專利名稱：馬尾松病死木中松材線蟲的特異性檢測(cè)引物、檢測(cè)方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及松材線蟲的基因?qū)W檢測(cè)，具體涉及一種馬尾松病死木 中松材線蟲的特異性檢測(cè)引物、檢測(cè)方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
松材線蟲病是重要的檢疫性病害，目前松材線蟲病的全國(guó)發(fā)生面
積達(dá)8.7萬hm2，累計(jì)枯死松樹3500多萬株，疫區(qū)疫木不僅不能正常利 用，而且影響其它農(nóng)副產(chǎn)品和林產(chǎn)品的流通，造成直接經(jīng)濟(jì)損失25 億元，間接經(jīng)濟(jì)損失達(dá)250億元，生態(tài)環(huán)境、外貿(mào)出口和社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā) 展受到嚴(yán)重影響，己被我國(guó)列入對(duì)內(nèi)、對(duì)外的檢疫對(duì)象。
關(guān)于松木中松材線蟲的鑒定，目前常用的方法有松材線蟲的形 態(tài)學(xué)鑒定方法、松材線蟲蛋白質(zhì)電泳方法、松材線蟲酶聯(lián)免疫吸附法、 松材線蟲蛋白質(zhì)印記法、松材線蟲DNA雜交技術(shù)、松材線蟲RAPD 技術(shù)和松材線蟲巢式PCR鑒定等，但這些鑒定方法存在以下缺陷
1、松材線蟲形態(tài)學(xué)鑒定簡(jiǎn)便易行，是現(xiàn)行線蟲種類鑒定的常規(guī) 方法，但是線蟲形態(tài)微小，需專業(yè)人士在顯微鏡下觀察，分離結(jié)果難 確定，而且松材線蟲組的變異傘滑刃線蟲、錐尾傘滑刃線蟲、科麗姆 傘滑刃線蟲和擬松材線蟲等具有和松材線蟲相似的形態(tài)，這也使得形 態(tài)學(xué)鑒定比較困難，此外植物感病前期外觀癥狀不明顯，這也使得松 材線蟲病早期診斷困難，發(fā)病的松木中并不是總能分離到松材線蟲成 蟲，且松材線蟲多以幼蟲形式存在，培養(yǎng)出成蟲需要時(shí)間，這些都導(dǎo)致疑似病例得不到及時(shí)確診，延誤了最佳防治時(shí)期；
2、 蛋白質(zhì)電泳分析是較早應(yīng)用于線蟲分類學(xué)研究的一項(xiàng)分子技
術(shù)，不少學(xué)者對(duì)松材線蟲和擬松材線蟲株系進(jìn)行了同工酶差異的研 究，然而同工酶技術(shù)要求大量的樣本才能獲得清晰的電泳圖譜，且蛋 白質(zhì)的表達(dá)與環(huán)境以及線蟲的生長(zhǎng)發(fā)育階段有關(guān)，到目前為止，尚未
有一種同工酶被公認(rèn)為可以明確地區(qū)分松材線蟲與擬松材線蟲；
3、 DNA雜交技術(shù)雖然可以準(zhǔn)確快速地鑒定松材線蟲但是該技術(shù) 難度較大，費(fèi)用高，且具有放射性危害，不利于大規(guī)模推廣；
4、 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA技術(shù)(RAPD)雖然具有快速、簡(jiǎn)便、靈 敏且無需放射性同位素標(biāo)記等優(yōu)點(diǎn)，但是也存在圖譜比較復(fù)雜，重復(fù) 性和可比性差等缺點(diǎn)，在鑒定松材線蟲上存在一定的局限性。
PCR技術(shù)的應(yīng)用，突破了DNA分子鑒定所受DNA量的限制，大 大提高了檢測(cè)的靈敏度。Hoyer a/ (1998 Hoyer U, Burgermeister W， Braasch H. Identification of ^raqp/ze/ewc/2z^ species(Nematode, Aphelenchoididae) on the basic of amplified ribosomal DNA(ITS國(guó)RFLP). Nachrichtenblatt des Deutschen Pflanzenschutzdienstes, 1998, 50(11): 273-277)建立了區(qū)分5種線蟲的ITS-PCR-RFLP技術(shù)，并成功地檢測(cè) 了松材線蟲和擬松材線蟲，用單條活線蟲建立了快速、靈敏的松材線 蟲診斷方法；張立海(2001張立海，廖金鈴，馮志新.松材線蟲rDNA 的測(cè)序和PCRSSCP分析.植物病理學(xué)報(bào)，2001， 31 (1): 84-89)建立 的PCR-SSCP技術(shù)，可將松材線蟲和擬松材線蟲明顯區(qū)分開。
這些PCR技術(shù)是在種級(jí)水平上區(qū)分松材線蟲和擬松材線蟲的簡(jiǎn)便快速方法，具有重復(fù)性和穩(wěn)定性好、可靠性較高等優(yōu)點(diǎn)，但是需要 將線蟲從木頭中分離出來之后，進(jìn)行鑒定。
直接檢測(cè)出松木中的松材線蟲是人們一直在研究的課題。白鋼等 (2005白鋼，李海燕，馬洪周等.疫木切面上松材線蟲抗原的免疫學(xué)
檢測(cè)方法.林業(yè)科學(xué)，2005， 41 (6) : 101-104)利用抗松材線蟲血清， 建立在疫木切面上直接進(jìn)行免疫組化染色檢測(cè)松材線蟲抗原的方法， 但是操作復(fù)雜，以及抗體特異性等因素給實(shí)際應(yīng)用帶來了一定的困 難；王延輝(2007王延輝.擬松材線蟲致病性及檢測(cè)技術(shù)研究.廣州 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.30-36)通過設(shè)計(jì)組合外圍通用引物和特異性引 物，運(yùn)用巢式PCR技術(shù)從松樹和線蟲的混合DNA中，有效的檢測(cè)出 松材線蟲和擬松材線蟲，但是步驟比較繁瑣且增加許多不確定的因素, 尚處于研究開發(fā)階段。
鑒于松材線蟲病是我國(guó)的頭號(hào)森林病害，而馬尾松又在我國(guó)廣泛 分布，因此對(duì)馬尾松的松材線蟲病的研究迫在眉睫。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，提供一種馬尾松病 死木中松材線蟲的特異性檢測(cè)引物，該引物對(duì)松材線蟲具有高特異 性，可用于PCR方法檢測(cè)馬尾松病死木中的松材線蟲。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種利用上述特異性檢測(cè)引物對(duì)馬 尾松病死木中松材線蟲進(jìn)行高效快速PCR檢測(cè)的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述特異性檢測(cè)引物的應(yīng)用。
本發(fā)明的上述目的是通過如下方案予以實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明人通過對(duì)比松材線蟲、擬松材線蟲、馬尾松松木的已公開 序列，設(shè)計(jì)并篩選出僅對(duì)馬尾松病死木中松材線蟲具有高特異性的引 物，通過PCP擴(kuò)增檢測(cè)馬尾松病死木中松材線蟲。
本發(fā)明的馬尾松病死木中松材線蟲的特異性檢測(cè)引物，其上游引
物的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示，下游引物的核苷酸序列如 SEQIDNO: 2所示。
針對(duì)馬尾松病死木中松材線蟲種類多，將松材線蟲從松木中分離 出來難度大，而且松木本身成分復(fù)雜，從而導(dǎo)致目的DNA模板制備 困難的現(xiàn)狀，本發(fā)明還提供一種無需分離松材線蟲，直接用馬尾松病 死木制備DNA模板，可用于后期馬尾松病死木中松材線蟲的PCR檢 測(cè)，該DNA模板的制備方法主要是采用WLB裂解液和蛋白酶K對(duì) 馬尾松病死木進(jìn)行兩次裂解，具體包括如下步驟將馬尾松病死木經(jīng) 液氮研磨后加入WLB裂解液，水浴中完成溫度循環(huán)95"C15min， 65'C2min，重復(fù)溫度循環(huán)一次，然后加入蛋白酶K，水浴中65°Clh， 95°Cl5min，得到DNA裂解液，將該DNA裂解液純化后則可作為 DNA模板用于后續(xù)的PCR擴(kuò)增；所述WLB裂解液的配方為含有 2.5 mmol L" 二硫蘇糖醇(DTT)、 1.125%吐溫-20 (質(zhì)量百分比)、 0.025%明膠(質(zhì)量百分比)、125 mmol I/1 KC1、 25 mmol L" Tris-HCl (pH8.0)和3.75 mmol L-1MgCl2。
上述DNA模板的制備方法中，馬尾松病死木和WLB裂解液以 及蛋白酶K的用量?jī)?yōu)選5mg的馬尾松病死木，采用lOOpl 200pl WLB和8|il l(Hil蛋白酶K (20 mg'mr1)進(jìn)行裂解；優(yōu)選用量為5mg的馬尾松病死木，采用200WWLB和10|_d蛋白酶K(20 mg，ml—1)
進(jìn)行裂解。
上述DNA模板的制備方法中，所述純化可采用純化DNA常用 的3S柱。
一種馬尾松病死木中松材線蟲的特異性檢測(cè)方法，包括如下步
驟
(1) 模板DNA制備采用上述DNA模板制備方法；
(2) 采用上述馬尾松病死木中松材線蟲的特異性檢測(cè)引物，進(jìn)行 常規(guī)PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，通過觀察電 泳結(jié)果中的特異性片段，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)馬尾松病死木中松材線蟲的檢
上述步驟(2)中，為了提高PCR擴(kuò)增效率，本發(fā)明對(duì)PCR擴(kuò) 增反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化
a. PCR擴(kuò)增退火溫度的優(yōu)化退火溫度選擇47°C 、47.6°C 、48.2°C 、 49.4°C、 50.8°C、 52.2°C、 53.7。C、 55.1°C、 56.6°C、 57.8°C、 58.4。C和 59'C的12個(gè)溫度梯度，對(duì)松材線蟲基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，實(shí) 驗(yàn)結(jié)果表明在52.2。C與53.7'C時(shí)的PCR產(chǎn)量最大，因此本發(fā)明優(yōu)選 53"C作為PCR擴(kuò)增的退火溫度；
b. PCR擴(kuò)增體系中鎂離子濃度的優(yōu)化在25pL的PCR擴(kuò)增反應(yīng) 體系中，采取1.5mmolL-1、 2.0mmolL"、 2.5mmolL"、 3.0mmolL"、 3.5 mmolL/1和4.0 mmolU1共6個(gè)梯度的鎂離子濃度，對(duì)松材線蟲基 因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明當(dāng)鎂離子濃度為3.0 mmolL-1時(shí)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)量最大，因此本發(fā)明的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中鎂
離子濃度優(yōu)選3.0 mmolL"。
上述步驟(2)中，PCR擴(kuò)增結(jié)束后，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝 膠電泳，紫外燈下觀察電泳結(jié)果，若在403處出現(xiàn)特異性條帶，則為 陽(yáng)性結(jié)果，說明待測(cè)樣品中，反之則為陰性結(jié)果。
本發(fā)明的馬尾松病死木中松材線蟲的特異性檢測(cè)引物可制備成 快速檢測(cè)試劑盒，從而使得馬尾松病死木中松材線蟲的檢測(cè)更加快 速、便利。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果
1. 本發(fā)明的馬尾松病死木中松材線蟲的特異性檢測(cè)引物對(duì)馬尾 松病死木中的松材線蟲具有高度的特異性，能夠?qū)⑺刹木€蟲與松材線 蟲近緣的線蟲區(qū)分開，能將松材線蟲與馬尾松松木、馬尾松松木中其 他12種線蟲區(qū)分開，還能將松材線蟲與馬尾松松木中常見的真菌和 細(xì)菌區(qū)別開來；
2. 由于松材線蟲病的復(fù)雜性，如何快速、有效地從病木中檢測(cè) 出松材線蟲， 一直是松材線蟲病鑒定的難點(diǎn)，本發(fā)明提供一種無需從 病木中分離松材線蟲，直接對(duì)病木中松材線蟲進(jìn)行PCR擴(kuò)增的方法， 節(jié)省了分離時(shí)間，提高了檢測(cè)效率；
3. 對(duì)PCR技術(shù)來說，引物的涉及和模板的質(zhì)量一直是影響PCR 成功的兩大關(guān)鍵因素，本發(fā)明不但涉及得到針對(duì)馬尾松病死木中的松 材線蟲具有高度特異性的引物，還提供了一種從馬尾松病死木中制備 PCR所需DNA模板的方法，該方法是直接將病木進(jìn)行液氮研磨后，經(jīng)過WLB和蛋白酶K的兩次裂解，用3S柱純化后，得到了可用于 PCR擴(kuò)增的DNA模板，擴(kuò)增效率達(dá)到100%，不但DNA模板的制備 方法比現(xiàn)有方法簡(jiǎn)單，而且模板的質(zhì)量也有很大提高；
4. 本發(fā)明提供的檢測(cè)方法簡(jiǎn)單高效，通過特異性檢測(cè)引物，通過 簡(jiǎn)單的PCR，可方便地檢測(cè)馬尾松病死木中的松材線蟲；
5. 采用本發(fā)明的特異性檢測(cè)引物可制備相應(yīng)檢測(cè)試劑盒，從而使 得檢測(cè)更加簡(jiǎn)單程序化，成本低、方法特異性強(qiáng)，敏感性高，結(jié)果判 定客觀，準(zhǔn)確性高，有利于大規(guī)模推廣；
6. 本發(fā)明對(duì)PCR擴(kuò)增條件進(jìn)行了優(yōu)化，選擇退火溫度為53°C， MgCl2的濃度為3.0 mmolL—1，從而可提高整個(gè)PCR反應(yīng)的特異性， 取得更好的檢測(cè)效果。


圖1為松材線蟲、馬尾松松木和擬松材線蟲的特異性檢測(cè)電泳
其中，M為Marker, 1 3為松材線蟲，4~6為擬松材線蟲，7~8 為馬尾松松木；
圖2為松材線蟲與馬尾松松木中其他12種線蟲的特異性檢測(cè)電 泳其中，M為Marker, 1為松材線蟲，2為擬松材線蟲 ， 3為奇異傘真滑刃線蟲(及a&mms)， 4為小角傘 滑刃線蟲(及coweo/w)， 5為來氏傘滑刃線蟲(及/eo"/)， 6為湖南傘 滑刃線蟲(5./mwa"e"w;s)， 7為畸剌傘滑刃線蟲(及teratos^^/ani)，8為紅松滑刃線蟲Uj^e/ewc/2o/(i^ mw'mosO 9為斯坦納長(zhǎng)尾滑刃線 蟲(5Wm/ra他/"en')， 10為小蓬線蟲(Z)一e"c/m戶arras)， 11為劍 尾齒桿雙胃線蟲(CWor/za6卻/oga他r x一ocaMcfoto ) ， 12為小桿線蟲 (i /2aZ^///6^ w)， 13為寄生小桿屬線蟲(尸arawYoAaZ^/泡w)， CK 為陰性對(duì)照ddH20;
圖3為松材線蟲與馬尾松松木中常見真菌的特異性檢測(cè)電泳圖； 其中，M為Marker, 1為木霉屬真菌(7Hc/zo&rma spp. )， 2為 青霉屬真菌(i^"/cz'〃/wm spp. )， 3為炭疽病屬真菌(Co〃etofn'c/2wm spp.)， 4為擬盤多毛孢屬(Pasto/o/Zo/w^ w)， ck+為松材線蟲，ck-為ddH20;
圖4為松材線蟲與馬尾松松木中常見細(xì)菌的特異性檢測(cè)電泳圖； 其中，M為DNAMaker ， 1為蠟質(zhì)芽孢桿菌(Sac/〃w;y cewus)， 2為解淀粉芽孢桿菌(5ac/腸調(diào)少/。/—咖c/冊(cè))，.3為炭疽芽孢桿菌 (5ac/〃ws aw/Zzracz^), 4為矢旦矢豆芽f包桿菌(5rev/Z ac/〃ws 6rev/s)， 5為 蘇云金芽孢桿菌(5acZ〃ws AwW"g/era^ ) ， 6為熒光假單孢 (i^ewt/om^7770"as^/7worasce"/)， 7為枯草芽孢木干菌(5ac/〃z^ sw6/77/s)， 8為腸桿菌屬(觀)，9為施氏葡萄球菌(5"鄉(xiāng)/^/ococ譜 sa/ raj: /2,'cMS)， 10為微桿菌(M/cra6acfeWww ms7'他ra)， ck+為松材 線蟲，ck-為ddH20;
圖5為DNA模板制備過程中不同配比裂解液裂解擴(kuò)增效果電泳
其中，M為Marker, 1~4為WLB裂解液32|iL與蛋白酶K4)iL，5~8為WLB 100^iL與蛋白酶K8j^L，9 12為WLB 200pL與蛋白酶K
L;
圖6為不同退火溫度對(duì)PCR擴(kuò)增影響電泳其中，M為Marker, 1 12分別是退火溫度為47°C、 47.6°C、
48.2°C、 49.4°C、 50.8°C、 52.2°C、 53.7°C、 55.1。C、 56.6°C、 57.8°C、
58.4。C和59°C;
圖7為鎂離子濃度對(duì)PCR擴(kuò)增體系的影響電泳其中，M為Marker, 1 6分別是鎂離子濃度為1.5mmolL'1、 2.0
mmo11/1、 2.5 mmo11/1、 3.0 mmolL誦1、 3.5 mmolL"禾口 4.0 mmo11/1。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步地描述，但具體實(shí)施例并 不對(duì)本發(fā)明做任何限定。
實(shí)施例l本發(fā)明引物特異性試驗(yàn)
1. 制備引物通過基因合成公司合成馬尾松病死木中松材線蟲的
特異性檢測(cè)引物，其上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO: l所示， 下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO: 2所示。引物放在-20冰箱中 保存。
2. PCR擴(kuò)增
PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系10xPCRbuffer 2.5^1 (Mg2+ free), dNTP(2.5 mmol-I/1) 2pl， Mg2+ (25mmol'L1) 3^1，弓I物P1 (10(iM)禾口 P2 (10)iM)各ljil， TaqDNA聚合酶5U'y10.125^11，模板DNA2pl， 滅菌雙蒸水補(bǔ)充至總體積25^1。
12PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件94"C預(yù)變性3min; 94。C變性45s， 53'C退火 30s， 72。C延伸lmin， 35個(gè)循環(huán)后，最后72'C延伸5min。
3. 馬尾松病松木制備DNA模板
將采回實(shí)驗(yàn)室的病木，分割成底面積為0.5cmx0.5cm、厚度為 0.02cm的薄木片，放入滅菌的1.5mL的離心管中，液氮中做稍許研 磨，后加入200iiLWLB(2.5mmo1 'I/1 DTT， 1.125% Tween20， 0.025 % Gelatin， 125 mmol L-1 KC1， 25 mmol I/1 Tris-HCl (pH 8.0)， 3.75mmo1 L"MgCl2 )，然后在水浴中完成溫度循環(huán)95。Cl5min， 65。C2min，兩個(gè)循環(huán)，加入10pL蛋白酶K (20 mg'mL")，后65。Clh， 95。C15min。裂解后的DNA提取液經(jīng)過3S柱進(jìn)行純化，吸取2pL做 模板。
4. 松材線蟲、馬尾松松木和擬松材線蟲的特異性檢測(cè) 將用現(xiàn)有方法已經(jīng)鑒定的，松材線蟲、擬松材線蟲和健康馬尾松
松木作為檢測(cè)原料，分別制備后續(xù)PCR擴(kuò)增所需模板。
采用上述合成的特異性引物(其上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO: l所示；其下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO: 2所示)， 按照上述PCR擴(kuò)增體系和反應(yīng)條件，分別對(duì)三種材料的DNA進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物一起跑瓊脂糖凝膠電泳，紫外光下觀察電泳結(jié)果， 如圖1所示。
從圖1中可以看出，在約500bp處出現(xiàn)特異性條帶(403bp)而 其余泳道均未出現(xiàn)特異性條帶，由此說明本發(fā)明的特異性引物可以將 松材線蟲與擬松材線蟲以及馬尾松松木區(qū)分開來。5. 松材線蟲與馬尾松松木中其他12種線蟲的特異性檢測(cè) 選擇已知的馬尾松松木中12種線蟲擬松材線蟲(及聽m 加^
、奇異傘真滑刃線蟲(及Wwrara)、小角傘滑刃線蟲(及comeo/w s)、來氏傘滑刃線蟲(及/eow')、湖南傘滑刃線蟲(及/m"fl"m^)、畸 刺傘滑刃線蟲(及terato^/cw/an^)、紅松滑刃線蟲(v4j^e/e"c/zoW^ r m/"cw')、斯坦納長(zhǎng)尾滑刃線蟲(&z'm^ra We/wen')、小蓮線蟲(D〖&/ 戶arvws)、..金U尾齒禾干雙胃線蟲(CWw/^Znii^/ogaWer xi(p/zocaw(i a^s)、小桿線蟲(i /^6o^Wa 和寄生小桿屬線蟲(Paras/tor/za6d 他《sp)。
采用上述合成的特異性引物(其上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO: l所示；其下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO: 2所示)， 按照上述PCR擴(kuò)增體系和反應(yīng)條件，分別對(duì)松材線蟲以及上述12種 線蟲進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物一起跑瓊脂糖凝膠電泳，紫外光下觀 察電泳結(jié)果，如圖2所示。
從圖2中可以看出，只有松材線蟲出現(xiàn)特異性條帶(403bp)，而 其余12種線蟲以及陰性對(duì)照都沒有出現(xiàn)特異性條帶，由此說明本發(fā) 明的特異性引物可以將松材線蟲與馬尾松木中其余12種常見線蟲區(qū) 分開來。
6. 松材線蟲與馬尾松松木中常見真菌、細(xì)菌的特異性檢測(cè) 選擇己知的馬尾松病木中常見的木霉屬真菌、青霉屬真菌、炭疽
病屬真菌和擬盤多毛孢屬真菌等4種真菌，以及蠟質(zhì)芽孢桿菌、解淀 粉芽孢桿菌、炭疽芽孢桿菌、短短芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、熒光假單孢、枯草芽孢桿菌、腸桿菌屬、施氏葡萄球菌和微桿菌等10種 細(xì)菌。
采用上述合成的特異性引物(其上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO: l所示；其下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO: 2所示)， 按照上述PCR擴(kuò)增體系和反應(yīng)條件，分別對(duì)松材線蟲以及上述木霉 屬真菌、青霉屬真菌、炭疽病屬真菌和擬盤多毛孢屬真菌等4種真菌 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物一起跑瓊脂糖凝膠電泳，紫外光下觀察電 泳結(jié)果，如圖3所示。
采用上述合成的特異性引物(其上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO: l所示；其下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO: 2所示)， 按照上述PCR擴(kuò)增體系和反應(yīng)條件，分別對(duì)松材線蟲以及上述蠟質(zhì) 芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、炭疽芽孢桿菌、短短芽孢桿菌、蘇云金 芽孢桿菌、熒光假單孢、枯草芽孢桿菌、腸桿菌屬、施氏葡萄球菌 和微桿菌等IO種細(xì)菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物一起跑瓊脂糖凝膠電 泳，紫外光下觀察電泳結(jié)果，如圖4所示。
從圖3和圖4中可以看出，只有松材線蟲出現(xiàn)特異性條帶 (403bp)，而實(shí)驗(yàn)中的4種真菌和10種細(xì)菌以及陰性對(duì)照都沒有出 現(xiàn)特異性條帶，由此說明本發(fā)明的特異性引物可以將松材線蟲與馬尾 松木常見的真菌、細(xì)菌區(qū)分開來。
由本實(shí)施例的三個(gè)特異性檢測(cè)試驗(yàn)可以看出，本發(fā)明的馬尾松病 死木中松材線蟲的特異性檢測(cè)引物具有很高的特異性，能夠?qū)⑺刹木€ 蟲和馬尾松木、馬尾松木中常見的其他線蟲以及真菌、細(xì)菌區(qū)分開來，從而保證了本發(fā)明檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性和特異性。
實(shí)施例2馬尾松病死木制備DNA模板
本實(shí)施例對(duì)馬尾松病死木制備DNA模板時(shí)，所需要的WLB和 蛋白酶K兩種裂解液的量進(jìn)行一個(gè)優(yōu)化。
采用馬尾松病死木制備DNA模板，若采用2mg的馬尾松病死木 較難擴(kuò)增出目的片段，因此采用5mg的馬尾松病死木進(jìn)行試驗(yàn)。
制備WLB裂解液，配方為含有2.5 mmol 二硫蘇糖醇、1.125 %吐溫-20、 0.025%明膠、125醒olL"KCl、 25 mmol L" Tris畫HCl (pH8.0)和3.75mmolL"MgCl2。
蛋白酶K為市售。
本實(shí)施例采取三種裂解液(O WLB裂解液32pL與蛋白酶K 4jiL; (2) WLB 100^iL與蛋白酶K8^iL; (3) WLB 200pL與蛋白酶K 10pL，將這三種裂解液分別進(jìn)行如下DNA模板制備的操作
將5mg的馬尾松病死木放入滅菌的1.5mL的離心管中，液氮中 做稍許研磨后，加入WLB水浴中完成溫度循環(huán)95'C15min， 65°C2min，兩個(gè)循環(huán)，然后加入蛋白酶K，水浴中65°Clh， 95'Cl5min， 得到DNA裂解液，再經(jīng)3S柱純化后得到所需DNA模板。
將所得到的三種DNA模板，采用實(shí)施例1的特異性引物，PCR 擴(kuò)增體系和擴(kuò)增條件進(jìn)行后續(xù)的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝 膠電泳檢測(cè)，電泳結(jié)果如圖5所示，裂解液配方(2)和(3)都能取 得較好的效果，其中以配方(3)最好，因此本發(fā)明在制備DNA模板 時(shí)，采用100ji1 200ji1WLB和8^d 10pl蛋白酶K (20mgTiir1)進(jìn)行裂解，優(yōu)選200pl WLB和10^1蛋白酶K (20mg'mr1)。 實(shí)施例3 PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化
本實(shí)施例對(duì)PCR擴(kuò)增中退火溫度和鎂離子濃度進(jìn)行優(yōu)化。 l.退火溫度的優(yōu)化
以47。C、47.6。C、48.2。C、49.4。C、 50.8°C、 52.2°C、 53TC、 55.1°C、 56.6°C、 57.8°C、 58.4。C和59。C為溫度梯度，對(duì)松材線蟲基因組DNA 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖6所示，這12個(gè)測(cè)試的溫度都能 擴(kuò)增出清晰的條帶，其中以52.2"C與53.7'C時(shí)的PCR產(chǎn)量最大，因 此本發(fā)明的退火溫度優(yōu)選53 °C 。 2.鎂離子的優(yōu)化
在25pL的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中，采取1.5mmolL'1、 2.0mmolL'1、 2.5 mmolL-1、 3.0 mmolL"、 3.5 mmolU1和4.0 mmolL-1共6個(gè)梯度的 鎂離子濃度，對(duì)松材線蟲基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增結(jié)果 如圖7所示，6個(gè)梯度的鎂離子濃度均有擴(kuò)增條帶，其中，以鎂離子 濃度為3.0 mmolL'1時(shí)產(chǎn)量最大，因此本發(fā)明的鎂離子濃度優(yōu)選3.0 mmolL-1 。
17馬尾松病死木中松材線蟲的特異性檢測(cè)引物、檢測(cè)方法及其應(yīng)用序列表 SEQUENCE LISTING
<110>華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
<120>馬尾松病死木中松材線蟲的特異性檢測(cè)引物、檢測(cè)方法及其應(yīng)用
<130>
<160> 2
<170> Patentln version 3. 5
<210> 1
〈211〉 23
<212〉 DNA <213>人工序列
<400〉 1
ctacgtgctg ttgttgagtt ggc 23
<210> 2
<211> 20
<212> 腿 <213>人工序列
<400> 2
tggtgcctaa cattgcgcga 20
權(quán)利要求
1、一種馬尾松病死木中松材線蟲的特異性檢測(cè)引物，其上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO2所示。
2、 一種馬尾松病死木中松材線蟲的檢測(cè)方法，其特征在于該方 法包括如下步驟(1) 將馬尾松病死木經(jīng)液氮研磨后加入WLB裂解液，水浴中95 'C15min， 65"C2min進(jìn)行溫度循環(huán)，重復(fù)一次溫度循環(huán)后加入蛋白酶 K，水浴中65"Clh， 95°Cl5min，得到DNA裂解液，將該DNA裂解 液純化后則制備得到DNA模板；所述WLB裂解液含有2.5 mmolL" 二硫蘇糖醇、1.125 %吐溫-20、0.025 %明膠、125 mmolL" KC1、25 mmol L" pH 8.0的Tris-HCl和3.75 mmol L-1 MgCl2;(2) 用權(quán)利要求1所述特異性檢測(cè)引物采用常規(guī)PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增；(3) 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，紫外光下觀察特異性擴(kuò)增條 帶，即可實(shí)現(xiàn)馬尾松病死木中松材線蟲的檢測(cè)。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述檢測(cè)方法，其特征在于所述步驟(l)中， 馬尾松病死木、WLB裂解液和蛋白酶K的用量為5mg的馬尾松病 死木采用lOOjil ~200^il的WLB裂解液和8pl l(^l蛋白酶K進(jìn)行裂 解；所述蛋白酶K的濃度為20mg'mr1。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述檢測(cè)方法，其特征在于所述馬尾松病死 木、WLB裂解液和蛋白酶K的用量為5mg的馬尾松病死木采用200pl的WLB和lO(il蛋白酶K進(jìn)行裂解；所述蛋白酶K的濃度為20 mg.mri 。
5、 根據(jù)權(quán)利要求2所述檢測(cè)方法，其特征在于所述步驟(1)中， DNA裂解液的純化采用3S柱。
6、 根據(jù)權(quán)利要求2所述檢測(cè)方法，其特征在于所述步驟(2)中， PCR擴(kuò)增的退火溫度為47°C~59°C。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述檢測(cè)方法，其特征在于所述PCR擴(kuò)增的 退火溫度為53'C。.
8、 根據(jù)權(quán)利要求2所述檢測(cè)方法，其特征在于所述步驟(2)中， PCR擴(kuò)增體系中鎂離子的濃度為1.5mmolL'1 4.0 mmolL—1。
9、 根據(jù)權(quán)利要求8所述檢測(cè)方法，其特征在于所述PCR擴(kuò)增體 系中鎂離子的濃度為3.0mmolU1。
10、 權(quán)利要求1所述馬尾松病死木中松材線蟲的特異性檢測(cè)引物 在制備馬尾松病死木中松材線蟲的快速檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開一種馬尾松病死木中松材線蟲的特異性檢測(cè)引物、檢測(cè)方法及其應(yīng)用，該特異性檢測(cè)引物其上游引物的核苷酸序列如SEQID NO1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO2所示。本發(fā)明的引物能將松材線蟲與馬尾松松木、馬尾松木中其他12種線蟲，以及馬尾松木中常見的4種真菌和10種細(xì)菌區(qū)別開來。本發(fā)明還提供一種無需從病木中分離松材線蟲，直接對(duì)病木中松材線蟲進(jìn)行PCR擴(kuò)增的方法，將病木液氮研磨后，經(jīng)WLB和蛋白酶K兩次裂解，純化后得到PCR擴(kuò)增用DNA模板，擴(kuò)增效率達(dá)到100％，節(jié)省了分離時(shí)間，提高了檢測(cè)效率。本發(fā)明的檢測(cè)方法簡(jiǎn)單高效，準(zhǔn)確性高、特異性高，可制備成試劑盒進(jìn)行大規(guī)模推廣。
文檔編號(hào)C12N15/11GK101586160SQ20091004039
公開日2009年11月25日 申請(qǐng)日期2009年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月19日
發(fā)明者孔祥超, 朱孝偉, 王新榮, 紀(jì)春艷, 胡月清, 賈文慧, 鐘填奎 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)