專利名稱：耐受hppd抑制劑型除草劑的植物的制作方法
耐受HPPD抑制劑型除草劑的植物發(fā)明簡介本發(fā)明涉及從屬于紅球菌屬(Rhodococcus)的細(xì)菌獲得的編碼羥苯基丙酮酸雙加氧酶(EC I. 13. 11. 27，本文縮寫為HPro)的核酸序列及其所編碼的蛋白質(zhì)，并且涉及包含此類核酸序列的嵌合基因，以及此類核酸序列、蛋白質(zhì)或嵌合基因用于獲得對HPro除草劑耐受的植物的用途。
背景技術(shù)：
HPro是催化酪氨酸降解產(chǎn)物，對羥苯基丙酮酸(本文縮寫為HPP)轉(zhuǎn)化為植物中生育酚和質(zhì)體醌的前體尿黑酸(本文縮寫為HG)的反應(yīng)的酶(Crouch N. P.等人(1997)Tetrahedron,53,20,6993-7010, Fritze 等人，(2004), Plant Physiology 134 1388-1400)。生育酚作為膜關(guān)聯(lián)的抗氧化劑發(fā)揮作用。質(zhì)體醌首先作為PSII和細(xì)胞色素b6/f復(fù)合物之間的電子載體發(fā)揮作用，其次是八氫番茄紅素去飽和酶的氧化還原輔助因子，其參與類胡蘿卜素的生物合成。到目前為止，NCBI數(shù)據(jù)庫中有來自多種生物的多于700個核酸序列被注釋為編碼具有HPI3D結(jié)構(gòu)域的推定蛋白質(zhì)，所述序列分別包括在UniProtKB/TrEMBL數(shù)據(jù)庫中給出的檢索號Q0SC92和Q0SF39下的以及在NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中給出的檢索號YP_703002和ΥΡ_702005下的公開的序列。但對于大部分序列，包括對應(yīng)檢索號Q0SC92/ΥΡ_703002和Q0SF39/YP_702005的序列，還沒有證明蛋白質(zhì)在體外測定或在植物體內(nèi)(in planta)方法中具有HPTO酶促活性，也沒有證明當(dāng)在植物中表達(dá)時此類HPTO蛋白質(zhì)能賦予對HPI3D抑制劑型除草劑的除草劑耐受性?，F(xiàn)有技術(shù)描述了若干HPI3D蛋白質(zhì)及其一級序列，特別地細(xì)菌(例如假單胞菌(Riletschi等人,Eur. J. Biochem. , 205,459-466,1992, WO 96/38567))、植物(例如擬南芥(W0 96/38567，Genebank AF047834)、胡蘿卜(W0 96/38567， Genebank 87257)、燕麥(Avena sativa)(W0 02/046387)、小麥(W0 02/046387)，寬葉臂形草(Brachiaria platyphylla) (W002/046387)、蒺藜草(Cenchrus echinatus) (W0 02/046387)、硬直黑麥草(Lolium rigidum) (W0 02/046387)、高羊茅(Festuca arundinacea)(W002/046387)、大狗尾草(Setaria faberi)(W002/046387)、牛筋草(Eleusine indica) (W0 02/046387)、高粱(Sorghum) (TO 02/046387)、Coccicoides (Genebank C0ITRP)、日本黃連(Coptis japonica) (W0 06/132270)、萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii) (ES 2275365))或哺乳動物(例如小鼠或豬)的 HPPD 蛋白質(zhì)。上述參考文獻(xiàn)中公開的相應(yīng)序列以引用的方式并入本文。大部分植物經(jīng)由arrogenate 合成酪氨酸(Abou-Zeid 等人(1995), Applied EnvMicrob 41 :1298-1302 ;Bonner 等人，(1995)，Plant Cells Physiol. 36,1013-1022 ；Byng等人，(1981), Phytochemistry 6 :1289-1292 ；Connely 和 Conn(1986), Z. Naturforsch41c :69-78 ；Gaines 等人，(1982)，Plants 156 :233-240)。在這些植物中，HPP 只源自酪氨酸的降解。另一方面，在例如酵母釀酒酵母或細(xì)菌大腸桿菌等生物中，HPP是酪氨酸前體，并且其是通過預(yù)苯酸脫氫酶(本文此后簡稱為TOH)的作用合成的，所述預(yù)苯酸脫氫酶將預(yù)苯酸轉(zhuǎn)變?yōu)?HPP (Lingens 等人，(1967) European J. Biochem I :363-374 ;Sampathkumar 和Morrisson (1982) ,Bioch Biophys Acta 701:204-211)。在這些生物中，HPP 的生產(chǎn)因而與芳香族氨基酸生物合成途徑(莽草酸途徑)而不與酪氨酸降解途徑直接連結(jié)。HPPD的抑制導(dǎo)致光合作用的解偶聯(lián)、輔助光收獲色素的缺乏以及最重要地，由于缺乏正常情況下由類胡蘿卜素提供的光保護(hù)而導(dǎo)致的葉綠素II被UV輻射和活性氧類破壞(褪色)(Norris等人(1995) ,Plant Cell 7:2139-2149)。光合作用活性的組織的褪色導(dǎo)致生長抑制和植物死亡。抑制HPro、以及特異性地與該酶結(jié)合以抑制HPP轉(zhuǎn)化為尿黑酸的一些分子被證明是非常有效的選擇性除草劑。
目前大部分可商購的HPro抑制劑型除草劑屬于以下四個化學(xué)物家族之一I)三酮類，例如磺草酮(sulcotrione)[即2_[2_氯_4_(甲磺?；?苯甲酰]-I，3-環(huán)己二酮]、甲基磺草酮(mesotrione)[即2- [4-(甲磺?；?_2_硝基苯甲酰]-I，3-環(huán)己二酮]、環(huán)磺酮(tembotrione)[即2_[2_氯_4_(甲磺?；?_3_[ (2，2，2，-三-氟乙氧基)甲基]苯甲酰]-1，3-環(huán)-己二酮]、莊無忌(tefuryltrione)[即2-[2-氯_4_(甲磺?；?-3_[[(四氫-2-呋喃基)甲氧基]甲基]苯甲酰]-1，3-環(huán)-己二酮]]、雙環(huán)吡喃酮(bicyclopyrone)[即4_輕基_3_[ [2_[ (2_甲氧乙氧基)甲基]_6_(三氟甲基)_3_卩比唳基]羰基]二環(huán)[3. 2. I]辛-3-烯-2-酮]、苯并雙環(huán)酮(Benzobicyclon)[即3-(2-氯-4-甲磺酰基苯甲酰)-2-苯硫基雙環(huán)[3. 2. I]辛-2-烯-4-酮]。2) 二酮腈類，例如2-氰基-3-環(huán)丙基-I- (2-甲磺?；?4-三氟甲基苯基)-丙烷-1，3-二酮和2-氰基-1-[4-(甲磺?；?_2三氟甲基苯基]-3-(1-甲基環(huán)丙基)丙烷-1，3-二酮；3)異藥唑類，例如異·氟草(isoxafIutole)[即(5-環(huán)丙基-4-異1 唑基)[2-(甲磺?；?-4-(三氟甲基)苯基]甲酮]。在植物中，異碟氟草被迅速代謝為DKN，DKN是二酮腈化合物，表現(xiàn)出HPH)抑制劑性質(zhì)；和4)卩比唑特類，例如苯卩比唑草酮(topramezone)[即[3_(4，5_ 二輕基_3_異^唑基)-2-甲基4-(甲磺酰基)苯基](5-羥基-I-甲基-IH-吡唑-4-基)甲酮]，以及口5^^8111;1^01016[(5-輕基-1,3-二甲基卩比唑-4-基(2_甲磺?；鵢4_三氟甲基苯基)甲酮]、節(jié)草唑(pyrazofen) [2-[4-(2,4-二氯苯甲酰)-I, 3-二甲基卩比唑-5-基氧]乙酰苯]。這些HPro抑制性除草劑可在表現(xiàn)代謝耐受的農(nóng)作物植物(例如玉米(Zea mays))中用于對抗草和/或?qū)捜~雜草，在這些農(nóng)作物植物中它們被迅速降解(Schulz等人，(1993). FEBS letters, 318,162-166 ;Mitchell 等人，(2001) Pest Management Science,第57 卷，120-128 ；Garcia 等人，(2000)Biochem.，39，7501-7507 ；Pallett 等人，(2001)PestManagement Science，第57卷，133-142)。為擴(kuò)展這些HPH)抑制性除草劑的范圍，進(jìn)行了許多努力以賦予植物，特別地沒有代謝耐受或具有表現(xiàn)不佳的代謝耐受的植物在農(nóng)藝田間條件下可接受的耐受水平。除了繞過HPro介導(dǎo)的尿黑酸生產(chǎn)的嘗試外(美國專利6，812，010)，進(jìn)行了對敏感酶的過表達(dá)以此在植物中生產(chǎn)相對于除草劑足夠的大量靶酶(W096/38567)。HPTO的過表達(dá)導(dǎo)致對異5惡氟草(IFT)的二酮腈衍生物(DKN)的更好的出苗前耐受，但耐受不足以耐受出苗后處理(Matringe 等人,(2005), Pest Management Science 61 :269-276)。第三種策略是使HPro突變以獲得靶酶，該靶酶在保留其催化HPP轉(zhuǎn)化為尿黑酸的性質(zhì)的同時，相比突變前的天然HPro對HPro抑制劑敏感性較低。這一策略已成功應(yīng)用于生產(chǎn)對屬于二酮腈類家族的兩種HPro抑制性除草劑(W099/24585)，2-氰基-3-環(huán)丙基-I- (2-甲磺酰基_4_三氟甲基苯基)-丙烷-I，3- 二酮和
2-氰基-I-[4-(甲磺?；?-2-三氟甲基苯基]-3-(I-甲基環(huán)丙基)丙烷-I，3-二酮耐受的植物(EP496630)。Pro215Leu、Gly336Glu、Gly336Ile 以及更特別地 Gly336Trp (突變的氨基酸的位置是參考假單胞菌HPH)說明的)被鑒定為對出苗前用這些二酮腈類除草劑處理的耐受增加而不引起酶活性變動的原因。最近，將假單胞菌HPro基因?qū)霟煵莺痛蠖官|(zhì)體基因組顯示比核轉(zhuǎn)化更高效，甚至賦予對異flT惡氟草出苗后應(yīng)用異遞氟草的耐受(Dufourmantel等人，2007, PlantBiotechnol J. 5(1) :118-33)。 在WO 04/024928中，發(fā)明人尋求通過增加HPP前體進(jìn)入這些植物細(xì)胞中的流量，增加植物細(xì)胞中異戊二烯醌的生物合成(例如質(zhì)體醌、生育酚的合成)。這是通過過表達(dá)PDH酶，通過連接所述前體的合成與“莽草酸”途徑完成的。他們也注意到，用編碼PDH酶的基因轉(zhuǎn)化植物使得可能增加所述植物對HPH)抑制劑的耐受性。在專利申請WO 2009/144079中，公開了下文所述核酸序列及其用于獲得對HPH)抑制劑型除草劑耐受的植物的用途，所述核酸序列編碼在熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)HPPD蛋白質(zhì)的第336位置突變的羥苯基丙酮酸雙加氧酶(HPPD)。在WO 2002/046387中，鑒定了可能與賦予對多種HPH)抑制劑型除草劑耐受相關(guān)的、源自植物的HPro蛋白質(zhì)的若干個結(jié)構(gòu)域，但沒有已顯示的植物體內(nèi)或生物化學(xué)的數(shù)據(jù)來驗證所述結(jié)構(gòu)域功能的影響。在WO 2008/150473中，例示了兩種截然不同的耐受機(jī)制——編碼突變體HPTO酶的經(jīng)修飾的燕麥基因和CYP450玉米單加氧酶(nsf I基因)的組合，以獲得對HPTO抑制劑型除草劑改善的耐受，但沒有公開證明基于兩種蛋白質(zhì)組合的協(xié)同作用的數(shù)據(jù)。盡管對表現(xiàn)對多種HPro抑制劑型除草劑耐受的植物的開發(fā)獲得了一些成功，開發(fā)和/或改善植物對較新的或若干不同HPro抑制劑的耐受，特別地屬于三酮類(例如磺草酮、甲基磺草酮、環(huán)磺酮、苯并雙環(huán)酮和雙環(huán)吡喃酮)和吡唑特類(例如苯吡唑草酮和pyrasulfotole)的HPF1D抑制劑的耐受依然是必要的。發(fā)明描述本發(fā)明因而涉及生成含有可獲得自或獲得自屬于紅球菌屬的生物的編碼HPH)蛋白質(zhì)的基因及其變體或突變體的轉(zhuǎn)基因植物，更特別地涉及來自屬于紅球菌屬某種(Rhodococcus sp.)的生物的基因及其變體或突變體，更特別地涉及來自屬于紅球菌屬RHAl種的菌株的生物的基因及其變體或突變體，所述基因編碼具有催化對羥苯基丙酮酸轉(zhuǎn)化為尿黑酸的性質(zhì)的HPH)酶，并且所述植物比不含有任何此類編碼HPH)的轉(zhuǎn)基因的植物對HPro抑制劑較不敏感。更特別地，本發(fā)明因而涉及生成含有可獲得自或獲得自屬于紅球菌屬的生物的編碼HPro蛋白質(zhì)的基因及其變體或突變體的轉(zhuǎn)基因植物，更特別地涉及來自屬于紅球菌屬某種(Rhodococcus sp.)的生物的基因及其變體或突變體，更特別地涉及來自屬于紅球菌屬RHAl種的菌株的生物的基因及其變體或突變體，最特別地涉及來自屬于分離群ro03041或ι·ο02040的生物的基因及其變體或突變體，所述基因編碼具有催化對羥苯基丙酮酸轉(zhuǎn)化為尿黑酸的性質(zhì)的HPro酶，并且所述植物比不含有任何此類HPro轉(zhuǎn)基因的植物對HPro抑制劑較不敏感。將來自紅球菌屬RHAl種，更特別地來自屬于分離群ro03041或ι·Ο02040、編碼HPro蛋白質(zhì)的基因選作優(yōu)秀的HPro抑制劑耐受候選基因，這是由于根據(jù)在HPro蛋白中實驗和結(jié)構(gòu)所確定的，與已經(jīng)作為HPro抑制劑型除草劑敏感的參考分子的敏感的擬南芥HPPD蛋白質(zhì)相比，所述基因在與HPro抑制劑耐受相關(guān)的位置處的氨基酸組成高度趨異。在一個實施方式中，本發(fā)明涉及本文命名為“本發(fā)明的HPro蛋白質(zhì)”或“紅球菌HPro蛋白質(zhì)”的HPro蛋白質(zhì)，所述HPro蛋白質(zhì)是與SEQ ID NO. 4從第2位至第皿位氨基酸的氨基酸序列，特別地與SEQ ID NO. 4、5、6或7中的任一個、優(yōu)選地SEQ ID NO. 6的氨基酸序列，和/或與SEQ ID NO. 18從第2位至第_位氨基酸的氨基酸序列，特別地與SEQID NO. 18、19、20或21中的任一個、優(yōu)選地SEQ ID NO. 20的氨基酸序列具有至少80%、至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少97 %、至少98 %或至少99 %氨基酸序列同一性的HPTO蛋白質(zhì)。
在其他實施方式中，本發(fā)明涉及從ro03041分離的，本文命名為“本發(fā)明的HPH)蛋白質(zhì)ro03041”或“紅球菌ro03041HPro蛋白質(zhì)”的HPH)蛋白質(zhì)，所述HPH)蛋白質(zhì)是與SEQID NO. 4從第2位至第401位的氨基酸序列，特別地與SEQ ID NO. 4、5、6、7中的任一個、優(yōu)選地SEQ ID NO. 6的氨基酸序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%氨基酸序列同一性的HPH)蛋白質(zhì)，并且其中來自SEQ IDNO. 4的第207位至第401位氨基酸的任何氨基酸可以被天然存在的氨基酸修改，優(yōu)選地可以是任何保守替換。在其他實施方式中，本發(fā)明涉及從ro02040分離的，本文命名為“本發(fā)明的HPTO蛋白質(zhì)ro02040”或“紅球菌ro02040HPro蛋白質(zhì)”的HPH)蛋白質(zhì)，所述HPH)蛋白質(zhì)是與SEQID NO. 18從第2位至第402位氨基酸的氨基酸序列，特別地與SEQ ID NO. 18、19、20、21中的任一個、優(yōu)選地SEQ ID NO. 20的氨基酸序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%氨基酸序列同一性的HPH)蛋白質(zhì)，并且其中來自SEQ ID NO. 18的第208位至第402位氨基酸的任何氨基酸可以被任何天然存在的氨基酸修改，優(yōu)選地可以是任何保守替換。在其他的實施方式中，本發(fā)明涉及本文命名為“本發(fā)明的HPro蛋白質(zhì)”或“來自分離群ro03041的紅球菌HPro蛋白質(zhì)”的HPTO蛋白質(zhì)，所述HPTO蛋白質(zhì)是與SEQ ID NO. 4從第2位至第401位氨基酸的氨基酸序列，特別地與SEQ ID NO. 4、5、6、7中的任一個，優(yōu)選地SEQ ID NO. 6的氨基酸序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%的氨基酸序列同一性的HPH)蛋白質(zhì)，并且所述HPTO蛋白質(zhì)在由括號中給出的編號確定的位置處(涉及SEQ ID No. 4的編號)具有一個或多個以下氨基酸，即 His (205)、Ser (248)、Asn (263)、Gln (287)、His (288)、Tyr (317)、Gln (354)、Phe (367)、Glu (369)、Gly (380)和 Asn (383)。在其他實施方式中，本發(fā)明涉及本文命名為“本發(fā)明的HPro蛋白質(zhì)”或“來自分離群ro03041的紅球菌HPro蛋白質(zhì)”的HPTO蛋白質(zhì)，所述HPTO蛋白質(zhì)是與SEQ ID NO. 4從第2位至第401位氨基酸的氨基酸序列，特別地與SEQ ID NO. 4、5、6、7中的任一個，優(yōu)選地SEQ ID NO. 6的氨基酸序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%的氨基酸序列同一性的HPH)蛋白質(zhì)，并且在表(i)第2列給出的各自的位置的原有氨基酸可以被表(i)第3列列出的任何氨基酸替換。表I在SEQ ID 在 SEQ IDNo. 4 中的 No. 4 中
權(quán)利要求
1.包含與可在植物中表達(dá)的啟動子有效連接的編碼序列的嵌合基因，其特征在于編碼序列包含編碼紅球菌屬(Rhodococcus)羥苯基丙酮酸雙加氧酶(HPPD)蛋白質(zhì)，或與紅球菌屬HPro蛋白質(zhì)具有至少80%的序列同一性的蛋白質(zhì)的核酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求ι的嵌合基因，其特征在于HPro蛋白質(zhì)是紅球菌屬某種HPro蛋白質(zhì)或與紅球菌屬某種HPro蛋白質(zhì)具有至少80%序列同一性的蛋白質(zhì)。
3.權(quán)利要求I或2的嵌合基因，其中可以通過使用與SEQID No. I或SEQ ID No. 15的DNA雜交的至少20個核苷酸的引物或探針從紅球菌屬DNA獲得編碼所述蛋白質(zhì)的DNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求I至3任一項的嵌合基因，其特征在于所述嵌合基因編碼包含SEQIDNo. 4從第2位氨基酸至第401位氨基酸或SEQ ID No. 18從第2位氨基酸至第402位氨基酸的氨基酸序列的HPH)蛋白質(zhì)，或者與SEQ ID No. 4從第2位氨基酸至第401位氨基酸、SEQ ID No. 18從第2位氨基酸至第402位氨基酸的氨基酸序列具有至少80%序列同一性的蛋白質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求I至4任一項的嵌合基因，其特征在于所述嵌合基因編碼HPro蛋白質(zhì)序列并且包含SEQ ID No. 3從第400位核苷酸至第1602位核苷酸的核苷酸序列，或SEQ IDNo. 17從第400位核苷酸至第1605位核苷酸的核苷酸序列，或者在嚴(yán)格雜交條件下與此類序列雜交的DNA。
6.根據(jù)權(quán)利要求I至5的嵌合基因，其特征在于所述嵌合基因在HPH)編碼序列下游包含編碼在植物中有活性的轉(zhuǎn)運肽的核酸序列，使得轉(zhuǎn)運肽/HPro融合蛋白質(zhì)被所述嵌合基因編碼。
7.包含根據(jù)權(quán)利要求I至6任一項的至少一個嵌合基因的載體。
8.植物細(xì)胞、植物部分、植物或種子，其特征在于其包含根據(jù)權(quán)利要求I至7任一項的嵌合基因。
9.權(quán)利要求8所述的植物細(xì)胞、植物部分、植物或種子，其也包含編碼PDH酶的嵌合基因。
10.權(quán)利要求8或9所述的植物細(xì)胞、植物部分、植物或種子，還包含賦予對生長調(diào)節(jié)物，優(yōu)選地對2，4-D或麥草畏(dicamba)，和/或抑制乙酰乳酸合酶(ALS)、EPSP合酶(EPSPS)和/或谷氨酰胺合酶(GS)的除草劑耐受的一種或多種嵌合基因。
11.獲得對HPH)抑制劑型除草劑耐受的植物的方法，其特征在于將根據(jù)權(quán)利要求I至6之一的嵌合基因引入所述植物。
12.在含有或待種植根據(jù)權(quán)利要求8、9或10的植物或種子的區(qū)域或田地中控制雜草的方法，所述方法包括向所述區(qū)域或田地使用對所述雜草是毒性的劑量的HPH)抑制劑型除草劑，而不顯著地影響根據(jù)權(quán)利要求8、9或10的種子或植物。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的控制雜草的方法，其特征在于HPH)抑制劑選自異$惡氟草(isoxafIutole)、環(huán)橫酮(tembotrione)、甲基橫草酮(mesotrione)、橫草酮(sulcotrione)、pyrasulfotole、苯卩比唑草酮(topramezone)、2_ 氰基-3-環(huán)丙基 _1_ (2_S02CH3_4_CF3 苯基)丙燒 _1，3_ _■麗和 2_ 氛基 _3_ 環(huán)丙基-I- (2_S02CH3_4_2，3C12苯基)丙燒_1，3_ 二酮、雙環(huán)卩比喃酮(bicyclopyrone)、苯并雙環(huán)酮(benzobicyclon)、莊無忌(tefuryltrione)、二酮臆(diketonitrile)和節(jié)草唑(pyrazoxyfen)。
14.獲得油或膳食的方法，包括種植根據(jù)權(quán)利要求8、9或10的植物，任選地用HPH)抑制劑型除草劑處理此類植物，收獲種粒并碾磨種粒以制造膳食并任選地提取油。
15.紅球菌屬HPro或與紅球菌屬HPro具有至少75%序列同一性的HPro使植物對HPro抑制劑型除草劑耐受的用途。
16.權(quán)利要求15的用途，其中HPro抑制劑型除草劑選自異’惡氟草、環(huán)磺酮、甲基磺草酮、磺草酮、pyrasulfotole、苯批唑草酮、2-氰基_3_環(huán)丙基-I-(2-S02CH3-4_CF3苯基)丙燒_1，3_ 二麗和2_氛基_3_環(huán)丙基-I-(2-S02CH3-4_2, 3C12苯基)丙燒_1，3- 二麗、雙環(huán)吡喃酮、苯并雙環(huán)酮、莊無忌、二酮腈和芐草唑。
全文摘要
本發(fā)明涉及從屬于紅球菌屬(Rhodococcus)的細(xì)菌獲得的編碼羥苯基丙酮酸雙加氧酶(EC 1.13.11.27，本文簡稱為HPPD)的核酸序列及其所編碼的蛋白質(zhì)，包含所述核酸序列的嵌合基因，以及所述核酸序列、蛋白質(zhì)或嵌合基因在獲得對HPPD除草劑耐受的植物中的用途。
文檔編號C12N9/02GK102869769SQ201080064547
公開日2013年1月9日 申請日期2010年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月23日
發(fā)明者F·波雷, B·拉博爾, N·克尼特爾-奧特勒本, G·朗格, A·舒爾茨, R·海因 申請人:拜爾知識產(chǎn)權(quán)有限公司