專利名稱：月季eIF5A基因的編碼序列及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種在月季中表達的真核起始因子家族的 e/i^4基因的核苷酸編碼序列、包含上述基因的重組表達載體、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞以及轉(zhuǎn) 基因植株。本發(fā)明還公開了"尸5j基因在提高植物非生物脅迫抗性方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物在自然生長環(huán)境下會隨著環(huán)境的變化而細胞內(nèi)出現(xiàn)相應(yīng)的調(diào)節(jié)機制以幫助其適 應(yīng)環(huán)境，當環(huán)境的變化超出植物自身的調(diào)節(jié)范圍便可稱為環(huán)境脅迫，也叫非生物脅迫。常 見的非生物脅迫有高低溫脅迫，干旱滲透脅迫，氧化脅迫以及重金屬鹽脅迫等。因此對植 物細胞內(nèi)響應(yīng)環(huán)境脅迫機制的研究對于提高植物非生物脅的迫抗性非常有意義。
月季(i awA/朋ra^)是屬于被子植物木蘭岡薔薇科的一類雙子葉植物，是全球應(yīng)用 范圍最廣的觀賞性花卉之一，因此也被稱為"花中皇后"。月季的最適生長溫度為22-25'C， 夏季高溫對開花不利。如夏季高溫持續(xù)3(TC以上，則多數(shù)品種開花減少，品質(zhì)降低，進入 半休狀態(tài)。本研究正是因2003年在上海植物園觀察到大多數(shù)月季品種夏季的持續(xù)高溫 G5。C以上一個多月)下進入半休眠期，而有一個品種"曼哈姆宮殿"則依然花開如初，因 此將該品種與對照月季品種"新十全十美"一起做了高溫處理下的雙向電泳，發(fā)現(xiàn)高溫處理 下的"曼哈姆宮殿"細胞內(nèi)有一種蛋白質(zhì)表達量上升，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)它就是真核起始因子5A (elF5A)。
真核起始因子是一類參與細胞內(nèi)氨基酸翻譯過程的高度保守性的蛋白質(zhì)(Gordon, E. D.etal. 1987)。真核起始因子5A (dF5A)是在多肽翻譯的延伸階段所需的一類蛋白因子， 是目前發(fā)現(xiàn)的唯一一種含有吡咯賴氨酸hypusine (第22號特殊氨基酸)的蛋白質(zhì)(Cooper, H. L. etal. 1983， Park, M. H. et al. 1984， 1993)。吡咯賴氨酸的形成是通過對未成熟elF5A 多肽的翻譯后修飾來完成的。該修飾共分兩步，分別由脫氧吡咯賴氨酸合酶(DHS)與脫 氧吡咯賴氨酸羥化酶(DHH)兩個酶參與將elF5A多肽的第50位左右賴氨酸修飾成吡咯 賴氨酸(Wolff, E. C. et al. 19卯，H謹uske-Abel， H. M. et al. 1994， Shi， X. P. et al. 1996)。
對elF5A基因的研究最早開始于1990年代，但至今對它的研究大多都集中在動物和 真菌領(lǐng)域，對植物中該基因的研究甚少。目前已經(jīng)克隆該基因的作物有紫花苜蓿，煙草， 玉米，番茄，水稻和擬南芥，但真正對該基因功能研究較多的物種只有水稻和擬南芥(Pay， A. etal. 1991， Chamot， D. & Kuhlemeier， C. 1992， Dresselhaus， T. et al. 1999， Requejo，R. &Tena， M. 2006， Wang, T. W. et al. 2001 ， Mehta， A. M. et al. 1994， Wang， T. W. et al. 2003)。例如，在水稻中發(fā)現(xiàn)OselF5A-l和OseIF5A-2可能和鹽脅迫和重金屬脅迫有 關(guān)(Chou， W. C. et al. 2004);擬南芥中共有三個elF5A同源基因，其中AteIF5A-l在木 質(zhì)部發(fā)育過程起重要作用(Liu， Z. etal. 2008) ， AtelF5A-2則是細胞生長和衰老的重要 調(diào)控因子(Feng， H. etal. 2007， H叩kins， M. T. et al. 2008)。然而，對植物中elF5A 功能的研究才剛開始，該家族的基因在植物中的其他很多功能還有待發(fā)現(xiàn)。
本實驗室通過前期對兩個不同耐熱性的月季品種("曼哈姆宮殿"和"新十全十美")高 溫處理3小時后進行雙向電泳，發(fā)現(xiàn)耐熱品種"曼海姆宮殿"在高溫下(38°C) elF5A蛋白 表達量遠遠高于非耐熱品種"新十全十美"以及常溫下的兩個品種，因此初步認為此蛋白是 耐熱品種月季對環(huán)境響應(yīng)的體現(xiàn)。為了證明如上的推論，本研究以耐熱型月季品種"曼海姆 宮殿"為材料，釣取其e/Z^4基因，并設(shè)計特異引物檢測該基因在月季中的表達模式，發(fā)現(xiàn) 該基因在高溫，氧化和滲透脅迫下都有更高的表達。于是將該基因轉(zhuǎn)入模式植物擬南芥， 經(jīng)過實驗發(fā)現(xiàn)含該基因的轉(zhuǎn)基因植株大大提高了對高溫，氧化和滲透三種脅迫的抗性。本 研究為提高月季等觀賞或應(yīng)用性植物的非生物脅迫抗性以及研究其在逆境中分子與生理 方面的機制奠定了基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于獲得一種從月季中克隆出的e/F5^基因，其編碼序列以及其應(yīng)用。
本發(fā)明提供了一種新的月季基因，記為i ce/F5J，已注冊于GenBank/EMBL/DDBJ， 登陸號為EF177192。 i ce/KM為具有特定序列的DNA分子，得到的表達序列全長765bp， 包含一個480bp的開放閱讀框(ORF) (l-480bp)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.l所示。
本發(fā)明提供了上述基因編碼翻譯出的蛋白質(zhì)分子，具有159個氨基酸殘基，其氨基酸 序列如SEQ ID N0.2所示。
本發(fā)明提供了用于獲取月季樣品中i "/E"基因的一對核苷酸引物。該引物根據(jù) i ce/i^4基因編碼序列兩端非保守區(qū)域設(shè)計。具體的引物序列如SEQ IDN0.3所示。
本發(fā)明提供了用于分析i ce/F5」基因在月季中表達模式的一對核苷酸引物。該引物根 據(jù)i ce/KL4基因的ORF的5'端和3'-UTR非保守區(qū)域設(shè)計。具體的引物序列如SEQ ID N0.4 所示。
本發(fā)明提供了一種含有上述i ce/F5J基因的編碼序列的植物表達載體PHB載體。該 載體可以轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，然后侵染擬南芥等植物，完成轉(zhuǎn)基因過程。
本發(fā)明提供了幾種含有上述i ce/F5乂基因的編碼序列的基因工程宿主細胞，具體為 含有PHB載體的大腸桿菌DH5a菌株和含有PHB載體的農(nóng)桿菌GV3101菌株本發(fā)明還提供了一種基因組中含有Aw/i^4基因編碼序列的轉(zhuǎn)基因擬南芥純系植株。 具體為兩類 一是組成型過量表達該基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥純系植株，該類植株可以比正常 野生型植株更耐高溫，氧化和滲透脅迫；二是組成型表達反義插入的i ce/F^4基因編碼序 列的轉(zhuǎn)基因擬南芥純系植株，該類植株比正常野生型植株更不耐高溫，氧化和滲透脅迫。


圖l RcelF5A氨基酸序列的比對。用軟件Clustal X對RcelF5A和其他已經(jīng)報道的植
物dF5A氨基酸序列進行比對分析。RC:月季；At:擬南芥；Ms:紫花苜蓿；Nt:煙草； Os:水稻；Sl:番茄；Zm:玉米。該圖結(jié)果說明了 elF5A家族高度保守(同源性在82%-96% 之間)，以上序列的GenBank登錄號分別為RcelF5A (EF177192)， AtelF5A-l (NM—101261)，AtelF5A-2 (NM一102425)，AtelF5A扁3 (NM一105608)， MselF5A (X59441)' NelF5A-l (X63541)， NelF-5A2 (X63542),OselF5A-l (AF094773)， OselF5A-2 (AJ312906)， SlelF5A-l (AF296083)， SlelF5A-2 (AF296084)， SlelF5A-3 (AF296085)， SlelF5A-4 (AF296086)， ZmelF5A (NM一OOl 112080)。
圖2 RcelF5A氨基酸序列的聚類分析。用軟件Mega 3對RcelF5A和其他已經(jīng)報道的
植物dF5A氨基酸序列進行系統(tǒng)進化分析。Rc:月季；At:擬南芥；Ms:紫花苜蓿；Nt: 煙草；OS:水稻；Sl:番茄；Zm:玉米。該圖結(jié)果說明了月季RcelF5A與紫花苜蓿和煙
草的elF5A在進化上更同源，而與擬南芥和水稻等的elF5A在進化距離上更遠。
圖3 7 "/F5X在月季中表達模式和轉(zhuǎn)基因擬南芥陽性植株分子鑒定的RT-PCR分析。
A，月季樣品在各種處理脅迫3小時下的表達模式。該圖說明在高溫G8'C)，氧化(&02)
和滲透(Mannitol)三種脅迫下i ce/F5J的表達量上升，而其他幾種脅迫下(干旱脅迫-PEG，
鹽脅迫-NaCl，鈉離子毒性脅迫-LiCl和重金屬脅迫-CdCl2)則表達量變化不明顯。B，反
轉(zhuǎn)i ce/F5X的擬南芥株系A(chǔ)4的分子鑒定，可以看到該植株內(nèi)的三個內(nèi)源J"/F5^的表達
量都降低了，說明i ce/FX4與內(nèi)源Ae//^4同源性高，因此相互結(jié)合沉默內(nèi)源基因的表達。
C，過表達i ce/i^4的兩個轉(zhuǎn)基因擬南芥株系S17和S21的分子鑒定，可以看出兩個轉(zhuǎn)基
因植株都有外源目的基因的表達，且S17的表達量比S21更高。
圖4轉(zhuǎn)基因i "/F5^擬南芥的高溫處理。A4:反轉(zhuǎn)i ce/F5J的擬南芥株系；WT:野
生型擬南芥；S17， S21:過表達i ce/7^4轉(zhuǎn)基因擬南芥株系。該圖可明顯看出經(jīng)過45'C高
溫處理一天后，A4和WT都已經(jīng)嚴重黃化(尤其是A4)，而S17， S21則所受影響不大(尤
其是S17)，說明過表達i ce/F5J能提高轉(zhuǎn)基因植株的耐熱性而反轉(zhuǎn)i ce/F^4則會降低轉(zhuǎn)基
因植株的耐熱性，進一步說明^f"F5J也同脅迫相關(guān)。
圖5轉(zhuǎn)基因擬南芥高溫處理后的生理指標測定。植株經(jīng) 溫45'C處理24小時后的相對蓮座葉鮮重值。圖6轉(zhuǎn)基因擬南芥高溫處理后的生理指標測定。植株經(jīng)高溫45'C處理24小時后的相 對電導(dǎo)率值。圖7轉(zhuǎn)基因擬南芥高溫處理后的生理指標測定。植株經(jīng)高溫45'C處理24小時并恢復(fù) 生長2周后的相對單株果夾數(shù)。圖8轉(zhuǎn)基因擬南芥高溫處理后的生理指標測定。植株經(jīng)高溫45'C處理24小時并恢復(fù) 生長2周后的相對單株果夾重。圖5-圖8的生理指標結(jié)果進一步證明圖4所說的結(jié)論。圖9轉(zhuǎn)基因擬南芥的氧化脅迫處理。MS培養(yǎng)皿氧化脅迫處理后的相對成活率。 圖IO轉(zhuǎn)基因擬南芥的氧化脅迫處理。植株氧化脅迫處理后的相對電導(dǎo)率值。 圖11轉(zhuǎn)基因擬南芥的氧化脅迫處理。植株氧化脅迫處理后的相對SOD (超氧化物岐 化酶)活性值。圖9-圖11可證明過表達i "/尸5」能提高轉(zhuǎn)基因植株的氧化脅迫抗性而反轉(zhuǎn)7 ce/FX4則會降低轉(zhuǎn)基因植株的氧化脅迫抗性。圖12轉(zhuǎn)基因擬南芥的滲透脅迫處理。MS培養(yǎng)皿滲透脅迫處理后的相對根長。圖13轉(zhuǎn)基因擬南芥的氧化脅迫處理。植株滲透脅迫處理后的相對蓮座葉鮮重。圖14轉(zhuǎn)基因擬南芥的氧化脅迫處理。植株滲透脅迫處理后的相對脯氨酸含量。圖12-圖14可證明過表達W"/fX4能提高轉(zhuǎn)基因植株的滲透脅迫抗性而反轉(zhuǎn)i ce/F5J則會降低轉(zhuǎn)基因植株的滲透脅迫抗性。
具體實施方式
實施例1月季elF5A基因的克隆1. 月季(i (X^Cm^)品種"曼哈姆宮殿"和"新十全十美"來自上海植物園；生長條 件為光周期16h/8h (L/D)， 22-23。C。2. 植物RNA的提取是用天澤基因工程有限公司的"Plant RNAout"試劑盒，反轉(zhuǎn)錄的 完成是用TaKaRa公司的"PrimeScriptTM RT Reagent"試劑盒。3. 以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA鏈為模板，用引物(SEQ ID N0.3)來PCR獲得i "/F5乂 的ORF，然后連接入TaKaRa公司的pMD18-T載體測序；再以TaKaRa公司的"3'-Fu11 RACECoreSet"試劑盒獲得i ce/FW的3'-UTR，同樣連入pMD18-T載體測序，最終獲得 全長cDNA (SEQIDNO.l)。實施例2月季i ce/i^4基因的表達模式分析土中生長一個月大的月季苗用以下不同方式處理38'C高溫處理3小時，H202(20mM)、甘露醇Mannitol (500mM)、聚乙二醇(PEG)-8000 (20%)、 NaCl (200mM)、 LiCl (30mM)和CdCl2 (50pM)以上溶液全部分別倒灌處理3小時。分別取樣提RNA(方法同實施例l)，以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA鏈為模板，用根據(jù)3'-UTR序列設(shè)計的特異引 物(SEQIDN0.4)來PCR分析i ce/F5J基因的表達模式。實施例3i ce/F5X基因植物表達載體的構(gòu)建，轉(zhuǎn)基因及轉(zhuǎn)基因擬南芥分子鑒定1. 將7 ce/i^4的ORF序列5'端加上力al限制酶切位點及3'端加上^/cI酶切位 點，然后以反義方式連入植物表達載體pHB;同時將i ce/F^4的ORF序列3'端加上I限制酶切位點及5'端加上&cl酶切位點，以正義方式連入植物表達載體pHB。2. 將兩類重組載體以凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，再用浸花法侵染野生型擬南芥，收 獲TO代種子，在潮霉素MS培養(yǎng)皿上篩選出陽性植株Tl代，然后移入土中獲得T2代種 子，繼續(xù)在潮霉素MS培養(yǎng)皿上篩選出能全部成活的純合株系，即用于實驗處理的T3代 轉(zhuǎn)基因植株。3. 選取兩個正義轉(zhuǎn)基因i ce/F5J純合株系S17和S21和一個反義轉(zhuǎn)基因i ce/F5J純 合株系A(chǔ)4，經(jīng)過RT-PCR的分子鑒定，證實為含有外源目的基因表達的植株(圖3B， C)。實施例4轉(zhuǎn)基因擬南芥各種脅迫處理方法1. 高溫處理 一個月大的擬南芥苗45'C高溫處理24h，拍照，測蓮座葉鮮重和電導(dǎo) 率；剩下的實驗組恢復(fù)生長兩周后計算單株果夾數(shù)和果夾重。結(jié)果見圖7， 8。2. 氧化脅迫處理a) MS培養(yǎng)皿上生長4d的苗移入含20mM H202的新培養(yǎng)皿垂直 培養(yǎng)，3d后拍照并計算成活率；b) —個月大的擬南芥苗用20mMH2O2溶液倒灌處理5d 后測蓮座葉的電導(dǎo)率和SOD (超氧化物岐化酶)活性值。結(jié)果見圖9， 10， 11。3. 滲透脅迫處理a) MS培養(yǎng)皿上生長4天的苗移入含500mMMannito1的新培養(yǎng) 皿垂直培養(yǎng)，7d后拍照并計算相對根長；b) —個月大的擬南芥苗用500mM Mannitol溶 液倒灌處理18h后測蓮座葉鮮重和脯氨酸含量。結(jié)果見圖12， 13， 14。實施例5各種生理指標測定方法1.電導(dǎo)率的測定取擬南芥蓮座葉片，用打孔器打出三個圓孔，放入L5ml的 去離子水中，搖床上輕搖3h，用電導(dǎo)率儀測電導(dǎo)率值；測完再沸水水浴10min,冷卻至室 溫，再測電導(dǎo)率值。前者除以后者獲得獲得最終的電導(dǎo)率值。2.脯氨酸含量測定取0.1g蓮座葉，加入5ml 3%磺基水楊酸，沸水水浴10min,冷 卻后靜置。吸取2ml提取液，加入2ml冰醋酸、2ml酸性茚三酮，沸水水浴30min。冷卻 后加入4ml甲苯，搖蕩30s，靜置片刻，吸上清，3000rpm離心5min。以甲苯為空白對照， 于520nm下比色，得吸光度。與對照組相比獲得相對脯氨酸含量值。葉片于預(yù)冷的研缽中，力niml預(yù) 冷的磷酸緩沖液在冰上研磨成漿，再加4ml磷酸緩沖液，混勻，吸取其中1.5-2ml， 1000rpm 低溫離心20min，取上清。顯色反應(yīng)3ml反應(yīng)液中試劑用量ml終濃度50mM磷酸緩沖液(pH7.8)1.5130mM甲硫氨酸溶液0.313mM750|aM氮藍四唑(NBT)溶液0.375 pM100 fiM EDTA-Na2溶液0.31020 核黃素溶液0.32 (iM酶液0.05蒸餾水0.25總體積3混勻后，于4000 lux日光下反應(yīng)20min (溫度高時縮短光照時間)，暗保存；以不加酶 液的對照管作空白于560nm處測定吸光度。與對照組相比獲得相對SOD活性值。參考文獻Chamot， D. and C. 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BiochimBiophys Acta 1310(1): 119-26.序列表SEQ ID NO.l:DDNLLTQIKDGFAEGKDLVVSVMSAMGEEQICALKDIGPKSEQ ID NO.3:正義鏈引物5' - ATGTCGG ATG AGGAGC ATC A-3' 反義鏈引物5'-TTACTTGGGGCCAATATCCTT-3'SEQ ID NO.4:正義鏈引物5，-ATGTCGGATGAGGAGCATCA-3， 反義鏈引物5 ， - ATGGTCC AGAC AGTA A AC AGAA-3 ，
權(quán)利要求
1.一種月季eIF5A基因的核苷酸序列，其特征為DNA序列全長765bp，其中含有一個480bp的開放閱讀框，其核苷酸序列為SEQ ID NO.1。
2. —種如權(quán)利要求1所述的e/i^4基因所編碼的蛋白質(zhì)分子，其特征為長159個氨 基酸殘基，其氨基酸序列為SEQIDN0.2。
3. —種用于獲取月季樣品中e/KM基因的引物序列，其特征在于根據(jù)權(quán)利要求1所 述e/FW基因ORP兩端非保守區(qū)域設(shè)計，其序列為SEQ ID N0.3。
4. 一種用于分析基因在月季中表達模式的引物序列，其特征在于根據(jù)權(quán)利要 求1所述基因的ORF的5'端和3，-UTR非保守區(qū)域設(shè)計，其序列為SEQ ID N0.4。
5. —種含有如權(quán)利要求1所述基因的編碼序列的植物表達載體PHB，其特征在于載 體PHB中含有e/F5J基因的ORF序列。
6. —種基因工程宿主細胞，其特征在于如含有權(quán)利要求5所述的載體。
7. 如權(quán)利要求2所述的e/P5J基因所編碼的蛋白質(zhì)在提高植物非生物脅迫抗性方面 的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種月季eIF5A基因的編碼序列及其應(yīng)用。本發(fā)明包括提供月季eIF5A基因的編碼序列及其氨基酸序列；提供包含編碼序列的重組植物表達載體和轉(zhuǎn)基因純系植株；提供獲得此基因的核苷酸引物序列，以及對此基因的內(nèi)源表達模式進行分析鑒定的引物序列和方法。本發(fā)明所述基因翻譯的蛋白質(zhì)可用于提高植物的非生物脅迫(高溫，氧化和滲透脅迫)的抗性。
文檔編號C12N15/29GK101643735SQ200910056139
公開日2010年2月10日 申請日期2009年8月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月7日
發(fā)明者張佰隆, 徐健遙, 鳳 明 申請人:復(fù)旦大學(xué)