專利名稱：甲胎蛋白及其編碼基因的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及甲胎蛋白及其編碼基因的新用途。
背景技術(shù)：
肝細胞癌是高發(fā)病率的腫瘤，嚴重威脅人類健康。肝癌細胞耐受化學藥物是造 成肝癌細胞復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和難治的主要原因。肝癌細胞耐受化學藥物誘導(dǎo)凋亡的分子 機制至今還不清楚。
RA是維生素A的衍生物，它通過與細胞內(nèi)的受體RAR (ou (3、 y)和RXR (a、 (3、 Y)結(jié)合調(diào)控相關(guān)基因表達而發(fā)揮調(diào)節(jié)細胞分化和誘導(dǎo)細胞凋亡的作用。因RA 能有效的誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡而且毒性小，所以在在臨床上已開始將其應(yīng)用于肺癌、 乳腺癌和肝癌等實體腫瘤的治療，早前該RA已被廣泛應(yīng)用于白血病治療；但肝癌 細胞明顯耐受藥理劑量的RA作用，使用RA治療肝腫瘤效果并不理想。肝細胞癌耐 受RA是限制使用RA治療肝癌的重要因素，因而探索肝癌細胞耐受RA的分子機制 是合理使用RA治療肝腫瘤的理論基礎(chǔ)。
甲胎蛋白(AFP)是肝癌細胞發(fā)生發(fā)展過程高表達的特異性很高的蛋白質(zhì)。有 關(guān)研究表明AFP能通過受體介導(dǎo)促進癌基因(如c-ras等基因)的表達，導(dǎo)致肝癌 細胞增殖；AFP也能通過抑制肝癌細胞表達TRAIL受體，減少腫瘤細胞與淋巴細胞 分泌的TRAIL結(jié)合，從而導(dǎo)致肝癌細胞逃避淋巴細胞的免疫監(jiān)視；AFP能與細胞內(nèi) 的蛋白質(zhì)結(jié)合，通過影響細胞內(nèi)的信息傳遞和熱休克蛋白的功能調(diào)節(jié)細胞的生長。 AFP結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其3個結(jié)構(gòu)域與相應(yīng)的配體蛋白結(jié)合會產(chǎn)生不同的生物學效應(yīng)。已 經(jīng)有人推測AFP具有能與胞內(nèi)類固醇/甲狀腺素類家族受體結(jié)合的結(jié)構(gòu)域基礎(chǔ)，但 是AFP是否能和這些蛋白質(zhì)結(jié)合還沒有得到研究驗證，而且AFP對胞內(nèi)受體的生物 學功能有沒有影響，也是需要探索的科學問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供甲胎蛋白及其編碼基因的新用途。 本發(fā)明所提供的甲胎蛋白及其編碼基因的一種新用途是甲胎蛋白及其編碼基 因在設(shè)計和/或篩選藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明所提供的甲胎蛋白及其編碼基因的另一種新用途是以甲胎蛋白及其編
3碼基因為靶點的物質(zhì)在制備藥物中的應(yīng)用。
其中，所述藥物可為用于預(yù)防和/或治療肝癌的藥物。
所述以甲胎蛋白及其編碼基因為靶點的物質(zhì)可具體為蛋白質(zhì)或者核酸。本發(fā)明的另一個目的是提供一種以甲胎蛋白及其編碼基因為耙點的用于預(yù)防和/或治療肝癌的藥物。
所述藥物的活性成分可具體為核酸。
上述核酸可為抑制所述甲胎蛋白編碼基因表達的小干擾RNA、表達所述小干擾
RNA的載體、表達抑制所述甲胎蛋白編碼基因表達的shRNA的載體、與所述甲胎蛋
白編碼基因發(fā)生同源重組且抑制所述甲胎蛋白編碼基因表達的同源序列或含有所
述同源序列的載體。
所述shRNA由莖I 、環(huán)和莖II構(gòu)成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)；所述莖I的序列具體可為GAACGUGG UCAA UGUA UAAU，所述莖II的序列具體可為AUUAU ACAU UGAC CACG UUC,環(huán)結(jié)構(gòu)是UCAAGAG。
本發(fā)明的藥物能夠通過抑制肝癌細胞內(nèi)AFP蛋白的表達，從而減少AFP與RA的受體RAR-e的結(jié)合，使更多的RAR-e進入細胞核中，與survivin的啟動子結(jié)合從而抑制survivin的表達，進而抑制肝癌細胞的增殖。試驗證明，對于沒有用本發(fā)明藥物處理過的肝癌細胞，要用80mM或更高剤量的ATRA才能抑制肝癌細胞的增殖，而用本發(fā)明藥物處理過的肝癌細胞，只要用40]LiM的ATRA就能抑制肝癌細胞的增殖，因此，本發(fā)明的藥物降低了肝癌細胞對RA的耐受性，在治療肝癌領(lǐng)域有重要的應(yīng)用價值。


圖l為AFP或ATRA對Bel 7402生長的調(diào)節(jié)作用。
圖2為AFP對ATRA誘導(dǎo)Bel 7402凋亡的拮抗作用。
圖3為AFP與RAR- e在胞漿里的相互結(jié)合檢測。
圖4為熒光能量共振轉(zhuǎn)移技術(shù)(FRET)分析AFP與RAR-p的相互作用。
圖5為出發(fā)載體的圖譜及轉(zhuǎn)染效率。
圖6為siRNA干擾載體對Bel 7402細胞中AFP和survivin表達的影響。圖7為siRNA干擾載體對Bel 7402細胞凋亡的影響。
圖8為siRNA干擾AFP表達后，對RAR-0對Bel 7402細胞survivin基因啟動子相互作用的影響。圖9為編碼shRNA的DNA的設(shè)計。
具體實施例方式
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。人肝癌Bel 7402細胞購自上海天呈科技有限公司，產(chǎn)品目錄號為Bel 7402;
H印G2購自中國科學院上海細胞庫，產(chǎn)品目錄號為H印G2人肝癌細胞；HLE細胞
購自中國科學院上海細胞庫，產(chǎn)品目錄號為HLE人肝癌細胞；
AFP純品(從肝癌細胞中提取)購自Biodesign公司，產(chǎn)品編號為A32260H;
小鼠抗人AFP的單克隆抗體從P印roTech EC. LTD (USA)購買，產(chǎn)品編號為T-2;
小鼠抗人RAR-p的單克隆抗體購自Santa Cruz (USA)，產(chǎn)品目錄號為sc-14028;兔
抗人AFP的多克隆抗體購自Santa Cruz (USA) ; RPMI-1640培養(yǎng)基購自GIBCO公
司；全反式維甲酸(All frs/AS retinoic acid, ATRA)購自Sigma (USA)，產(chǎn)品
目錄號為..98F-0178。
ATRA能夠誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡(Nakanishi M， Tomaru Y， Miura H， Hayashizaki
Y， Suzuki M. Identification of transcriptional regulatory cascades in
retinoic acid-induced growth arrest of H印G2 cells. Nucleic Acids Res. , 2008;
36(10) : 3443 - 3454.)。
實施例1、甲胎蛋白(AFP)與肝癌細胞耐受藥物的關(guān)系
下述各實驗中，在進行前，均先將人肝癌Bel 7402細胞進行適應(yīng)性培養(yǎng)48h。
適應(yīng)性培養(yǎng)方法將人肝癌Bel 7402細胞接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640
培養(yǎng)基中，置于37。C、 5% C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔24h更換新的培養(yǎng)基。一、MTT法檢測AFP、 ATRA對肝癌細胞生長的影響
細胞適應(yīng)性培養(yǎng)48h后，用0. 25%胰蛋白酶消化，用含有10%胎牛血清的RPMI-1640把細胞調(diào)整到2xl(^個/ml;將細胞接種于96空培養(yǎng)板中(120pL/孔)，每組設(shè)8個平行孔，待培養(yǎng)24h后，去掉培養(yǎng)液，加入無血清RPMI-1640 U20pL/孔)，培養(yǎng)24h后，再去掉培養(yǎng)液，然后向各實驗組及對照組分別加入藥物，處理24h(處理條件和細胞常規(guī)培養(yǎng)條件一致，均為置于37。C、 5%0)2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng))；再向各孔加入2(^L MTT (5mg/L)，置于37°C、 5% C02的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h,去掉培養(yǎng)液，用PBS液洗細胞2次，向各孔加入DMSO (120pL/孔)，微振蕩30rain,在570nm波長下測光密度(0D57。)，計算細胞的增殖率，增殖率-[l-(樣本組0D，-
5對照組0Ds7。) ]/對照組0057。><100%。實驗設(shè)如下各組
(1) AFP和mAb對肝癌細胞生長的影響(圖1A)空白對照組除加入正常培養(yǎng)液外，沒有加入任何物質(zhì)；
5-160 mg/L組向孔中加入AFP和mAb， AFP和mAb在孔中的終濃度各自依次為5、 10、 20、 40、 80、 160 mg/L。
圖1A中，l表示空白對照組，2表示5 mg/L組，3表示10 mg/L組，4表示20 mg/L組，5表示40 mg/L組，6表示80 mg/L組，7表示160 mg/L組。圖1中各縱坐標是以空白對照組計作100%。
(2) ATRA對肝癌細胞生長的影響(圖1B)
Control (空白對照組)除加入正常培養(yǎng)液外，沒有加入任何物質(zhì)；
10-160 ii M組向孔中加入ATRA和相應(yīng)DMSO， ATRA在孔中的終濃度為10、 20、
40、 80、 160 u M (用DMSO溶解ATRA，實際DMSO在孔中的終濃度為0. 5-1. 6% (體
積百分含量))。
圖1B中，l表示空白對照組，2表示10uM組，3表示20uM組，4表示40 u M組，5表示80uM組，6表示160uM組。
(3) AFP和ATRA抑制肝癌細胞生長的影響(圖1C)
對照組l (control):除加入正常培養(yǎng)液外，沒有加入任何物質(zhì)；
ATRA組向孔中加入ATRA，ATRA在孔中的終濃度為160yM(用DMSO溶解ATRA，
實際DMSO在孔中的終濃度為1.6% (體積百分含量))；
DMSO組向孔中加入DMSO，實際DMSO在孔中的終濃度為1. 6%(體積百分含量)；ATRA+AFP組向孔中加入ATRA和AFP， ATRA和AFP在孔中的終濃度分別為160
ix M禾口 20mg/L;
DMSO+AFP組向孔中加入DMSO和AFP， DMSO在孔中的終濃度為1. 6% (體積百分含量)，AFP在孔中的終濃度為20mg/L;
抗AFP單克隆抗體(mAb)組向孔中加入raAb, mAb在孔中的終濃度為40mg/L;
ATRA+AFP+mAb組:向孔中分別加入ATRA、 AFP和mAb， ATRA、 AFP和mAb在孔中的終濃度分別為160uM、 20mg/L和40mg/L。
實驗設(shè)3次重復(fù)。
圖1C中，1表示空白對照組，2表示ATRA組，3表示DMSO組，4表示ATRA+AFP組，5表示DMS0+AFP組，6表示抗AFP單克隆抗體(mAb)組，7表示ATRA+AFP+mAb組。
結(jié)果表明，用ATRA (10-160uM)處理人肝癌Bel 7402細胞24小時后，MTT檢測結(jié)果顯示，ATRA大于80"M時，對肝癌細胞的增殖才有明顯的抑制作用(圖1B);而AFP在濃度大于10mg/L時對Bel 7402細胞的生長則有促進作用(圖1A);這些藥物對Bel 7402細胞生長的影響有劑量和時間的依賴性；AFP和ATRA共同處理肝癌細胞，則觀察到AFP具有對抗ATRA的誘導(dǎo)凋亡作用(圖1C)。
二、流式細胞儀分析細胞周期和細胞凋亡狀況
人肝癌細胞Bel 7402適應(yīng)性培養(yǎng)48h后，用0. 25%胰蛋白酶消化，再用含有10%胎牛血清的RPMI-1640把細胞調(diào)整到2. 5"04個/1111;將細胞接入24孔板(2ml/孔)，培養(yǎng)24h后，去掉培養(yǎng)液，用無血清的RPMI-1640繼續(xù)培養(yǎng)24h (此為細胞饑餓周期同步化)后，換成含有10%血清和相應(yīng)濃度藥物的RPMI-1640處理細胞24h，每個組別設(shè)3個平行孔。處理結(jié)束后，吸出細胞培養(yǎng)液于FACS管，離心(1000g， 5min)收集懸浮的細胞，并用0.025%胰蛋白酶消化貼壁的細胞，去掉0.25%胰蛋白酶，用lmlPBS把細胞吹散，吸到FACS管里，離心(1000g, 5min)收集細胞，和懸浮的細胞一起，用l ml PBS重懸細胞，再加入-20。C預(yù)冷的3 ml無水乙醇(無水乙醇的終濃度為75%)，置于-20。C冰箱過夜(或12h)。上機測樣前，離心細胞(lOOOg，5min)，用1 ml PBS離心清洗細胞(lOOOg， 5min)三次，用lml PBS重懸細胞，在lml PBS的細胞懸液中加入20mg/L的RNA酶lO(il， 37°C保溫30min，再加入碘化丙錠(PI) 200nl (終濃度liag/ml)。用FACS Scan-420 Flow Cytometry檢測細胞周期和細胞凋亡情況。
實驗組、對照組及對應(yīng)加入的藥物如下
ATRA (用DMSO溶解)、AFP和mAb (用RPMI-1640溶解)，待溶解后，加入各孔中；
實驗組l:向孔中加入ATRA， ATRA在孔中的終濃度為160
實驗組2:向孔中加入ATRA和AFP， ATRA在孔中的終濃度為160 u M， AFP在孔中的終濃度為20mg/L;
實驗組3:向孔中加入mAb， mAb在孔中的終濃度為40mg/L;
實驗組4:向孔中加入ATRA、 AFP、 mAb， ATRA在孔中的終濃度為160 w M， AFP在孔中的終濃度為20rag/L， mAb在孔中的終濃度為40mg/L。對照組l (control):空白對照組，該組除加入正常培養(yǎng)液外，沒有加入任何 物質(zhì)；
對照組2:向孔中加入DMSO， DMSO在孔中的終濃度為1.6% (體積百分含量)。 實驗設(shè)3次重復(fù)。
流式細胞儀檢測結(jié)果如圖2A所示(每個圖片上的數(shù)據(jù)代表在藥物處理后細胞 凋亡的百分比)。圖2A中，l表示對照組l， 2表示實驗組1， 3表示對照組2， 4 表示實驗組2， 5表示實驗組3， 6表示實驗組4。
流式細胞儀試驗的統(tǒng)計學分析(t檢驗)結(jié)果如圖2B所示。 結(jié)果表明，ATRA阻止肝癌細胞周期進入M/G2期，從而抑制細胞生長，增加細 胞的凋亡率，從5. 7%-56. 5% (對照組1中的凋亡率為5. 7%，實驗組1為56. 4%，實 驗組2為8. 6%，實驗組3為4. 5%，實驗組4為47. 5%，對照組2為21. 7%)，這些 凋亡率在使用AFP處理時能明顯被消除(平均為8. 6%)，而抗AFP的單克隆抗體能顯 著性拮抗AFP的作用，說明AFP對ATRA誘導(dǎo)Bel 7402凋亡具有拮抗作用。 三、顯微鏡照相和DAPI染色觀察細胞形態(tài)的變化和凋亡小體的形成 人肝癌細胞Bel 7402適應(yīng)性培養(yǎng)48h后，用0. 25%胰蛋白酶消化，用含有10% 胎牛血清的RPMI-1640把細胞調(diào)整到2. 0xl()4個/ml;取5 ml細胞液培養(yǎng)于33cm2 的培養(yǎng)瓶，待細胞長到80%融合，0.25%胰蛋白酶消化，用含有10%胎牛血清的 RPMI-1640把細胞調(diào)整到2xlO'個/ml，將細胞接于24孔培養(yǎng)板中(2ml/孔)，每 組設(shè)4個平行孔，細胞培養(yǎng)24h后，去掉培養(yǎng)液，用無血清的RPMI-1640繼續(xù)培養(yǎng) 24h(此為細胞饑餓周期同步化)后，換成含有10%血清和相應(yīng)濃度藥物的RPMI-1640 處理細胞24h，用數(shù)碼相機拍攝細胞形態(tài)的改變；然后收集懸浮細胞到離心管，再 用0.25%胰蛋白酶消化貼壁細胞，用1.5ml PBS把細胞輕輕吹下，收集到裝有懸浮 細胞到離心管中，離心(1000g， 5min)，去掉PBS，用lml PBS把細胞輕輕吹散， 加入10(^1濃度為100(ig/ml DAPI，避光37。C保溫30min，離心(1000g， 5min)， 去掉上清也，加入lml PBS把細胞輕輕吹散，離心(1000g， 5min)清洗細胞三次， 去掉上清液，加入lOO)alPBS把細胞吹散，吸出20]ul細胞懸液加到干凈的載玻片上， 再輕輕壓上蓋玻片，靜置5min后，再用熒光顯微鏡觀察細胞凋亡小體，并顯微拍 攝圖像。
實驗組、對照組及對應(yīng)加入的藥物如下
ATRA (用DMSO溶解)、AFP、 raAb (用RPMI-1640溶解)，待溶解后，加入各
8孔中；
實驗組l:向孔中加入ATRA， ATRA在孔中的終濃度為160uM;
實驗組2:向孔中加入ATRA和AFP， ATRA在孔中的終濃度為160 ii M， AFP在孔 中的終濃度為20mg/L;
實驗組3:向孔中加入mAb， mAb在孔中的終濃度為40mg/L;
實驗組4:向孔中加入ATRA、 AFP、 mAb， ATRA在孔中的終濃度為160 y M， AFP 在孔中的終濃度為20mg/L， mAb在孔中的終濃度為40mg/L。
對照組l:空白對照組，該組除加入正常培養(yǎng)液外，沒有加入任何物質(zhì)；
對照組2:向孔中加入DMSO， MSO在孔中的終濃度為1.6% (體積百分含量)。
結(jié)果如圖2C所示。結(jié)果表明，大劑量的ATRA (160(imol/L)處理24小時后能 誘導(dǎo)肝癌Bel 7402細胞凋亡小體的形成和核萎縮；AFP能消除ATRA的這種作用。
圖2C中，l表示對照組l， 2表示實驗組1， 3表示對照組2， 4表示實驗組2， 5表示實驗組3， 6表示實驗組4。
四、細胞蛋白質(zhì)的提取和Western Blotting
人肝癌細胞Bel 7402適應(yīng)性培養(yǎng)48h后，用0. 25%胰蛋白酶消化，用含有10% 胎牛血清的RPMI-1640把細胞調(diào)整到2. 0xl04個/ml;取5 ml細胞液培養(yǎng)于33cm2 的培養(yǎng)瓶，每組設(shè)4個平行瓶，細胞培養(yǎng)24h后，去掉培養(yǎng)液，用無血清的RPMI-1640 繼續(xù)培養(yǎng)24h (此為細胞饑餓周期同步化)后，換成含有10%血清和相應(yīng)藥物濃度 的RPMI-1640處理細胞24h，按文獻(Tahk S. et al. Control of specificity and magnitude of NF- B and STAT1-mediated gene activation through PIASy and PIAS1 cooperation, PNAS， 2007; 104: 11643 - 11648.)中所述方法提取細胞蛋 白質(zhì)，做蛋白質(zhì)雜交分析相關(guān)的抗原，用FUJI 2000化學發(fā)光/熒光儀拍攝雜交蛋 白質(zhì)條帶。探針分別為辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠二抗(一抗分別為人MR-(3 抗體、小鼠抗人AFP抗體、小鼠抗人(3-actin抗體)；顯色劑為BCIP/NBT顯色試劑
實驗組、對照組及對應(yīng)加入的藥物如下
對照組l:空白對照組，該組除加入正常培養(yǎng)液外，沒有加入任何物質(zhì)； 對照組2:向瓶中加入DMS0， DMS0在瓶中的終濃度為0.4X (體積百分含量)。 對照組3:向瓶中加入DMS0， DMS0在瓶中的終濃度為1.6% (體積百分含量)。 實驗組l:向瓶中加入ATRA， ATRA在瓶中的終濃度為40uM。實驗組2:向瓶中加入ATRA， ATRA在瓶中的終濃度為160uM。 以H印G2和HLE細胞的AFP表達作為參照。 實驗設(shè)3次重復(fù)。
結(jié)果表明，ATRA的兩種濃度(40或160 p M)均能誘導(dǎo)RAR-P表達，同時也能 檢測到胞漿中AFP的表達，但是用ATRA(160uM)處理后，AFP的表達量明顯下降，表 明160 y M的ATRA能夠抑制AFP的表達(圖3A)。
H印G2和HLE細胞的AFP表達結(jié)果如圖3B所示，表明H印G2能表達AFP，而 HLE細胞則不表達AFP。
圖3A中，泳道l表示對照組l，泳道2表示對照組2，泳道3表示對照組3， 泳道4表示實驗組1 ，泳道5表示實驗組2; a表示RAR- 0 ， b表示AFP， c表示 P -actin。
圖3B中，泳道1表示人肝癌細胞Bel 7402，泳道2表示HLE細胞，泳道3表 示H印G2細胞；a表示AFP， b表示P-actin。
五、激光共聚焦顯微鏡技術(shù)研究蛋白質(zhì)的細胞內(nèi)定位
20x20mm的蓋玻片經(jīng)過潔凈處理，高溫、高壓消毒后放到6孔培養(yǎng)板中，然后 加入用含有10%胎牛血清的RPMI-1640把細胞調(diào)整到2xl(T個/ml的細胞懸液2ml， 待細胞長到70%融合，用藥物處理細胞12h后，用4y。多聚甲醛固定細胞30min，再 用O. 3%的曲拉酮-X 100浸泡細胞30min，去掉全部液體，用1 ml PBS清洗細胞3 次，去掉全部液體，用5%的胎牛血清封閉細胞lh，去掉封閉液，加入小鼠抗人-RAR卩 的單克隆抗體(抗體濃度為1: 200)和兔抗人AFP的多克隆抗體(Santa Crutz， USA)(抗體濃度為l: 200) ， 4。C輕搖12h，去掉一抗液體，用lmlPBS清洗細胞 3次，加入FITC標記的羊抗小鼠二抗和TRITIC標記的羊抗兔的二抗，室溫輕搖2h (避光)，再加入10nl濃度為10(Vg/mlDAPI，室溫輕搖30min (避光)，去掉全 部液體，用lmlPBS清洗細胞3次，用激光共聚焦顯微鏡觀察標記結(jié)果并拍攝圖像。 實驗組、對照組及對應(yīng)加入的藥物如下
對照組l:是空白對照組，該組除加入正常培養(yǎng)液外，沒有加入任何物質(zhì)； 實驗組2:向瓶中加入ATRA， ATRA在孔中的終濃度為160ixM。 結(jié)果如圖3E(a為用DAPI染Bel 7402細胞核；b為FITC連接的二抗檢測RAR- e 抗體在細胞的分布；c為TRITC連接的二抗檢測AFP抗體在細胞的分布；d圖所顯 示的是a， b， c三圖的重合)和圖3F所示(a為用DAPI染Bel 7402細胞核；b為FITC連接的二抗檢測RAR- 3抗體在細胞的分布，RAR- 0被ATRA激活后進入細胞內(nèi)的綠 色熒光已經(jīng)用箭頭提示；c為TRITC連接的二抗檢測AFP抗體在細胞的分布；d圖 所顯示的是a，b，c三圖的重合)。圖3E為對照組(空白對照，沒有用任何物質(zhì)處 理)的結(jié)果，圖3F為實驗組2的結(jié)果，是用ATRA(160 uM)處理后，AFP和RAR-{3 在Bel 7402細胞里的定位。
表明，未經(jīng)ATRA處理時，AFP能與RAR-卩相互作用，并在細胞漿有共定位現(xiàn)象； 當用ATRA (160fimol/L)分別處理細胞24小時后，有部分RAR-(5移入細胞核，而AFP 仍然停留在細胞漿中。
六、免疫共沉淀技術(shù)分析蛋白質(zhì)相互作用
人肝癌細胞Bel 7402適應(yīng)性培養(yǎng)48h后，用0. 25%胰蛋白酶消化，用含有10% 胎牛血清的RPMI-1640把細胞調(diào)整到2. 0xl(T個/ml;取5 ml細胞液培養(yǎng)于33cm2 的培養(yǎng)瓶，每組設(shè)2個平行瓶，細胞培養(yǎng)24h后，去掉培養(yǎng)液，換成含有10%血清 和相應(yīng)藥物濃度的RPMI-1640處理細胞24h,按文獻(Tahk S. et al. Control of specificity and magnitude of NF- B and STATl-mediated gene activation through PIASy and PIAS1 cooperation, PNAS， 2007; 104: 11643 - 11648.)中 所述方法提取細胞蛋白質(zhì)，每個培養(yǎng)瓶中的細胞得到的蛋白質(zhì)分4份，其中一份做 INPUT,剩下的3份分別用抗AFP的單克隆抗體(mAb) 、 RAR-(3的單克隆抗體和兔 免疫血清(IgG)沉淀相應(yīng)的抗原，然后protein A _ agarose把抗原抗體復(fù)合物 吸附于agarose珠子上，并離心清洗其它蛋白質(zhì)，用上樣緩沖液和高溫的方法使 agarose珠子與蛋白質(zhì)復(fù)合物分離，經(jīng)過SDS-PAGE電泳分離把抗原和抗體分離，再 用做Western Blotting雜交分析相關(guān)的抗原，用FUJI 2000化學發(fā)光/熒光儀拍攝 雜交蛋白質(zhì)條帶。用input來證明總的AFP和RAR- e的表達狀況，免疫復(fù)合物的 沉淀和分離用A-S印harose珠子，非免疫復(fù)合物用非免疫抗兔IgG沉淀作為陰性對 昭。
用上述相同的方法研究細胞H印G2和HLE。
試驗設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果如圖3C (細胞Bel 7402)和圖3D (細胞H印G2和HLE) 所示。表明RAR-0能與AFP相互作用，這樣的結(jié)果在H印G2細胞有同樣的體現(xiàn)， 然而用HLE做研究，并不能檢測到有AFP蛋白表達，顯示研究結(jié)果的AFP作用特異性.
圖3C中，I組為未經(jīng)ATRA處理的，II組為經(jīng)ATRA處理的，I組中泳道1表 示用AFP單克隆抗體沉淀并檢測AFP和RAR- 0 ，泳道2表示檢測細胞提取物AFP和RAR- P ，泳道3表示用RAR- P單克隆抗體沉淀并檢測AFP和RAR- P ，泳道4表 示用非免疫羊球蛋白IgG沉淀并檢測AFP和RAR- 0 ; II組中泳道1表示檢測細胞提 取物AFP和RAR- P ，泳道2表示用AFP單克隆抗體沉淀并檢測AFP和RAR- P ，泳 道3表示用RAR- 0單克隆抗體沉淀并檢測AFP和RAR- P ，泳道4表示用非免疫羊 球蛋白IgG沉淀并檢測AFP和RAR- 3 。 a表示AFP， b表示RAR- e 。
圖3D中，I組為未經(jīng)ATRA處理的，II組為經(jīng)ATRA處理的，I組中泳道1表 示檢測細胞提取物RAR- P ，泳道2表示用AFP單克隆抗體沉淀并檢測RAR- P ，泳 道3表示非免疫羊球蛋白IgG沉淀并檢測RAR-e ; II組中泳道l表示檢測細胞提取 物RAR-P，泳道2表示用AFP單克隆抗體沉淀并檢測RAR-e，泳道3表示非免疫 羊球蛋白IgG沉淀并檢測RAR- e 。 a表示H印G2細胞，b表示HLE細胞。
綜合試驗C、 D、 F的試驗表明，AFP與RAR-P在胞漿里具有相互結(jié)合特性。
七、熒光能量共振轉(zhuǎn)移技術(shù)研究AFP與RAR-P相互作用。
試驗方法20x20mm的蓋玻片經(jīng)過潔凈處理，高溫、高壓消毒后放置到6孔培 養(yǎng)板中，然后加入用含有10%胎牛血清的RPMI-1640把細胞調(diào)整到2xlCT"個/ml的細 胞懸液2ml，待細胞長到70%融合，用4。/。多聚甲醛固定細胞30min，再用0.3°/。的曲 拉酮(Triton) -X 100浸泡細胞30min，去掉全部液體，用lml PBS清洗細胞3次， 去掉全部液體，用5%的胎牛血清封閉細胞lh，去掉封閉液，加入小鼠抗人RAR-e 的單克隆抗體(抗體濃度為1: 100)和兔抗人AFP的多克隆抗體(Santa Cruz， USA) (抗體濃度為l: 100) ， 4。C輕搖12h，去掉一抗液體，用lmlPBS清洗細胞3次， 加入FITC標記的羊抗小鼠二抗和TRITC標記的羊抗兔的二抗，室溫輕搖2h(避光)， 再加入10pl濃度為100|ig/mlDAPI，室溫輕搖30rain (避光)，去掉全部液體，用 lml PBS清洗細胞3次，用90%甘油(PBS配制)10|al封片，用Olympus Fluoview FV1000 (Japan)型激光共聚焦顯微鏡觀察FITC (綠色熒光，波長488nm)和TRITC (紅色熒光，波長543nm)熒光共振能量轉(zhuǎn)移情況。具體步驟是先常規(guī)采FITC和 TRITC熒光圖象，并合成，觀察細胞某些區(qū)域兩種熒光有共定位的可能，選擇要掃 描有共定位的可能區(qū)域，確定掃描前后的激光條件(條件前后一致)后，關(guān)閉激發(fā) FITC的激光(波長488nm)，把激發(fā)TRITC的激光(波長543nm)開到最大(100%)， 也就是要漂白紅色熒光，選擇要漂白的時間(300-500numb)，掃描采圖，漂白完 畢后，回到剛開始采圖的條件，打開激發(fā)FITC的激光(波長488nm)，把激發(fā)TRITC 的激光(波長543nm)調(diào)整到漂白前的百分比，去掉選擇的區(qū)域，掃描并拍攝圖像，
12并用Olympus Fluoview FVIOOO軟件合成圖象和計算熒光共振能量轉(zhuǎn)移的兩個分子 的距離值(R)即光譜尺(spectroscopic ruler)，計算公式R=R。x [ (1/E)-1]' e。 其中R。是Foster Distance,當Donor是FITC, Ace印tor是TRITC時，R。的值是 0. 5nm, E是能量轉(zhuǎn)移效率=1—(Prebleaching/Postbleaching)。
試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在所選擇的區(qū)域內(nèi)供體分子漂白后的熒光強度明顯高于漂白前 (圖4A);圖4B所顯示的是熒光能量圖和相對熒光強度，漂白以后的圖片能觀察到更 為明亮的熒光強度；用分析軟件熒光能量轉(zhuǎn)移效率.綠色展現(xiàn)的是相對高的轉(zhuǎn)移效 率；圖4D圖片所展示的是兩個熒光分子之間的距離，這些距離計算的結(jié)果是(供體 和受體之間的分子距離)5. 8±1. 7A.說明兩種熒光分子發(fā)生相互作用。
實施例2、以甲胎蛋白AFP為耙點的shRNA在抑制肝癌細胞增殖中的應(yīng)用。 本實施例是通過RNA干擾技術(shù)封阻AFP表達，進而抑制肝癌細胞增殖。 本實施例中所用的肝癌細胞除特殊說明外，均分別為Bel 7402、 HepG2細胞、 HLE細胞。
一、siRNA干擾載體的構(gòu)建
siRNA干擾載體編碼的shRNA是由莖I、莖II和環(huán)構(gòu)成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，其中莖I 的序列為GAAC GUGG UCAA UGUA UAAU，莖II的序列為AUUAU ACAU UGAC CACG UUC， 環(huán)的序列為UCAAGAG;
編碼上述shRNA的DNA序列為GAAC GTGG TCAA TGTA TAAT TCAAGAG ATTAT ACAT TGAC CACG TTC (圖9);
構(gòu)建過程如下
(1) 構(gòu)建雙鏈DNA oligo片段
人工合成編碼上述shRNA的DNA的兩條鏈，然后在如下條件下退火合成雙鏈DNA oligo片段將體系混勻，9(TC溫育4分鐘，7(TC溫育10分鐘，緩慢冷卻至室溫， 得到雙鏈DNA oligo片段。
(2) 重組載體的構(gòu)建
用限制性內(nèi)切BamHI和Bbsl酶切出發(fā)載體pGPU6/GFP/Neo(上海吉瑪生物醫(yī)藥 技術(shù)公司，產(chǎn)品編號E-07)(圖5A)，用限制性內(nèi)切酶BamHI和Bbsl酶切上述 雙鏈DNA oligo片段，連接得到重組載體。
(3) 篩選及驗證將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細胞E. C0li，挑選陽性克??；用DNA序列測
定方法對陽性克隆進行鑒定，結(jié)果表明，得到了正確插入DNAoligo片段的陽性質(zhì) 粒，備用。將得到的陽性siRNA干擾載體命名為pGPU6/GFP/Neo/siRNA。 二、將siRNA干擾載體轉(zhuǎn)入肝癌細胞及結(jié)果檢測
1、 轉(zhuǎn)染效率的檢測
方法20x20mm的蓋玻片經(jīng)過潔凈處理，高溫、高壓消毒后放到6孔培養(yǎng)板中， 然后加入用含有10%胎牛血清的RPMI-1640把Bel 7402細胞調(diào)整到2xl()4個/ml的 細胞懸液2ml，置于37°C、5% 002的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞長到80%融合，用Lipo 2000 脂質(zhì)體將pGPU6/GFP/Neo/siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細胞中，待轉(zhuǎn)染12h后，去掉全部液體， 用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)細胞，18h后，取出蓋玻片，置于載玻片上， 用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率。
轉(zhuǎn)染結(jié)果如圖5B所示，轉(zhuǎn)染效率在75%以上。圖5B中，l表示未經(jīng)任何轉(zhuǎn)染 的細胞，2表示轉(zhuǎn)入空載體pGPU6/GFP/Neo的細胞，5表示轉(zhuǎn)入pGPU6/GFP/Neo/siRNA 的細胞。
2、 轉(zhuǎn)染后細胞內(nèi)的蛋白表達變化
將Bel 7402細胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640調(diào)整到2. 0xl04個/ml， 5 ml 細胞液培養(yǎng)于33cm2的培養(yǎng)瓶，每組設(shè)2個平行瓶，待細胞培養(yǎng)80%融合后，分別轉(zhuǎn) 染空載體pGPU6/GFP/Neo質(zhì)粒和pGPU6/GFP/Neo/siRNA，轉(zhuǎn)染12h后更換新的培養(yǎng) 液再培養(yǎng)細胞18h，加入40 n M的ATRA處理細胞，按Western Blotting雜交分析 方法提取細胞蛋白質(zhì)，并用Western Blotting雜交分析AFP和其它蛋白質(zhì)的表達。
經(jīng)ATRA處理的細胞中AFP的表達情況如圖6A所示，表明，在細胞轉(zhuǎn)染 pGPU6/GFP/Neo/siRNA后，Bel 7402細胞的AFP表達明顯受抑制。圖6A中，泳道1 表示未轉(zhuǎn)入任何載體的細胞，泳道2表示轉(zhuǎn)入空載體pGPU6/GFP/Neo的細胞，泳道 5表示轉(zhuǎn)入pGPU6/GFP/Neo/siRNA的細胞；a表示AFP蛋白，b表示(3-actin。
經(jīng)ATRA處理的細胞中survivin基因的表達情況如圖6B所示，結(jié)果表明，干 擾AFP表達后，再用ATRA (40 u M)進行處理細胞12小時后，細胞中survivn的表 達明顯下降，肝癌細胞對低劑量的ATRA (40jimol/L)也敏感。圖6B中，泳道1表 示未轉(zhuǎn)入干擾載體也未經(jīng)任何處理的細胞，泳道2表示未轉(zhuǎn)入干擾載體但經(jīng) 0.4。/。DMS0處理過的細胞，泳道3表示未轉(zhuǎn)入干擾載體但經(jīng)40 w M ATRA處理過的細 胞，泳道4表示沒有任何處理的細胞，泳道5表示轉(zhuǎn)入空載體的細胞，泳道6表示僅轉(zhuǎn)染pGPU6/GFP/Neo/siRNA質(zhì)粒的細胞，泳道7表示轉(zhuǎn)染pGPU6/GFP/Neo/siRNA 質(zhì)粒并且用0. 4%DMS0處理的細胞，泳道8表示轉(zhuǎn)染pGPU6/GFP/Neo/siRNA質(zhì)粒并 且用40 uM ATRA處理的細胞。a表示survivn， b表示(5-actin。
3、 轉(zhuǎn)染后細胞的增殖情況
轉(zhuǎn)染將肝癌細胞分別用含有10。/。胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為 37°C、 5。/。C02的培養(yǎng)箱，待細胞長到80%融合，用Lipo 2000脂質(zhì)體將干擾載體 pGPU6/GFP/Neo/siRNA轉(zhuǎn)入細胞中。
檢測待轉(zhuǎn)染30h后，用0.25%胰蛋白酶消化，再用含有10%胎牛血清的 RPMI-1640把細胞調(diào)整到2xl(^個/ml，將細胞液加入96空培養(yǎng)板中(120pL/孔)， 每組設(shè)8個平行孔，細胞培養(yǎng)24h，然后向孔中加入藥物處理24h， MTT計數(shù)法分析 細胞的增殖情況。
每種肝癌細胞均設(shè)以下處理
對照組l:細胞未經(jīng)任何轉(zhuǎn)染和處理；
對照組2:細胞轉(zhuǎn)入空載體(pGPU6/GFP/Neo質(zhì)粒)但未經(jīng)任何處理； 對照組3:細胞中轉(zhuǎn)入pGPU6/GFP/Neo/siRNA但未經(jīng)任何處理； 對照組4:細胞中轉(zhuǎn)入pGPU6/GFP/Neo/siRNA且用0. 4%DMS0處理； 實驗組細胞中轉(zhuǎn)入pGPU6/GFP/Neo/siRNA后經(jīng)40uM ATRA處理； 對照組5:細胞未經(jīng)任何轉(zhuǎn)染但經(jīng)40wM ATRA處理。 實驗設(shè)3次重復(fù)。
結(jié)果如圖7A所示，結(jié)果表明，對于Bel 7402細胞和H印G2細胞，轉(zhuǎn)入siRNA 干擾載體即干擾AFP表達后，細胞的生長明顯被ATRA抑制，和沒有轉(zhuǎn)染siRNA干擾 載體的細胞相比，轉(zhuǎn)染siRNA干擾載體的細胞對ATRA更敏感；對于HLE細胞，干 擾AFP表達后，HLE細胞的生長則沒有明顯的影響。
圖7A中，是以對照組1中的細胞數(shù)量計作100%， I表示未經(jīng)任何轉(zhuǎn)染和處理 的細胞，II表示轉(zhuǎn)入空載體但未經(jīng)任何處理的細胞，III表示轉(zhuǎn)入siRNA干擾載體但 未經(jīng)任何處理的細胞，IV表示轉(zhuǎn)入siRNA干擾載體且用0.4。/c)DMS0處理的細胞，V 表示轉(zhuǎn)入siRNA干擾載體且經(jīng)40 ii M ATRA處理的細胞，VI表示未經(jīng)任何轉(zhuǎn)染但經(jīng) 40 pM ATRA處理的細胞。
4、 轉(zhuǎn)染后細胞的形態(tài)變化按照實驗3中所述方法進行轉(zhuǎn)染，待轉(zhuǎn)染30h后，加入藥物處理24h，用數(shù)碼 相機拍攝細胞形態(tài)的改變；然后收集懸浮細胞到離心管，再用0.25%胰蛋白酶消化 貼壁細胞，用1.5ml PBS把細胞輕輕吹下，收集到裝有懸浮細胞的離心管中，離心 (1000g， 5min)，去掉PBS,用lml PBS把細胞輕輕吹散，加入10pl濃度為lOOjag/ml DAPI，避光37°C保溫30min，離心(1000g， 5min)，去掉上清液，加入lml PBS 把細胞輕輕吹散，離心(1000g, 5min)清洗細胞三次，去掉上清液，加入lOOplPBS 把細胞吹散，吸出2(^1細胞懸液加到干凈的載玻片上，再輕輕壓上蓋玻片，靜置 5min后，再用熒光顯微鏡觀察細胞凋亡小體，并顯微拍攝圖像。
每種肝癌細胞均設(shè)以下處理
對照組l:細胞未經(jīng)任何轉(zhuǎn)染和處理；
對照組2:細胞轉(zhuǎn)入空載體pGPU6/GFP/Neo質(zhì)粒，但未經(jīng)任何處理； 對照組3:細胞中轉(zhuǎn)入pGPU6/GFP/Neo/siRNA但未經(jīng)任何處理； 對照組4:細胞中轉(zhuǎn)入pGPU6/GFP/Neo/siRNA且用0. 4%DMS0處理； 實驗組細胞中轉(zhuǎn)入pGPU6/GFP/Neo/siRNA后經(jīng)40 u M ATRA處理； 對照組5:細胞未經(jīng)任何轉(zhuǎn)染但經(jīng)40 y M ATRA處理。 試驗設(shè)3次重復(fù)。
轉(zhuǎn)入siRNA干擾載體后如圖7B所示，熒光顯微鏡下細胞的形態(tài)學變化及細胞 核萎縮和凋亡情況如圖7C所示，試驗結(jié)果表明，用siRNA干擾載體干擾AFP表達 并用ATRA(40 yM)處理細胞后，細胞核濃縮、凋亡小體形成，轉(zhuǎn)染siRNA干擾載體 的細胞比未轉(zhuǎn)染的細胞結(jié)果明顯，圖中箭頭現(xiàn)實的凋亡小體。林代0.01表示的是與 其它處理組的比較。試驗結(jié)果也顯示，表達AFP的人肝癌細胞均得到圖7B和C的 結(jié)果)。
圖7B中，1表示未經(jīng)任何轉(zhuǎn)染和處理的細胞，2表示轉(zhuǎn)入空載體但未經(jīng)任何處 理的細胞，3表示轉(zhuǎn)入siRNA干擾載體但未經(jīng)任何處理的細胞，4表示轉(zhuǎn)入siRNA 干擾載體且用0. 4%DMS0處理的細胞，5表示轉(zhuǎn)入siRNA干擾載體且經(jīng)40 u M ATRA 處理的細胞，6表示未經(jīng)任何轉(zhuǎn)染但經(jīng)40uM ATRA處理的細胞；
圖7C中，1表示未經(jīng)任何轉(zhuǎn)染和處理的細胞，2表示轉(zhuǎn)入空載體但未經(jīng)任何處 理的細胞，3表示轉(zhuǎn)入siRNA干擾載體但未經(jīng)任何處理的細胞，4表示轉(zhuǎn)入siRNA 干擾載體且用0. 4%DMS0處理的細胞，5表示轉(zhuǎn)入siRNA干擾載體且經(jīng)40 u M ATRA 處理的細胞，6表示未經(jīng)任何轉(zhuǎn)染但經(jīng)40uMATRA處理的細胞，圖中箭頭指示的是凋亡小體。
5、轉(zhuǎn)染后細胞中AFP對RAR-p和survivin promoter相互作用的影響
(1) 用ChIP技術(shù)進行研究將肝癌細胞用含10。/o胎牛血清的RPMI-1640調(diào)整 到3.0xl()4個/ml， 3ml細胞液培養(yǎng)于10cm2的培養(yǎng)皿，每組設(shè)2個平行皿，待細胞 培養(yǎng)80%融合后，轉(zhuǎn)入pGPU6/GFP/Neo/siRNA質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染12h后更換新的培養(yǎng)液再 培養(yǎng)細胞18h;非轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組按照相同的條件培養(yǎng)細胞。完成轉(zhuǎn)染后，加入ATRA
(160,1/L)處理細胞2小時，按文獻(Testa A. et al. Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) on Chip Experiments Uncover a Widespread Distribution of NF-Y Binding CCAAT Sites Outside of Core Promoters. J. Biol. Chem. ， 2005; 280: 13606 - 13615.)的方法固定細胞，超聲粉碎細胞，免疫沉淀 相應(yīng)的蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合體(所用的抗體為小鼠抗人RAR-(3單克隆抗體)，解交聯(lián)， 用UPstate (USA)公司提供的ChIP試劑盒(EZ ChIP )提取DNA片段，PCR擴增 基因survivin的啟動子DNA拷貝。2%瓊脂糖凝膠電泳PCR產(chǎn)物，用凝膠成像系統(tǒng) 掃描DNA條帶。Input代表的是用于做染色體免疫共沉淀總的染色體。Marker: 100 bp DNA梯度；IgG:是用于做染色體免疫共沉淀對照的非免疫兔血清IgG。
PCR擴增survivin所用的引物序列為 Sense 5' -GATTACAGGCGTGAGCCACT-3'
Antisense5' -ATCTGGCGGTTAATGGCGCG-3'
結(jié)果如圖8A所示，結(jié)果表明，對于Bel 7402細胞和H印G2細胞，干擾AFP表 達并經(jīng)ATRA處理后，ATRA更能促進RAR-P與DNA的順式元件結(jié)合；對于HLE細胞
(不表達AFP)，干擾AFP表達并經(jīng)ATRA處理后，RAR-0與DNA的結(jié)合程度則沒 有顯著性變化。
圖8A中，I組表示轉(zhuǎn)染siRNA干擾載體的細胞，II組表示轉(zhuǎn)入空載體 pGPU6/GFP/Neo的細胞；A表示未經(jīng)任何處理，B表示經(jīng)ATRA (160fimol/L)處理； I組中泳道1表示marker,泳道2表示i叩ut，泳道3表示非免疫兔血清IgG沉淀 組，泳道4表示抗RAR-p單克隆抗體沉淀組；II組中泳道1表示i叩ut，泳道2表 示非免疫兔血清IgG沉淀組；泳道3表示抗RAR-(5單克隆抗體沉淀組。
ChIP技術(shù)研究表明，AFP能阻止RAR-p與survivin的啟動子結(jié)合，RNA干擾技 術(shù)封阻AFP表達后，再用ATRA處理，則增強RAR-p與survivin的啟動子結(jié)合。
(2) pcDNA3. 1-3// 的構(gòu)建
17s/p基因的獲得以AFP基因全長DNA為模板，用如下引物進行擴增 Sense 5' -TAGG AATT CTAG CAAC CATG AATG TGGT GG-3'
Antisense5' -AGCT CTAG ATTA AACT CCCA AAGC AGCA CG-3'.
用限制性內(nèi)切酶^coR I和i7;s I酶切上述PCR產(chǎn)物，再用相同的酶酶切載體 pcDNA3. 1，連接，得到重組載體pcDNA3. 用G418方法進行篩選，再測序驗
證，得到結(jié)構(gòu)正確的重組載體pcDNA3. l-a^。
將pcDNA3. 1-3//7轉(zhuǎn)入HLE細胞，再用Western blot分析HLE細胞在轉(zhuǎn)染 pcDNA3. l-a/p后的AFP表達情況，結(jié)果如圖8B所示(泳道1表示沒有任何處理的 對照組，泳道2表示轉(zhuǎn)入空載體pc麗A3. 1的HLE細胞，泳道3表示轉(zhuǎn)入pcDNA3. l-a/p 的HLE細胞，a表示AFP，b表示(3-actin).表明在轉(zhuǎn)染pcDNA3. 1-a/p后，HLE細胞 明顯有AFP表達。
(3)將轉(zhuǎn)入pcDNA3. 1- 的HLE細胞用ATRA(160 y M )處理24小時，再用 Western blot分析HLE細胞中survivin表達的變化。結(jié)果如圖8C所示(泳道1 表示沒有任何處理的對照組，泳道2表示未經(jīng)任何轉(zhuǎn)染但用160 uMATRA處理后 的HLE細胞，泳道3表示轉(zhuǎn)染pcDNA3. l-a/p但未經(jīng)任何處理的HLE細胞，泳道4 表示轉(zhuǎn)染pcDNA3. 1-a/p且經(jīng)160 u M ATRA處理后的HLE細胞，泳道5表示轉(zhuǎn)染空 載體pcDNA3. 1且經(jīng)160 u M ATRA處理后的HLE細胞，a表示survivin， b表示 (3-actin)，表明survivin的表達明顯升高，ATRA對survivin表達的抑制明顯減 弱。
以上結(jié)果表明在胞漿里AFP與RAR-e相互作用，能抑制RA-RAR信號的傳遞， AFP是RAR信號傳遞的輔抑制子。肝癌細胞耐受ATRA是因為在細胞胞漿里AFP與 RAR相互作用，阻斷RA-RAR-3信號途徑。細胞內(nèi)的AFP能夠阻止ATRA與RAR-P 相互結(jié)合，繼而形成復(fù)合體，阻止RAR-P與DNA結(jié)合，因而促進survivin的表達， 導(dǎo)致細胞腫瘤細胞增殖(圖8A-C)。
圖8D為細胞內(nèi)的AFP和血液循環(huán)里的AFP對肝癌Bel 7402細胞耐受ATRA的 影響示意圖。
綜上試驗結(jié)果表明用ATRA (10-160一)處理人肝癌Bel 7402細胞24小時后， MTT檢測結(jié)果顯示，ATRA大于80ioM時，對肝癌細胞的增殖才有明顯的抑制作用， 而AFP在濃度大于10mg/L時對Bel 7402細胞的生長則有促進作用；這些藥物對Bel 7402細胞生長的影響有劑量和時間的依賴性；AFP和ATRA共同處理肝癌細胞，則觀察到AFP具有對抗ATRA的誘導(dǎo)凋亡作用。顯微鏡技術(shù)和DAPI標記表明，大劑量 的ATRA (160|i M)處理24小時后能誘導(dǎo)肝癌Bel 7402細胞凋亡小體的形成；細胞 流式分析發(fā)現(xiàn)，ATRA阻止肝癌細胞周期進入M/G2期，從而抑制細胞生長；ATRA處 理Bel 7402細胞24小時后，Western Blotting檢測發(fā)現(xiàn)，ATRA不僅能促進肝癌 細胞表達RAR-p，而且也能抑制AFP和survivin的表達；CO-IP和共聚焦激光顯微 鏡技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，AFP能與RAR-財目互作用，并在細胞漿有共定位現(xiàn)象；當用ATRA
(160nM)分別處理細胞24小時后，發(fā)現(xiàn)AFP還能與RAR-(5相互作用，但有部分RAR-卩 移入細胞核。RANi技術(shù)干擾AFP表達后，再用ATRA (40pM)處理Bel 7402細胞12 小時后，發(fā)現(xiàn)肝癌Bcl-2和survivin的表達明顯下降，肝癌細胞對低劑量的ATRA
(40,)也敏感。ChIP技術(shù)研究表明，AFP能阻止RAR-(3與survivin的啟動子結(jié)合， RNA干擾技術(shù)封阻AFP表達后，再用ATRA處理，則增強RAR-(3與survivin的啟動 子結(jié)合。
結(jié)論肝癌細胞能耐受藥理劑量的ATRA誘導(dǎo)作用，其主要原因是肝癌細胞合 成的AFP能與RAR-p結(jié)合，影響RAR-p轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能，AFP阻止RAR-(5入核抑制 survivin的表達是Bel 7402細胞耐受ATRA誘導(dǎo)凋亡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
權(quán)利要求
1、甲胎蛋白及其編碼基因在設(shè)計和/或篩選藥物中的應(yīng)用。
2、 以甲胎蛋白及其編碼基因為靶點的物質(zhì)在制備藥物中的應(yīng)用。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物為用于預(yù)防和/或治療肝癌的藥物。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的應(yīng)用，其特征在于所述以甲胎蛋白及其編碼基因為靶點的物質(zhì)為核酸。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述核酸為抑制所述甲胎蛋白編碼基因表達的小干擾RNA、表達所述小干擾RNA的載體、表達抑制所述甲胎蛋白 編碼基因表達的shRNA的載體、與所述甲胎蛋白編碼基因發(fā)生同源重組且抑制所述 甲胎蛋白編碼基因表達的同源序列或含有所述同源序列的載體。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述shRNA由莖I、環(huán)和莖II 構(gòu)成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)；所述莖I的序列為GAAC GUGG UCAA UGUA UAAU，所述莖II的序列 為AUUAU ACAU UGAC CACG UUC，所述環(huán)的序列是UCAAGAG。
7、 一種以甲胎蛋白及其編碼基因為靶點的用于預(yù)防和/或治療肝癌的藥物。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的藥物，其特征在于所述藥物的活性成分為核酸。
9、 根據(jù)權(quán)利要求8所述的藥物，其特征在于所述核酸為抑制所述甲胎蛋白 編碼基因表達的小干擾RNA、表達所述小干擾RNA的載體、表達抑制所述甲胎蛋白 編碼基因表達的shRNA的載體、與所述甲胎蛋白編碼基因發(fā)生同源重組且抑制所述 甲胎蛋白編碼基因表達的同源序列或含有所述同源序列的載體。
10、 根據(jù)權(quán)利要求9所述的藥物，其特征在于所述shRNA由莖I、環(huán)和莖II 構(gòu)成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)；所述莖I的序列為GAAC GUGG UCAA UGUA UAAU，所述莖II的序列 為AUUAU ACAU UGAC CACG UUC，所述環(huán)的序列是UCAAGAG。
全文摘要
本發(fā)明公開了甲胎蛋白及其編碼基因的新用途。一種新用途為甲胎蛋白及其編碼基因在設(shè)計和/或篩選藥物中的應(yīng)用。一種以甲胎蛋白及其編碼基因為靶點的用于預(yù)防和/或治療肝癌的藥物。本發(fā)明的藥物能夠通過抑制肝癌細胞內(nèi)AFP蛋白的表達，從而減少AFP與RA的受體RAR-β的結(jié)合，使更多的RAR-β進入細胞核中，與survivin的啟動子結(jié)合從而抑制survivin的表達，進而抑制肝癌細胞的增殖。試驗證明，對于沒有用本發(fā)明藥物處理過的肝癌細胞，要用80μM或更大劑量的ATRA才能抑制肝癌細胞的增殖，而用本發(fā)明藥物能靶向的抑制肝癌細胞AFP的表達，通過阻斷AFP的表達，減少AFP促進肝癌細胞增殖或減輕AFP對ATRA的對抗作用，可以把ATRA誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡的劑量降低到40μM以下，因此，本發(fā)明的藥物增加了肝癌細胞對RA的敏感性，在靶向治療肝癌領(lǐng)域有重要的應(yīng)用價值。
文檔編號C12Q1/68GK101475996SQ20091007755
公開日2009年7月8日 申請日期2009年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月22日
發(fā)明者剛 李, 李孟森 申請人:北京大學