專利名稱：一種赤紅球菌以及利用該菌制備5-氰基戊酰胺的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物化學(xué)工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及赤紅球菌及其應(yīng)用，尤其是一種赤紅球 菌以及利用該菌制備5-氰基戊酰胺的方法。
技術(shù)背景5-氰基戊酰胺(5-cyanovalemmide， 5-CVAM)可用于合成唑啶草酮(Azafenidin) 和6-氨基己酰胺，其中唑啶草酮(Azafenidin)可用于制備的植物種子出土前的除 草劑，6-氨基己酰胺是合成己內(nèi)酰胺的重要中間體，己內(nèi)酰胺是一種常用的有機(jī)化 工原料。5-氰基戊酰胺可通過(guò)化學(xué)催化或者生物催化己二腈發(fā)生水合反應(yīng)方法予以 制備，由于己二腈分子式中含有兩個(gè)氰基，所以要求催化劑能夠區(qū)域選擇性水解其 中的一個(gè)氰基生成5-氰基戊酰胺。據(jù)檢索，美國(guó)專利5347033報(bào)道了由lmol己二腈和5mo1的水和80g甲醇以非 離子化的銅為催化劑在90。C條件反應(yīng)45min生產(chǎn)5-氰基戊酰胺的方法，該方法中己 二腈轉(zhuǎn)化率為7%，選擇性為88%，同時(shí)產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物己二酰胺。美國(guó)專利 5302756報(bào)道了由尼龍66、尼龍6氨解或酶解合成5-氰基戊酰胺的方法，該反應(yīng)過(guò) 程需要在300-350。C的高溫和500psig的高壓下反應(yīng)，反應(yīng)條件較苛刻，且在得到目 標(biāo)產(chǎn)物的同時(shí)，會(huì)伴隨生成副產(chǎn)物己二腈、6-氨基己酰胺、6-氨基己腈。美國(guó)專利 5728556報(bào)道了利用區(qū)域選擇性生物催化劑i^Wowomy / wrtW" 3L-G-1-5-1A-1 (ATCC 55736)轉(zhuǎn)化己二腈生成5-氰基戊酰胺，其中己二腈轉(zhuǎn)化率為100%時(shí)，對(duì)5-氰基戊酰胺的選擇性為98%。美國(guó)杜邦公司開(kāi)發(fā)了以二氧化錳為催化劑的己二腈化學(xué)水合法合成5-氰基戊酰 胺，該工藝會(huì)產(chǎn)生大量副產(chǎn)物己二酰胺(占被轉(zhuǎn)化己二腈的20%)，己二腈的轉(zhuǎn)化率為 25%，采用溶劑萃取法不易將5-氰基戊酰胺從未反應(yīng)的己二腈中分離出來(lái)，同時(shí)二 氧化錳的迅速減活導(dǎo)致每生產(chǎn)l kg 5-氰基戊酰胺就會(huì)浪費(fèi)1.25 kg催化劑。該公司還 發(fā)現(xiàn)了一種工業(yè)用生產(chǎn)5-氰基戊酰胺的區(qū)域選擇性催化劑i^ewcfomo"似"/ororapto B23(Nit-to化工公司的第二代丙烯酰胺生物催化劑)，B23細(xì)胞被固定于藻酸鈣顆粒中 以穩(wěn)定酶的活性，并使生物催化劑易于回收和再利用，利用該方法生產(chǎn)時(shí)己二腈轉(zhuǎn) 化率為97%， 5-氰基戊酰胺的最終產(chǎn)率為93%，選擇性為96%，與以二氧化錳為催化 劑的化學(xué)法相比減少了催化劑浪費(fèi)，但這一反應(yīng)過(guò)程中同樣會(huì)有副產(chǎn)物己二酰胺的 生成，增加了5-氰基戊酰胺分離純化的難度。綜上所述，目前5-氰基戊酰胺的生產(chǎn)方法存在以下不足1、部分方法的反應(yīng)條 件苛刻，對(duì)生產(chǎn)設(shè)備及生產(chǎn)條件要求較高，增加生產(chǎn)成本；2、部分生產(chǎn)方法轉(zhuǎn)化率以及選擇性均較低，原料利用率低，造成原料浪費(fèi)；3、上述幾種生產(chǎn)方法中，生成 目標(biāo)產(chǎn)物的同時(shí)產(chǎn)生的副產(chǎn)物也較多，增加了產(chǎn)品分離純化的難度。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種赤紅球菌以及利用該菌制備 5-氰基戊酰胺的方法，該方法具有反應(yīng)速度快、反應(yīng)周期短、易分離純化以及節(jié)省 能源的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)目的的技術(shù)方案是-一種赤紅球菌，形態(tài)特征為需氧、無(wú)動(dòng)力、無(wú)芽孢、革蘭氏陽(yáng)性菌，該菌種已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日期為2009年6 月4日，保藏號(hào)為CGMCC No. 3090。而且，所述赤紅球菌在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)初期菌體由球形細(xì)胞逐步變成長(zhǎng)桿狀， 繼續(xù)培養(yǎng)菌體逐步斷裂變成短桿狀，培養(yǎng)后期又變成球形；在LA培養(yǎng)平板上，菌 落呈橙紅色，不透明凸起，濕潤(rùn)，邊緣平整。而且，所述赤紅球菌中的腈水合酶催化己二腈區(qū)域選擇性水解生成5-氰基戊酰胺。一種赤紅球菌制備5-氰基戊酰胺的方法，制備的步驟是(1) 種子培養(yǎng)在搖瓶中加入種子培養(yǎng)基，從保藏的斜面中挑取菌種接于種子培 養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到種子液；(2) 發(fā)酵培養(yǎng)在搖瓶中加入發(fā)酵培養(yǎng)基，按2-5%的接種量接入種子液，發(fā)酵培 養(yǎng)，得到發(fā)酵液；(3) 制備赤紅球菌懸浮液將上述發(fā)酵液離心，去上清，所得濕菌體細(xì)胞用生理 鹽水洗滌2-4次，然后用pH 6-9緩沖液洗滌1-2次并懸浮于等體積的緩沖液中，得 到赤紅球菌懸浮液；(4) 5-氰基戊酰胺粗品的制備配置反應(yīng)物己二腈的濃度為0.5-2.5mol/L，赤紅球 菌細(xì)胞濃度控制在0.2-2.5g/L，在pH6-9緩沖液體系中加入終濃度為2.5%-20%的甲 醇，反應(yīng)溫度為20-4(TC，轉(zhuǎn)速為110-220rpm，轉(zhuǎn)化時(shí)間為120-300min，將得到的 轉(zhuǎn)化液離心除去菌體細(xì)胞，上清加入20%乙醇真空濃縮，得到5-氰基戊酰胺粗品；(5) 5-氰基戊酰胺的純化在5-氰基戊酰胺粗品中加入有機(jī)溶劑溶解，抽濾，上 清液真空濃縮，加入乙酸乙酯重結(jié)晶，過(guò)濾，再用乙酸乙酯洗滌并重結(jié)晶2-4次， 即得到5-氰基戊酰胺成品。而且，所述種子培養(yǎng)基的優(yōu)選配方及制備方法為0.5%-1.0%甘油、0.3%-0.7% 蛋白胨、0.2%-0.5%麥芽粉、0.2%-0.5%酵母粉、0.1%-0.2%NaCl， pH7.0-8.0， 121°C 滅菌20-30min。而且，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方及制備方法為1%-3%葡萄糖、0.2%-0.6%酵母粉、0.03%-0.06%K2HPO4、 0.03%-0.06% KH2P04、 0.2%-0.6% MgS04 7H20、 0.4%-1.0% 尿素、0.1%-0.3%NaCl、 0.001%-0.005%CoC12、 0.05%-0.2%谷氨酸鈉，pH7.0-8.0， 115°C 滅菌20-30min;其中誘導(dǎo)劑CoC12和尿素分別單獨(dú)滅菌。而且，所述乙酸乙酯重結(jié)晶的溫度為-2(TC。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果為1、 本發(fā)明開(kāi)發(fā)了一種赤紅球菌區(qū)域選擇性水解己二腈生成5-氰基戊酰胺的方 法，該方法催化效率高，己二腈的轉(zhuǎn)化率為100%，對(duì)5-氰基戊酰胺的區(qū)域選擇性 為100%,無(wú)副產(chǎn)物己二酰胺生成，簡(jiǎn)化了 5-氰基戊酰胺的分離純化工藝。2、 本發(fā)明在己二腈轉(zhuǎn)化體系中加入赤紅球菌，可人為調(diào)節(jié)和控制轉(zhuǎn)化速率以及 轉(zhuǎn)化液中菌體細(xì)胞濃度，細(xì)胞生長(zhǎng)和催化己二腈水解的過(guò)程可以獨(dú)立優(yōu)化，并可分 別達(dá)到各自的最適反應(yīng)條件，從而有效提高產(chǎn)物5-氰基戊酰胺的濃度，有利于產(chǎn)品 的分離純化，同時(shí)在轉(zhuǎn)化過(guò)程不必考慮底物、產(chǎn)物以及有毒副產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影 響。3、 本發(fā)明涉及的生產(chǎn)方法與固定化細(xì)胞法相比，具有反應(yīng)速度快、反應(yīng)周期短、 節(jié)省能源等優(yōu)點(diǎn)，更加適合工業(yè)化的生產(chǎn)。


圖1為本發(fā)明產(chǎn)物5-氰基戊酰胺電噴霧質(zhì)譜圖； 圖2為本發(fā)明產(chǎn)物5-氰基戊酰胺核磁共振氫譜圖。
具體實(shí)施方式
下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳述，以下實(shí)施例只是描述性的，不是 限定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明涉及的赤紅球菌己保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中 心，保藏日期為2009年6月4日，保藏號(hào)為CGMCCNo. 3090。本發(fā)明所涉及的赤 紅球菌中的腈水合酶(nitrile hydratase, NHase, E.C.4.2.1.84)可催化己二腈(adipic dinitrile, ADN)區(qū)域選擇性水解生成5-氰基戊酰胺(5-cyanovaleramide,5-CVAM)，以下 實(shí)施例所采用的菌種即為該保藏菌種。赤紅球菌(朋o^cocc^ n^er CGMCC No. 30卯)是從長(zhǎng)期被丙烯腈污染的丙烯 酰胺生產(chǎn)廠附近釆集的土樣中分離篩選得到，篩選過(guò)程中以葡萄糖為碳源，逐步增 大培養(yǎng)基中丙烯腈濃度進(jìn)行重復(fù)續(xù)代培養(yǎng)，富集培養(yǎng)三代后，涂布平板，挑取單菌 落接種于斜面培養(yǎng)基保藏。該赤紅球菌的形態(tài)特征如下需氧，無(wú)動(dòng)力，無(wú)芽孢，革蘭氏陽(yáng)性菌，其細(xì)胞 形態(tài)復(fù)雜多變?cè)贚B培養(yǎng)基中培養(yǎng)初期菌體由球形細(xì)胞逐步變成長(zhǎng)桿狀，繼續(xù)培 養(yǎng)菌體逐步斷裂變成短桿狀，培養(yǎng)后期又變成球形，在LA培養(yǎng)平板上，菌落呈橙 紅色，不透明凸起，濕潤(rùn)，邊緣平整。實(shí)施例1:一種利用赤紅球菌制備5-氰基戊酰胺的方法，制備的步驟是U)種子培養(yǎng)在250mL的搖瓶中加入30mL種子培養(yǎng)基，從保藏的斜面菌種中挑取一環(huán)接于種子培養(yǎng)基中，30°C， 180rpm培養(yǎng)28h，得到種子液；種子培養(yǎng)基1%甘油、0.5%蛋白胨、0.3%麥芽粉、0.3%酵母粉、0.1%NaCl、pH7.2， 12rC滅菌20min。(2) 發(fā)酵培養(yǎng)在250mL的搖瓶中加入30mL發(fā)酵培養(yǎng)基，按3%的接種量接入種 子液，28°C， 180rpm培養(yǎng)48h;發(fā)酵培養(yǎng)基2%葡萄糖、0.5%酵母粉、0.05%K2HPO4、 0.05% KH2P04、 0.4% MgS(V7H20、 0.7%尿素、0.2%NaCl、 0.002%CoCl2、 0.1%谷氨酸鈉，pH7.2， 115°C 滅菌20min;其中誘導(dǎo)劑CoCl2和尿素分別單獨(dú)滅菌，CoCl2 121 T滅菌20min,尿 素115'C滅菌3min。(3) 制備赤紅球菌懸浮液將上述發(fā)酵液離心分離，去上清，所得濕菌體細(xì)胞用 等體積的生理鹽水洗滌兩次，然后用pH 7.5 Tris-HCl洗滌一次并懸浮于等體積的該 緩沖液中，得到用于生物轉(zhuǎn)化己二腈的赤紅球菌懸浮液；(4) 5-氰基戊酰胺粗品的制備底物己二腈濃度為1.5mol/L，反應(yīng)體積30mL,赤 紅球菌細(xì)胞濃度為1.05 g/L，加入2.5。/。甲醇，轉(zhuǎn)化體系為20mmol/LpH7.5Tris-HCl 緩沖液，溫度為30°C,整個(gè)反應(yīng)在水浴反應(yīng)器中進(jìn)行，轉(zhuǎn)速為200rpm，轉(zhuǎn)化時(shí)間 為120min。轉(zhuǎn)化結(jié)束后轉(zhuǎn)化液離心除去菌體細(xì)胞，加入20%乙醇旋蒸除去水分，得 到5-氰基戊酰胺粗品；(5) 5-氰基戊酰胺的純化在5-氰基戊酰胺粗品中加入甲苯和甲醇至粗品完全溶 解，真空抽濾除去其中的鹽，上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至液體被蒸干，加入一定體積乙酸乙 酯于-2(TC重結(jié)晶，真空過(guò)濾，再用乙酸乙酯洗滌并重結(jié)晶2次，得到5-氰基戊酰胺 成品。產(chǎn)物5-氰基戊酰胺的鑒定(1) 理論上己二腈完全轉(zhuǎn)化得到5-氰基戊酰胺的粗品為23.32g，純度98.13%,經(jīng) 分離純化后5-氰基戊酰胺純品22.41g，純度99.99%。(2) 純品5-CVAM做熔點(diǎn)測(cè)定，測(cè)得其熔點(diǎn)為66.5-67'C。(3傻解電壓為4.5kV時(shí)，全掃描模式(掃描質(zhì)核比范圍為50 500m/z)下，產(chǎn) 物的電噴霧質(zhì)譜圖(ESI-MS)如圖1所示產(chǎn)物裂解成質(zhì)核比為125.12的分子離 子[M-H『，可判斷的相對(duì)分子質(zhì)量為126.12，底物己二腈的相對(duì)分子質(zhì)量為108.14， 產(chǎn)物比底物的相對(duì)分子質(zhì)量增加了 18，符合水合反應(yīng)的特征。(4)產(chǎn)物的核磁共振氫譜。H-NMR， 300 Hz， DMS0-d6為溶劑)見(jiàn)圖2:化學(xué) 位移S從8.0 1.0ppm區(qū)域共顯示出五組質(zhì)子峰，各峰分別與其分子中各質(zhì)子相互對(duì)應(yīng)，艮P: 5^H-NMR (300Hz;DMSO-d6) SH 7.28 (1H， s，迎)，6.76 (1 H， s，膽)，2.49 (2H， t， J=6.3Hz, H-5)， 2.07 (2H， t, J=6.9 Hz, H-2)， 1.55 (4 H， m， H-3， H-4)。由此可知，產(chǎn)物6分子中共計(jì)九個(gè)氫，化學(xué)位移為7.28ppm和6.76 ppm的質(zhì)子峰對(duì)應(yīng)為酰胺基團(tuán)中的氫。 實(shí)施例2:本實(shí)施例中步驟(l)、 (2)、 (3)和(5)均與實(shí)施例1相同，以下只敘述步驟(4)。(4)5-氰基戊酰胺粗品的制備底物己二腈濃度為0.5mol/L，反應(yīng)體積30mL，赤 紅球菌細(xì)胞濃度為0.53g/L，加入2.5%甲醇，轉(zhuǎn)化體系為20mmol/L pH7.5 Tris-HCl 緩沖液，溫度為30°C，整個(gè)反應(yīng)在水浴反應(yīng)器中進(jìn)行，轉(zhuǎn)速為180rpm，轉(zhuǎn)化時(shí)間 為120min。轉(zhuǎn)化結(jié)束后轉(zhuǎn)化液離心除去菌體細(xì)胞，加入20%乙醇旋蒸除去水分，得 到5-氰基戊酰胺粗品；經(jīng)檢測(cè)本步驟中己二腈轉(zhuǎn)化率達(dá)到100%，對(duì)5-氰基戊酰胺的選擇性100%。實(shí)施例3:本實(shí)施例中步驟(l)、 (2)、 (3)和(5)均與實(shí)施例1相同，以下只敘述步驟(4)。(4)5-氰基戊酰胺粗品的制備底物己二腈濃度為0.8mol/L，反應(yīng)體積30mL,赤 紅球菌細(xì)胞濃度為0.53g/L，加入2.5%甲醇，轉(zhuǎn)化體系為20mmol/L pH7.5 Tris-HCl 緩沖液，溫度為3(TC，整個(gè)反應(yīng)在水浴反應(yīng)器中進(jìn)行，轉(zhuǎn)速為180rpm，轉(zhuǎn)化時(shí)間 為240min。轉(zhuǎn)化結(jié)束后轉(zhuǎn)化液離心除去菌體細(xì)胞，加入20%乙醇旋蒸除去水分，得 到5-氰基戊酰胺粗品；經(jīng)檢測(cè)本步驟中己二腈轉(zhuǎn)化率達(dá)到100%，對(duì)5-氰基戊酰胺的選擇性100%。實(shí)施例4:本實(shí)施例中步驟(l)、 (2)、 (3〉和(5)均與實(shí)施例1相同，以下只敘述步驟(4)。(4)5-氰基戊酰胺粗品的制備底物己二腈濃度為1.0mol/L，反應(yīng)體積30mL，赤 紅球菌細(xì)胞濃度為0.53g/L，加入2.5%甲醇，轉(zhuǎn)化體系為20mmol/LpH7.5Tris-HC暖 沖液，溫度為3(TC，整個(gè)反應(yīng)在水浴反應(yīng)器中進(jìn)行，轉(zhuǎn)速為180rpm，轉(zhuǎn)化時(shí)間為 300min。轉(zhuǎn)化結(jié)束后轉(zhuǎn)化液離心除去菌體細(xì)胞，加入20%乙醇旋蒸除去水分，得到 5-氰基戊酰胺粗品；經(jīng)檢測(cè)本步驟中己二腈轉(zhuǎn)化率達(dá)到100%，對(duì)5-氰基戊酰胺的選擇性100%。實(shí)施例5:本實(shí)施例中步驟(l)、 (2)、 (3)和(5)均與實(shí)施例1相同，以下只敘述步驟(4)。 (4)5-氰基戊酰胺粗品的制備底物己二腈濃度為1.5mol/L，反應(yīng)體積30mL，赤 紅球菌細(xì)胞濃度為0,53g/L，加入2.5%甲醇，轉(zhuǎn)化體系為20mmol/LpH7.5Tris-HCl緩 沖液，溫度為30。C，整個(gè)反應(yīng)在水浴反應(yīng)器中進(jìn)行，轉(zhuǎn)速為180rpm，轉(zhuǎn)化對(duì)間為 300min。轉(zhuǎn)化結(jié)束后轉(zhuǎn)化液離心除去菌體細(xì)胞，加入20%乙醇旋蒸除去水分，得到5-氰基戊酰胺粗品；經(jīng)檢測(cè)本步驟中己二腈轉(zhuǎn)化率達(dá)到92%，對(duì)5-氰基戊酰胺的選擇性100%。 實(shí)施例6:本實(shí)施例中步驟(l)、 (2)、 (3)和(5)均與實(shí)施例l相同，以下只敘述步驟(4)。(4)5-氰基戊酰胺粗品的制備底物己二腈濃度為2.0mol/L，反應(yīng)體積30mL，赤 紅球菌細(xì)胞濃度為0.53g/L，加入2.5%甲醇，轉(zhuǎn)化體系為20mmol/L pH7.5 Tris-HCl 緩沖液，溫度為3(TC,整個(gè)反應(yīng)在水浴反應(yīng)器中進(jìn)行，轉(zhuǎn)速為180rpm，轉(zhuǎn)化時(shí)間 為300min。轉(zhuǎn)化結(jié)束后轉(zhuǎn)化液離心除去菌體細(xì)胞，加入20%乙醇旋蒸除去水分，得 到5-氰基戊酰胺粗品；經(jīng)檢測(cè)本步驟中己二腈轉(zhuǎn)化率達(dá)到83%。實(shí)施例7:本實(shí)施例中步驟(l)、 (2)、 (3)和(5)均與實(shí)施例1相同，以下只敘述步驟(4)。 (4)5-氰基戊酰胺粗品的制備底物己二腈濃度為1.5mol/L，反應(yīng)體積30mL，赤 紅球菌細(xì)胞濃度為0.53 g/L，加入2.5%甲醇，轉(zhuǎn)化體系為pH7.5Tris-HCl緩沖液，溫 度為3(TC，整個(gè)反應(yīng)在水浴反應(yīng)器中進(jìn)行，轉(zhuǎn)速為180rpm，轉(zhuǎn)化時(shí)間為300min。轉(zhuǎn) 化結(jié)束后轉(zhuǎn)化液離心除去菌體細(xì)胞，加入20%乙醇旋蒸除去水分，得到5-氰基戊酰 胺粗品；經(jīng)檢測(cè)本步驟中己二腈轉(zhuǎn)化率達(dá)到80%。 實(shí)施例8:本實(shí)施例中步驟(l)、 (2)、 (3)和(5)均與實(shí)施例1相同，以下只敘述步驟(4)。(4)5-氰基戊酰胺粗品的制備底物己二腈濃度為1.5mol/L，反應(yīng)體積30mL，赤 紅球菌細(xì)胞濃度為0.79 g/L，加入2.5%甲醇，轉(zhuǎn)化體系為20mmol/LpH7.5Tris-HCl 緩沖液，溫度為3(TC，整個(gè)反應(yīng)在水浴反應(yīng)器中進(jìn)行，轉(zhuǎn)速為180rpm，轉(zhuǎn)化時(shí)間為 300min。轉(zhuǎn)化結(jié)束后轉(zhuǎn)化液離心除去菌體細(xì)胞，加入20%乙醇旋蒸除去水分，得到 5-氰基戊酰胺粗品；經(jīng)檢測(cè)本步驟中己二腈轉(zhuǎn)化率達(dá)至U98.4W。實(shí)施例9:本實(shí)施例中步驟(l)、 (2)、 (3)和(5)均與實(shí)施例1相同，以下只敘述步驟(4)。 (4)5-氰基戊酰胺粗品的制備底物己二腈濃度為1.5mol/L，反應(yīng)體積30mL，赤 紅球菌細(xì)胞濃度為0.88 g/L，加入2.5°/。甲醇，轉(zhuǎn)化體系為20mmol/LpH7.5Tris-HCl 緩沖液，溫度為3(TC，整個(gè)反應(yīng)在水浴反應(yīng)器中進(jìn)行，轉(zhuǎn)速為180rpm，轉(zhuǎn)化時(shí)間為 240min。轉(zhuǎn)化結(jié)束后轉(zhuǎn)化液離心除去菌體細(xì)胞，加入20%乙醇旋蒸除去水分，得到 5-氰基戊酰胺粗品；經(jīng)檢測(cè)本步驟中己二腈轉(zhuǎn)化率達(dá)到100%。
權(quán)利要求
1、一種赤紅球菌，其特征在于赤紅球菌的形態(tài)特征為需氧、無(wú)動(dòng)力、無(wú)芽孢、革蘭氏陽(yáng)性菌，該菌種已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日期為2009年6月4日，保藏號(hào)為CGMCC No.3090。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種赤紅球菌，其特征在于所述赤紅球菌在LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)初期菌體由球形細(xì)胞逐步變成長(zhǎng)桿狀，繼續(xù)培養(yǎng)菌體逐步斷裂變成 短桿狀，培養(yǎng)后期又變成球形；在LA培養(yǎng)平板上，菌落呈橙紅色，不透明凸起，濕潤(rùn)，邊緣平整。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種赤紅球菌，其特征在于所述赤紅球菌中的 腈水合酶催化己二腈區(qū)域選擇性水解生成5-氰基戊酰胺。
4、 一種利用如權(quán)利要求l所述的赤紅球菌制備5-氰基戊酰胺的方法，其特征 在于制備的步驟是(l)種子培養(yǎng)在搖瓶中加入種子培養(yǎng)基，從保藏的斜面中挑取菌種接于種子 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到種子液； G)發(fā)酵培養(yǎng)在搖瓶中加入發(fā)酵培養(yǎng)基，按2-5%的接種量接入種子液，發(fā) 酵培養(yǎng)，得到發(fā)酵液；(3) 制備赤紅球菌懸浮液將上述發(fā)酵液離心，去上清，所得濕菌體細(xì)胞用生 理鹽水洗滌2-4次，然后用pH 6-9緩沖液洗滌1-2次并懸浮于等體積的緩沖液中， 得到赤紅球菌懸浮液；(4) 5-氰基戊酰胺粗品的制備配置反應(yīng)物己二腈的濃度為0.5-2.5mol/L，赤 紅球菌細(xì)胞濃度控制在0.2-2.5g/L,在pH6-9緩沖液體系中加入終濃度為 2.5%-20%的甲醇，反應(yīng)溫度為20-40°C，轉(zhuǎn)速為U0-220rpm，轉(zhuǎn)化時(shí)間為 120-300min，將得到的轉(zhuǎn)化液離心除去菌體細(xì)胞，上清加入20%乙醇真空濃縮， 得到5-氰基戊酰胺粗品；(5) 5-氰基戊酰胺的純化在5-氰基戊酰胺粗品中加入有機(jī)溶劑溶解，抽濾， 上清液真空濃縮，加入乙酸乙酯重結(jié)晶，過(guò)濾，再用乙酸乙酯洗滌并重結(jié)晶2-4 次，即得到5-氰基戊酰胺成品。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用赤紅球菌制備5-氰基戊酰胺的方法，其特征 在于所述種子培養(yǎng)基的優(yōu)選配方及制備方法為0.5%-1.0%甘油、0.3%-0.7%蛋 白胨、0.2%-0.5%麥芽粉、0.2%-0.5%酵母粉、0.1%-0.2o/oNaCl， pH 7.0-8.0， 121°C 滅菌20-30min。
6、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用赤紅球菌制備5-氰基戊酰胺的方法，其特征 在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方及制備方法為1%-3%葡萄糖、0.2%-0.6%酵母粉、,0.03%-0.06%K2HPO4 、 0.03%-0.06% KH2P04 、 0.2%-0.6% MgS04 7H20 、 0.4%-1.0%尿素、0.1%-0.3%NaCl、 0.001%-0.005%CoC12、 ,0.05%-0.2%谷氨酸鈉， pH7.0-8.0， 115。C滅菌20-30min;其中誘導(dǎo)劑CoC12和尿素分別單獨(dú)滅菌。
7、根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用赤紅球菌制備5-氰基戊酰胺的方法，其特征 在于所述乙酸乙酯重結(jié)晶的溫度為-2(TC。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種赤紅球菌以及利用該菌制備5-氰基戊酰胺的方法，需氧、無(wú)動(dòng)力、無(wú)芽孢、革蘭氏陽(yáng)性菌，該菌種已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日期為2009年6月4日，保藏號(hào)為CGMCC No.3090。利用該菌制備5-氰基戊酰胺的方法，步驟為(1)種子培養(yǎng)；(2)發(fā)酵培養(yǎng)；(3)制備赤紅球菌懸浮液；(4)5-氰基戊酰胺粗品的制備；(5)5-氰基戊酰胺的純化。本發(fā)明開(kāi)發(fā)了一種赤紅球菌區(qū)域選擇性水解己二腈生成5-氰基戊酰胺的方法，該方法催化效率高，己二腈的轉(zhuǎn)化率高達(dá)100％，對(duì)5-氰基戊酰胺的區(qū)域選擇性為100％，無(wú)副產(chǎn)物己二酰胺生成，簡(jiǎn)化了5-氰基戊酰胺的分離純化工藝。
文檔編號(hào)C12N1/20GK101619299SQ20091006964
公開(kāi)日2010年1月6日 申請(qǐng)日期2009年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月8日
發(fā)明者華 孫, 李曉丹, 敏 王, 申雁冰, 宇 鄭, 駱健美 申請(qǐng)人:天津科技大學(xué)