活。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、嗜熱糖化酶表達(dá)載體 一、構(gòu)建嗜熱糖化酶表達(dá)載體
51) 嗜熱糖化酶基因ssg的獲得
根據(jù)NCBI公布的硫磺礦硫化葉菌P2的ssg基因序列，結(jié)合黑曲霉的密碼子偏愛 性，人工合成嗜熱糖化酶基因ssg-dir，并在ssg-dir兩端加入Notl酶識(shí)別位點(diǎn)， ssg-dir基因的核苷酸序列如序列表中序列3所示。
2) 黑曲霉糖化酶(glaA)基因5'側(cè)翼區(qū)的克隆及帶不同酶切位點(diǎn)的3'側(cè)翼 區(qū)的擴(kuò)增
根據(jù)NCBI上公布的糖化酶基因及其上下游序列設(shè)計(jì)引物 glaA的5'端側(cè)翼序列的引物 G1A5' FR1' F: 5' -CAAGTATATGATGCGGTAGTGG-3'; G1A5' FR1' R: 5' -TGCTGAGGTGTAATGATGCTGG-3'。 glaA的3'端側(cè)翼序列引物(兩對(duì)帶不同酶切位點(diǎn)的引物) 帶Apal及BglII酶切位點(diǎn)的引物序列為 Ssg-G1A3' FR 3F: 5' GGGCCCACAATCAATCCATTTCGCTATA-3'; G1A3， FR-PgpdA 3R: 5' -AGATCTTAACTCCGCGGAGGCTCATGG -3'。 帶HindiII及AatII酶切位點(diǎn)引物序列為 TrpC-G1A3' FR 7F: 5' -AAGCTTACAATCAATCCATTTCGCTA-3'; G1A3， FR 7R: 5' -GACGTCTAACTCCGCGGAGGCTCATGG-3'。
以黑曲霉CICC 2204 (購自工業(yè)微生物菌種保藏管理中心)的基因組DNA作為模 板，分別以G1A5， FR1， F及G1A5' FR1， R序列為引物；Ssg-G1A3， FR3F及G1A3， FR -PgpdA 3R序列為引物；TrpC-GlA3， FR 7F及G1A3， FR 7R序列為引物進(jìn)行PCR擴(kuò) 增得到糖化酶5'側(cè)翼序列，3'側(cè)翼序列。
上述PCR擴(kuò)增條件均為預(yù)變性94。C 5分鐘；再進(jìn)行25個(gè)如下循環(huán)變性94 。C， 30秒、退火56。C， l分鐘、延伸72。C， 2分；最后72。C，延伸10分鐘。
引物G1A5， FR1， F及G1A5， FR1， R擴(kuò)增得到1. 5kb的擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)測(cè)序表明該 產(chǎn)物即為glaA的5'側(cè)翼區(qū)(包含黑曲霉糖化酶基因啟動(dòng)子)，將該片段命名為glaA5 'FR，其核苷酸序列為序列表中的序列l(wèi)。
引物Ssg-G1A3， FR 3F及G1A3， FR - PgpdA 3R擴(kuò)增得到約1. 5kb產(chǎn)物，經(jīng)測(cè)序 表明該擴(kuò)增片段為glaA的3'端側(cè)翼區(qū)，將其命名為3' flankPl片段，其核苷酸序 列為序列表中序列2。將該片段連接到pEASY-Tl載體上后用Apal及BglII雙酶切該 片段，得到1.5kb片段備用。
引物TrpC-G1A3' FR 7F及G1A3， FR 7R擴(kuò)增得到約1. 5kb產(chǎn)物，經(jīng)測(cè)序表明該 擴(kuò)增片段為glaA的3'端側(cè)翼區(qū)，將其命名為3' flankP2片段，其核苷酸序列為序列表中序列1 。將該片段連接到pEASY-Tl載體上后用HindIII及AatII雙酶切該片段， 得到1.5kb片段備用。
3) 黑曲霉amdS基因的克隆
根據(jù)NCBI上公布的米曲霉乙酰胺酶基因序列與黑曲霉基因組DNA比對(duì)選取相似 性最大的序列設(shè)計(jì)引物，引物兩端分別帶有Sca I及Not I酶識(shí)別位點(diǎn)。
PgpdA-amdS 5F: 5' -AGTACTATGGCCCTCACATCCTGGGAAC-3';
amdS-TrpC 5R: 5' -GCGGCCGCTCAAGCACTAGCCTTCTTGAATT-3';
以黑曲霉CICC 2204 (購自工業(yè)微生物菌種保藏管理中心)的基因組DNA作為模 板，以PgpdA-amdS 5F和amdS-TrpC 5R為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
PCR擴(kuò)增條件為預(yù)變性94。C 5分鐘；變性94"C 30秒、退火56°C 1分鐘、延 伸72t: 2分鐘，25個(gè)循環(huán)；72°C延伸10分鐘。
擴(kuò)增得到約1. 9kb的DNA片段，該片段連接到pEasy-Tl (購于全式金公司)載體 獲得質(zhì)粒pET-amdS，進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序表明該擴(kuò)增片段即為乙酰胺酶基因，將其命名為 aradS，其核苷酸序列為序列表中的序列4。將質(zhì)粒PET-amdS用Sea I及Not I雙酶 切后得到1. 9kb的amdS片段備用。
4) PgpdA片段的獲得
根據(jù)構(gòu)巢曲霉3-磷酸甘油醛脫氫酶基因gpdA的啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)引物，以構(gòu)巢曲 霉(購自工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，目錄號(hào)2288)基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增 2049bp的PgpdA片段作為amdS的啟動(dòng)子(GeneBank號(hào)為Z32524，自5，端第138-2186 位)。
引物分別帶BglII及Sca I酶切位點(diǎn)，引物序列如下所示 PgpdA-F: AGATCT AGATCTTTCGACACTGAAATAC; PgpdA-R: AGTACT AGTACTTACTTAGGGGAAATAA。
擴(kuò)增得到約2. 0kb的片段，回收擴(kuò)增得到的PgpdA片段后連接到pEASY-Tl載體 上。用Bgl II及Sca I雙酶切2.0kb片段備用。
5) TtrpC片段的獲得
根據(jù)構(gòu)巢曲霉色氨酸合成基因trpC的終止子設(shè)計(jì)引物以構(gòu)巢曲霉(購自工業(yè)微 生物菌種保藏管理中心，目錄號(hào)2288)基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增763bp的TtrpC片 段(GeneBank號(hào)為X02390的5，端第3406-4168位)，作為amdS的終止子序列。
引物序列如下
amdS-TtrpC 6F: 5' -GCGGCCGC GGATCCACTTAACGTTACTGA-3'; TtrpC-G1A3， FR 6R: 5' -AAGCTT TCGAGTGGAGATGTGGAGTGG-3';回收擴(kuò)增得到的TtrpC片段，用NotI及Hindlll雙酶切該片段備用。
6) 5' FR ssg dir融合片段的獲得
設(shè)計(jì)引物GIA 5， FR 1F、 G1A5， FR-ssg-dirlR、 Ssg-dir2R和 G1A5' FR-ssg-dir2F，引物序列如下，G1A5' FR 1F帶AatII酶識(shí)別位點(diǎn)，Ssg-dir2R 帶Apal酶識(shí)別位點(diǎn)
G1A 5， FR 1F: 5' - GACGTCCAAGTATATGATGCGGTAGTG-3';
G1A5， FR ssg-dir 1R: 5' -TTCCTATGGAGGAAACTCTCATTGCTGAGGTGTAATGATGCTGG -3';
G1A5' FR-ssg-dir2F: 5' -CCAGCATCATTACACCTCAGCAATGAGAGTTTCCTCCATAGGAA-3'; Ssg-dir 2R: 5' -GGGCCCTTAAATATGGTTCAAGAGCTT-3';
以glaA5 'FR片段為模板，以G1A 5' FR 1F和G1A5' FR-ssg-dir 1R為引物進(jìn) 行PCR擴(kuò)增。
擴(kuò)增條件為預(yù)變性94。C 5分鐘；94°C 30秒、56°C 1分鐘、72°C 2分鐘，進(jìn) 行25個(gè)循環(huán)；72°C延伸10分鐘。
PCR擴(kuò)增得到1. 5kb的片段，命名為G1A 5' FR。
以G1A 5' FR及ssg-dir片段為模板，用引物G1A 5' FR 1F及Ssg2-dir R進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。
擴(kuò)增條件為預(yù)變性94'C 5分鐘，變性94'C 30秒、退火56°C 1分鐘、延伸72 °C， 3分鐘，進(jìn)行25個(gè)循環(huán)；72°C延伸10分鐘。
PCR擴(kuò)增得到的3.3kb片段，命名為5' FR-ssgl?；厥諗U(kuò)增得到的5' FR-ssgl 片段后連接到pEASY-Tl載體上后用AatII及Apal雙酶切該片段后備用(AatII為5' 端，Apal為3，端)。
7) 嗜熱糖化酶表達(dá)載體的構(gòu)建
經(jīng)Apal和BglII雙酶切的3' flank Pl、 PgpdA片段(BglII和Seal)、經(jīng)過Sca I及Not I雙酶切的amdS、經(jīng)NotI及Hindlll雙酶切的TtrpC、經(jīng)HindlH和Aatll 酶切的3' flank P2片段連接后得到7792bP片段，命名為 3' FRP卜PgpaA-amdS-TrpC-3， FRP2。
用AatII和Apal雙酶切的5' FR-ssgl片段，與同樣雙酶切的 3， FRPl-PgpaA—amdS—TrpC一3， FRP2連接獲得11. lkb的片段，該片段與經(jīng)過AatII酶 切后回收的pGEM-T Vector(購自promega)載體片段連接后得到嗜熱糖化酶表達(dá)載體， 該載體命名為pWWdir，其結(jié)構(gòu)示意圖如圖l所示。
81)重組黑曲霉表達(dá)載體pWWdir的轉(zhuǎn)化
重組黑曲霉表達(dá)載體p鼎dir經(jīng)AatII完全酶切線性化后，以黑曲霉CICC 2204 (購自工業(yè)微生物菌種保藏管理中心)為出發(fā)菌株制備原生質(zhì)體，進(jìn)行PEG-原生質(zhì)體 轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化方法見文獻(xiàn)(姚婷婷，王正祥.黑曲霉原生質(zhì)體的制備、再生及轉(zhuǎn)化條件. 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2006年25巻04期)，具體步驟如下所示
A、 將黑曲霉CICC2204 (購自工業(yè)微生物菌種保藏管理中心)用査氏固體培養(yǎng)基 培養(yǎng)，挑取包含有培養(yǎng)基的4cm2左右大小的單菌落，和培養(yǎng)基一起放入內(nèi)含60ml査 氏液體培養(yǎng)基的三角瓶中，30°C 200rpm搖床培養(yǎng)4天，收集菌絲體；
B、 用1M山梨醇溶液洗步驟A得到得菌絲體一次，稱取濕重，按照質(zhì)量體積比為 lg: 10ml加酶裂解液，30°C， 80rpm輕微搖床酶解，血球計(jì)數(shù)板檢測(cè)原生質(zhì)體的形成 數(shù)量并確定酶解時(shí)間，得到原生質(zhì)體液；
C、 將原生質(zhì)體液過濾，收集濾液，4。C下3200rpm離心10min，棄上清液，分別 用預(yù)冷的0.6M KC1溶液和S/C溶液洗滌沉淀、離心，原生質(zhì)體沉淀重懸于適量S/C 溶液，使原生質(zhì)體濃度達(dá)到l-3X106個(gè)/ml，置冰浴備用；
D、 取100ul步驟C得到的原生質(zhì)體懸液，加入約5ug的線性化質(zhì)粒(10ul)載 體pWWdir，用槍頭輕輕吹吸混勻，加入50ulPEG溶液，輕輕顛倒混勻，冰浴20分鐘， 得到混合液l;
同時(shí)分別取100ul步驟C得到的原生質(zhì)體，分別加入ddH20 (10ul)，分別用槍 頭輕輕吹吸混勻并加入50ulPEG溶液，輕輕顛倒混勻，冰浴20分鐘，得到混合液2;
E、 取出步驟D的混合液l和2中分別緩緩加入lml PEG溶液，室溫放置5分鐘 后加入2inl S/C溶液，輕輕顛倒混勻，得到混合液3和混合液4，將混合液3和4鋪 在選擇性平板(含有10mM乙酰胺和20mM CsCl的基本培養(yǎng)基)上，混合液4鋪在對(duì) 照培養(yǎng)基上作為原生質(zhì)體對(duì)照；3(TC培養(yǎng)。
上述步驟中使用的培養(yǎng)基和溶液的配方如下所示
査氏固體培養(yǎng)基含1. 6% (質(zhì)量百分含量)的agar,蔗糖3. 0% (質(zhì)量百分含量)， 關(guān)03 0.2% (質(zhì)量百分含量)，K2HP04 0.1% (質(zhì)量百分含量)，7H20,FeS04 0.001% (質(zhì)量百分含量)，7H20*MgS04 0 . 05% (質(zhì)量百分含量)，KC1 0.05% (質(zhì)量百分含 量)，其余為水；pH5.5-6.0的固體培養(yǎng)基
査氏液體培養(yǎng)基含蔗糖3.0% (質(zhì)量百分含量)，NaN03 0 . 2% (質(zhì)量百分含量)， K2HP04 0. 1% (質(zhì)量百分含量)，7H20 *FeS04 0 . 001% (質(zhì)量百分含量)，7H20 *MgS04 0 . 05% (質(zhì)量百分含量)，KCIO.05% (質(zhì)量百分含量)，其余為水，pH5. 5-6. 0的液體培養(yǎng)
9基。
基本培養(yǎng)基含1M蔗糖，lyiP(^ 0.1% (質(zhì)量百分含量)，7H20*MgS04 0.05°/。 (質(zhì)量百分含量)，7H20'FeS0, 0.001% (質(zhì)量百分含量)，KC1 0.05% (質(zhì)量百分含 量)，NaN03 0.2% (質(zhì)量百分含量)，1% (質(zhì)量百分含量)的agar， 200ug/ml潮霉 素B，其余為水的固體培養(yǎng)基。
對(duì)照培養(yǎng)基1M蔗糖，NaN0:, 0.2% (質(zhì)量百分含量)，K2HP04 0.1% (質(zhì)量百分 含量)，7H20'FeSCXO. 001°石(質(zhì)量百分含量)，7H20 MgS04 0. 05% (質(zhì)量百分含量)， KC1 0.05y。(質(zhì)量百分含量)，1%瓊脂。
酶裂解液1% (質(zhì)量百分含量)蝸牛酶、1% (質(zhì)量百分含量)纖維素酶、0. 1% (質(zhì)量百分含量)溶菌酶，用1M的山梨醇溶液配置后，用0. 45utn孔徑的膜過濾滅菌。
S/C溶液含1M山梨醇，50mM CaCL的溶液。
PEG溶液:含25% (質(zhì)量百分含量)PEG8000， 50mM CaCl2， 10mM Tris-HC1， pH7. 5 的溶液。
AmdS基因編碼乙酰胺酶基因，該酶能夠作用于乙酰胺，分解乙酰胺為乙酸及銨， 作為細(xì)胞生長的碳源。該基因在黑曲霉CICC 2204 (購自工業(yè)微生物菌種保藏管理中 心)內(nèi)微弱表達(dá)，同時(shí)內(nèi)源性的乙酰胺酶的微弱表達(dá)可以通過加入20mM CsCl得到抑 制。通過在只含有乙酰胺為唯一碳源供給的培養(yǎng)基上生長從而篩選出發(fā)生同源重組的 陽性克隆，穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體表現(xiàn)為優(yōu)勢(shì)生長且菌落逐漸增大。作為對(duì)照的原生質(zhì)體在對(duì) 照培養(yǎng)基上長大，說明原生質(zhì)體的消化沒有問題，而在選擇性培養(yǎng)基上未長出或長出 較小的菌落但不能繼續(xù)生長。
對(duì)陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行鑒定，根據(jù)glaA的5'端側(cè)翼片段(自GENBANK號(hào)為扁270061. 1 的5'端第95854-94355位核苷酸)，結(jié)合其位置及上游序列，設(shè)計(jì)正向驗(yàn)證引物(該 引物位于GENBANK號(hào)為AM270061. 1的5'端第96180-96161位核苷酸)
Up glaA 5' FR F: 5' - CTATCGTGTTTGTAGCAATG-3';
根據(jù)黑曲霉密碼子偏愛性改造得到的硫磺礦硫化葉菌的糖化酶基因ssg-dir合成 反向驗(yàn)證引物，
In Ssg R: 5' -CTCAACCATATTAGCTTCATC-3'。
提取轉(zhuǎn)化子的基因組DNA，進(jìn)行PCR分子鑒定，用引物UpglaA5' FRF和InSsg R進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，擴(kuò)增得到2067bp片段的菌株為PCR檢測(cè)陽性的菌株，結(jié)果篩選得到 PCR檢測(cè)陽性的正確的轉(zhuǎn)pWWdir菌株。挑取在選擇平板上生長正常的單克隆，命名為 黑曲霉麗dir，將其接至裝有100ml搖瓶培養(yǎng)基(豆餅粉2% (質(zhì)量百分含量)，玉米 漿2% (質(zhì)量百分含量)，玉米淀粉12% (質(zhì)量百分含量)，其余為水)的500ml三角瓶中，同時(shí)取黑曲霉菌株CICC 2204中(購自工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，曰錄號(hào) 為2204)作為對(duì)照，3(TC下?lián)u培4天，取發(fā)酵液上清液分別測(cè)試糖化酶活性，實(shí)驗(yàn)重 復(fù)3次。
嗜熱糖化酶酶活測(cè)定方法如下
嗜熱糖化酶活力單位lral發(fā)酵液在80。C、 p朋.O的條件下，lh水解可溶性淀粉 產(chǎn)生lmg葡萄糖，即為一個(gè)酶活力單位(U)。
試劑和溶液
0. 05mol/L乙酸乙酸鈉緩沖溶液(pH6. 0):稱取乙酸鈉(CH3COONa 3H20) 6. 7g， 吸取冰乙酸0.5-lml，用水溶解并定容至1000ml， pH值用酸度計(jì)調(diào)節(jié)至6. 0。 0. 05mol/L硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液按GB/T601配制與標(biāo)定。 0. lmol/L碘標(biāo)準(zhǔn)溶液按GB/T601配制與標(biāo)定。 0. lmol/L氫氧化鈉溶液按GB/T601配制。
2mol/L硫酸溶液吸取分析純濃硫酸(相對(duì)密度1. 84) 5. 6ml緩緩加入適量水中， 冷卻后，ffi水定容至100ml，搖勻。
200g/L氫氧化鈉溶液稱取氫氧化鈉20g，用水溶解，并定容至100ml。
20g/L可溶性淀粉溶液稱取可溶性淀粉2g，然后用少量水調(diào)勻，緩緩傾入已沸 騰的水中，煮沸、攪拌直至透明，冷卻，用水定容至100ml。
測(cè)定步驟
吸取lml發(fā)酵液上清液，移入容量瓶中，用緩沖液稀釋至10ml刻度，100ml刻度， 1000ml刻度，稀釋稈度根據(jù)酶活的高低而定，濃度越高，稀釋倍數(shù)應(yīng)越大，充分搖勻， 待測(cè)。
注制備待測(cè)酶液時(shí)，樣液濃度應(yīng)控制在滴定空白和樣品時(shí)消耗0.05mol/L硫代 硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的差值在4. 5m:T5. 5ml，范圍內(nèi)(酶活力約為120U/mri50U/ml)。
取A、 B兩支50ml比色管，分別加入20g/L可溶性淀粉溶液25ml和0. 05mol/L 乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(p朋.0) 5ml，搖勻。于(80±0. 2) 。C的恒溫水浴中預(yù)熱5min 10rain。在B管中加入待測(cè)發(fā)酵液2. Oml，立即記時(shí)，搖勻。在此溫度下準(zhǔn)確反應(yīng)30min 后.，立即向A、 B兩管中各加200g/L氫氧化鈉溶液0.2ml，搖勻，同時(shí)將兩管取出， 迅速用水冷卻，并于A管中補(bǔ)加待測(cè)發(fā)酵液2. Oml作為空白對(duì)照。
吸取上述A、B兩管中的反應(yīng)液各5. Oral ，分別于兩個(gè)碘量瓶中，準(zhǔn)確加入0. lmol/L 碘標(biāo)準(zhǔn)溶液10.0ral，再加200g/L氫氧化鈉溶液15ml，邊加邊搖勻，并于暗處放置 15min，取出。用水淋洗瓶蓋，加入2raol/L硫酸溶液2ml，用0. 05mol/L硫代硫酸鈉 標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定藍(lán)紫色溶液，直至剛好無色為其終點(diǎn)，分別記錄空白和樣品消耗0.05mol/L硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積(Va和Vb)。
結(jié)果計(jì)算
酶活力單位按式(1)計(jì)算
X= (VA-VB) XcX90, 。5X32. 2./5Xl/2XnX2=579. 9X (Va-Vb) cXn.........(1)
式(l)中-
X——樣品的酶活力單位，單位為酶活力單位每毫升(U/ml); VA——滴定空白時(shí)，消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積，單位為毫升(mL); VB——滴定樣品時(shí)，消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積，單位為毫升(mL): c——硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的準(zhǔn)確濃度，單位為摩爾每升(raol/L); 以樣品測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值表示。
酶活性結(jié)果表明，黑曲霉C丄CC 2204 (購自工業(yè)微生物菌種保藏管理中心)的嗜 熱糖化酶酶活為0，黑曲霉WWdir的酶活可達(dá)到為3500U/ml。 三、生產(chǎn)嗜熱糖化酶
1、 培養(yǎng)基配制
菌種活化培養(yǎng)基蔗糖3.0% (質(zhì)量百分含量)，K2HP04 0. 1% (質(zhì)量百分含量)， 7H20.FeS04 0.001% (質(zhì)量百分含量)，7H20 MgS04 0.05% (質(zhì)量百分含量)，KC1 0. 05°/。(質(zhì)量百分含量)，lOml乙酰胺和20mMCsCl，其余為水，調(diào)節(jié)pH至5. 5-6. 0， 121。C滅菌30min。
一級(jí)種子培養(yǎng)基豆餅粉3% (質(zhì)量百分含量)，玉米漿2.5% (質(zhì)量百分含量)， 玉米淀粉15% (質(zhì)量百分含量)，高溫淀粉酶12個(gè)單位/克玉米淀粉(諾維信《利可來 耐高溫淀粉酶S叩ra (Liquozyme⑧S叩ra)批號(hào)NBSG4213 ) (8(TC, 30min)，聚 氧乙烯聚氧丙烯季戊四醇醚(Polyoxyethylene Polyoxypropylene Pentaerythritol Ether-PPE) 0.05%，其余為水，12rC滅菌30min。
發(fā)酵培養(yǎng)基玉米淀粉20% (質(zhì)量百分含量)，豆餅粉5% (質(zhì)量百分含量)，玉 米漿3% (質(zhì)量百分含量)，硫銨0.8% (質(zhì)量百分含量)，氯化鈣0.05% (質(zhì)量百分含 量)，高溫淀粉酶12個(gè)單位/克玉米淀粉(諾維信s利可來耐高溫淀粉酶S叩ra (Liq脆yme⑧S叩ra)批號(hào)NBSG4213 ) (80°C， 30min)，聚氧乙烯聚氧丙烯季戊 四醇醚(Polyoxyethylene Polyoxypropylene Pentaerythritol Ether-PPE) 0. 05%， 其余為水，121。C滅菌30rain。
2、 發(fā)酵制備嗜熱糖化酶
黑曲霉WWdir接種到一級(jí)種子培養(yǎng)基中3(TC， 150r/min培養(yǎng)2d，鏡檢無污染。然 后按10% (體積百分比)的接種量接到裝有2.5L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，3(TC， 200轉(zhuǎn)/分(發(fā)酵罐為上海保興生物設(shè)備工程有限公司，型號(hào)BIOTECH-5BG)的攪拌速度 進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，約16小時(shí)后，開始用質(zhì)量百分濃度為25 &的氨水調(diào)節(jié)pH，使發(fā)酵液的 pH控制在4.2-4.5。通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、罐壓和空氣流量，速度使溶氧大于20%，培養(yǎng)120 小時(shí)左右。培養(yǎng)過程中定時(shí)取樣觀察細(xì)胞生長情況以及酶活。
檢測(cè)發(fā)酵120小時(shí)的發(fā)酵液中嗜熱糖化酶的酶活。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
黑曲霉(Aspei^7'W"s w>er) WWdir嗜熱糖化酶發(fā)酵液中酶活可達(dá)3500U/ml。
四、嗜熱糖化酶的酶學(xué)性質(zhì)
1) 最適pH
取步驟2中獲得的黑曲霉"5/ ei^77J^^ger)麗dir發(fā)酵培養(yǎng)140小時(shí)發(fā)酵液 用25ml/100ml的氨水調(diào)節(jié)pH分別為2.0、 3.0、 4.0、 5,0、 6. 0和7. 0，然后測(cè)定發(fā) 酵液中嗜熱糖化酶的酶活，將酶活最高者定為100%。酶活測(cè)定方法同步驟二。
酶活測(cè)定結(jié)果表明黑曲霉"sp6 /^iW^/72^e》麗dir發(fā)酵生產(chǎn)的嗜熱糖化酶的 最適pH為6. 0。圖2所示為黑曲霉(Ape^77力w m'^ r)麗dir的發(fā)酵液在不同pH 值下的嗜熱糖化酶的酶活。目前酒精工業(yè)生產(chǎn)中淀粉液化時(shí)使用的高溫淀粉酶的最適 pH值也為p朋.O，如在糖化時(shí)使用該酶可省去調(diào)pH—步，節(jié)省了成本。
2) 酶反應(yīng)溫度
取l)中發(fā)酵培養(yǎng)140小時(shí)發(fā)酵液，在不同的反應(yīng)溫度下測(cè)定嗜熱糖化酶酶活， 將酶活最高者定為100%。
酶活測(cè)定結(jié)果表明黑曲霉(A^er&Jhs/n'ger) WWdir發(fā)酵生產(chǎn)的嗜熱糖化酶的 最適溫度為80。C， IO(TC時(shí)仍有活性。圖3所示為不同溫度下黑曲霉"矽e^777〃s /^>er) WWdirl的發(fā)酵液中嗜熱糖化酶的酶活。
目前工業(yè)常用的來源于地衣芽孢桿菌的耐高溫淀粉酶的溫度為8(TC-9(TC，如使 用該嗜熱糖化酶用于酒精工業(yè)在糖化工藝時(shí)可以不用降溫，節(jié)省了能源。
3) 酶穩(wěn)定性
取步驟二獲得的發(fā)酵培養(yǎng)140小時(shí)發(fā)酵液，在6CTC、 8CTC和IO(TC下分別保溫0、 10、 20、 30和60分鐘，迅速冷卻到室溫，測(cè)定各個(gè)處理的發(fā)酵液中的酶活，以保溫 O分鐘的發(fā)酵液中的酶活為100%。
酶活測(cè)定結(jié)果表明黑曲霉"砂e2^7^AS72^e力麗dir發(fā)酵生產(chǎn)的嗜熱糖化酶在 80。C時(shí)，酶活力半衰期在60min以上；IO(TC酶活降低較快，保溫lOmin后酶活力仍 高于60%,保溫60min后殘余酶活力為28%。圖4為不同處理后黑曲霉(Asper^7hs w>er)麗dir的發(fā)酵液中嗜熱糖化酶酶活。
13序列表
<110〉 北京中天諾亞體育科技有限公司
〈120〉嗜熱糖化酶表達(dá)盒及其應(yīng)用
<130〉 CGGNARW92039
<160〉 4
<210> 1
<211〉 1500
〈212〉 腿
〈213〉 曲霉屬黑曲霉"5/ er^z7hs /jigerj
<400〉 1
caagtatatgatgcggtagtggaatctgcaggctgttcctcttxtaacgeicaccctagct60
tgtctgcgtgaactageict8caccgacttcctcaatgcggC犯3CtCCgtgccaggcatt120
attctgtggcgttatcatatgtgcctcgsccgg￡icgggacggcgttgtcg180
gcatcaccggacgttttgggca犯gcagggaaatatgctcgggtcccgttcatcgtgggc240
gacca卿ggeitgagggg已ccttattcgccttgtttcagtccaacattacgacgatcgac300
gaggtggtxgactacctggcctcatacttcttctatgacgctagccgagagcagcttgaa360
ccctgtacccacgtacgggtctccgttcaggac鄉(xiāng)cgcg420
gccaacaactggtatccgcaatttaagcgattggccgccattctcggcgacttggtcttc480
a.ccatta.cccggcgggcattcctctcgtattctcccctgatcttccgaac540
tggtcgtacctggcgacctatgactatggcaccccagttctggggaccttccacggaagt600
gacctgctgcaggtgttctatgggatc犯gcagctagttctagccacacg660
tactatctgagctttgtgtatacgctgg3tccgaactccaaccggggggagtacattgag720
tggccgcagtgg卿g^tcgcggcsgttgatgaMttcggagcgaacgacgccagtctc780
cttacggatgatttccgcaacgggacatatgagttcatcctgcaga^taccgcggcgttc840
cacatctgatgccattggcg眺gggtccggacggtc鄉(xiāng)aacttagccttatgagatga900
atgatggacgtgtctggcctCgg咖鄉(xiāng)gltatatggggatcatgatagtactagccata960
ttaMgaagggca,tataccacgcgttgga,cctgcgttatagcttcccgttagttdt￡lgta1020
ccatcgttataccagccaatcaagtcaccacgcacgaccgggg3cggcgaatccccggga1080
attgaaagaaattgcatcccaggcca'gtgaggccagcgattggccacctctccaaggcac1140
agggccattctgcagcgctggtggattcatcgcaatttcccccggcccggcccgacaccg1200ctataggctggttctcccacaccatcggagattcgtcgcctaatgtctcgtccgttcaca1260
agctga卿gcttgaagtggcgagatgtct.ctgcaggaattca^gcta印tgctaagcga1320
tattgcatggc犯tatgtgttgatgcatgtgcttcttccttcagcttcccc'tcgtgcaga1380
tgaggtttggctata^attg卿tggttggtcggggttccgtgaggggctgaagtgcttc144。
ctcccttttagacgcaactgagagcct眺cttcatccccagcatcatta.cacctca,gca1500
〈210〉 2
<211〉 1500
〈212〉 薩
〈213〉曲霉屬黑曲霉"印ei^iW^ ;^>er9
<400〉 2
aca&t caatccatttcgctat8gtta肌ggatggggatgagggcaattggttatatgettc60
atgtatgt3gtgggtgtgcataatagtagtgaaatggaagccaagtcatgtgattgtaat20
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ccaacatcgtgc卿gg卿ttg已tacggaattgtcgctcccatcatgatgttcttgccg■
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ccacacatattcctactggaatgcgacatacatgagcctccgcggagtta1500<image>image see original document page 16</image>gcattgccca ccggcttttt gcccgaacaa gttgatcccg aaacttttga gcccacttcc 1800 gttactcctt tggtgtggtc tcatgctgaa ttcatcattg caattaataa gctcttgaac 1860 catatttaa 1869
<210〉 4
〈211〉 2049
〈212〉 薩
〈213〉 曲霉屬黑曲霉646^ar^7^As/^>erJ
〈400〉 4
atggccctca catcctggga acaaaccgca gcggccaaac gccaatccgt cctcaacgcc 60
atccccgaga肌tggcgcat caagggtcct atccccgcac cgt:cggagca gcgcgacgta 120
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gaaggaaggg agtattttgg ggagttggat aggaagaccg agggggagtg taagttcttx 1740
cctttcttt1: cttctttctt ttcattgagc tatccaattt ggttggagg"t cttgtgtgtt 1800
tgtttgttcg gagagtggtg atggggttat gtgctgactg gatgtttcta tctagacgat 1860
17gcggatgtgt ttgatggggc gccggctggg attcagctct ttggaagacg gcttcaggag 1920 gaga卿ttc tggtactggc tgagtatctt ggtgaggaat tca卿aggc tagtgcttga 1980
權(quán)利要求
1、嗜熱糖化酶表達(dá)盒，自上游至下游依次含有黑曲霉糖化酶基因5′側(cè)翼區(qū)、嗜熱糖化酶基因、黑曲霉糖化酶基因3′側(cè)翼區(qū)、啟動(dòng)子、篩選標(biāo)記基因、終止子和所述黑曲霉糖化酶基因3′側(cè)翼區(qū)；所述黑曲霉糖化酶基因5′側(cè)翼區(qū)選自黑曲霉糖化酶基因5’端至少1500bp的DNA片段；所述黑曲霉糖化酶基因3′側(cè)翼區(qū)選自黑曲霉糖化酶基因3’端至少1500bp的DNA片段；所述黑曲霉糖化酶基因5′側(cè)翼區(qū)含有黑曲霉糖化酶基因啟動(dòng)子。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)盒，其特征在于所述黑曲霉糖化酶基因5'側(cè)翼 區(qū)的核苷酸序列為序列表中的序列1
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的表達(dá)盒，其特征在于所述黑曲霉糖化酶基因3' 側(cè)翼區(qū)的核苷酸序列為序列表中的序列2。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的表達(dá)盒，其特征在于所述嗜熱糖化酶基因的核苷酸 序列為序列表中的序列3。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達(dá)盒，其特征在于所述篩選標(biāo)記基因?yàn)橐阴０访?基因；所述乙酰胺酶基因的核苷酸序列為序列表中的序列4。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的表達(dá)盒，其特征在于所述啟動(dòng)子的核苷酸序列為GeneBank Z32524自5'端第138-2186位。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的表達(dá)盒，其特征在于所述終止子的核苷酸序列為 GeneBank X02390自5，端第3406-4168位。
8、 含有權(quán)利要求1至7中任一所述表達(dá)盒的重組表達(dá)載體。
9、 權(quán)利要求1至7中任一所述表達(dá)盒在生產(chǎn)嗜熱糖化酶中的應(yīng)用。
10、 一種生產(chǎn)嗜熱糖化酶的方法，是將權(quán)利要求1至7中任一所述的表達(dá)盒導(dǎo)入 黑曲霉中，獲得重組菌，發(fā)酵所述重組菌生產(chǎn)嗜熱糖化酶。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種嗜熱糖化酶表達(dá)盒及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的嗜熱糖化酶表達(dá)盒，依次含有黑曲霉糖化酶基因5′側(cè)翼區(qū)、嗜熱糖化酶基因、黑曲霉糖化酶基因3′側(cè)翼區(qū)、啟動(dòng)子、篩選標(biāo)記基因、終止子和所述黑曲霉糖化酶基因3′側(cè)翼區(qū)；所述黑曲霉糖化酶基因5′側(cè)翼區(qū)選自黑曲霉糖化酶基因5’端至少1500的DNA片段；所述黑曲霉糖化酶基因3′側(cè)翼區(qū)選自黑曲霉糖化酶基因3’端至少1500的DNA片段；所述黑曲霉糖化酶基因5′側(cè)翼區(qū)含有黑曲霉糖化酶基因啟動(dòng)子。本發(fā)明的嗜熱糖化酶表達(dá)載體導(dǎo)入黑曲霉中可生產(chǎn)嗜熱糖化酶。
文檔編號(hào)C12R1/685GK101538577SQ20091007764
公開日2009年9月23日 申請(qǐng)日期2009年2月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月10日
發(fā)明者楊建國, 兵 汪, 王小娟 申請(qǐng)人:北京中天諾亞體育科技有限公司