專利名稱：：一種人血管內(nèi)皮細胞生長抑制因子rhVEGI-192A的重組蛋白的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種人血管內(nèi)皮細胞生長抑制因子rhVEGI-192的重組蛋白的制備方法。
背景技術(shù)：
：血管內(nèi)皮細胞生長抑制因子(VEGI)是最近發(fā)現(xiàn)的一種新生血管抑制因子，主要由血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生。1997年Tan等率先通過篩選人臍靜脈內(nèi)皮細胞cDNA文庫發(fā)現(xiàn)了人VEGI，當時命名為TLI(TNF-likeligand1)。隨后的生物活性研究發(fā)現(xiàn)，VEGI具有明顯抑制內(nèi)皮細胞增殖的作用，并由此而得名。VEGI全長基因為17Kb,由I、II、III、IV四個外顯子和三個內(nèi)含子構(gòu)成。按不同的拼接方式拼接產(chǎn)生三種mRNA,分別編碼由251、192、174個氨基酸殘基組成的VEGI-251、VEGI-192和VEGI-174異構(gòu)體。三者均含有IVb外顯子，其中三種拼接異構(gòu)體蛋白的C末端有151個氨基酸相同。由于全長的VEGI的可溶性差，導致其抗腫瘤效應(yīng)不佳。而VEGI-192A是一種相對可溶的內(nèi)源性因子。實驗證明VEGI-192A具有跟可溶性VEGI(即VEGI29-147氨基酸)相同的抑制內(nèi)皮細胞增生和抗腫瘤活性。體外實驗表明，VEGI-192A能顯著抑制牛動脈內(nèi)皮細胞與人臍靜脈內(nèi)皮細胞的增殖，在三種拼接異構(gòu)體中其抑制活性為最高，而對人冠狀動脈平滑肌細胞以及鼠路易士肺癌細胞LLC等其他類型的細胞無抑制增殖作用，且對腎臟、肝臟顯示無毒性。作為血管內(nèi)皮細胞自分泌的抑制因子，VEGI-192A具有重要的病理生理意義。另夕卜，VEGI-192A與血管生長抑制素(Angiostatin,AS)、內(nèi)皮生長抑制素(Endostatin,ES)等相比，能專一作用于內(nèi)皮細胞。鑒于4VEGI-192A的作用高效性與專一性，極有可能成為一種具有發(fā)展前景的抗血管生成藥物。自動化和微型化已經(jīng)成為后基因時代高通量研究工程的兩種關(guān)鍵因素。目前將VEGI-192A開發(fā)成腫瘤藥物方面，還缺乏一種高效率、低成本、穩(wěn)定可控的大規(guī)模生產(chǎn)技術(shù)。
發(fā)明內(nèi)容為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種人血管內(nèi)皮細胞生長抑制因子rhVEGI-192A的重組蛋白的制備方法，該制備方法既能高效表達外源蛋白，又能實現(xiàn)高度優(yōu)化自動誘導系統(tǒng)，能增加人血管內(nèi)皮細胞生長抑制因子rhVEGI-192A的重組蛋白的產(chǎn)量、純度和活性。本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下本發(fā)明的一種人血管內(nèi)皮細胞生長抑制因子rhVEGI-192A的重組蛋白的制備方法，包括用VEGI-192A基因編碼的核苷S臾序列構(gòu)建表達載體，并將所述表達載體在宿主細胞中誘導表達的步驟。進一步，該制備方法通過RT-PCR從人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞系HUVEC的總RNA擴增得到VEGI-192A目的基因片段，使用限制性內(nèi)切酶雙酶切取目的基因，連接至表達載體pET-30a中構(gòu)建重組蛋白rhVEGI-192A表達載體，再轉(zhuǎn)化至大腸桿菌宿主菌中誘導表達，最后純化蛋白。優(yōu)選的，上述RT-PCR中使用的上游引物和下游引物分別為上游引物為5，-TTCCATATGCAACTCACAAAGGGCCGTCT-3，；下游引物為5'-CGCGGATCCCTATAGTAAGAAGGCTCCAAAGAAGGTT-3，；該上下游引物都含有5'端的NdeI限制性酶切位點以及3'端的BamHI限制性酶切位點。優(yōu)選的，上述大腸桿菌宿主菌為OrigamiB(DE3)。5優(yōu)選的，上述轉(zhuǎn)化采用氯化釣轉(zhuǎn)化方式。優(yōu)選的，上述誘導采用pETT7RNA聚合酶復合自動誘導。優(yōu)選的，上述純化采用鎳離子金屬螯合親和層析本發(fā)明具有如下有益效果本發(fā)明的制備方法在保持rhVEGI-192重組蛋白天然空間構(gòu)象的基礎(chǔ)上，建立了高效、高產(chǎn)量、高活性、高純度表達目的蛋白的原核表達體系，優(yōu)化了表達條件，建立了目的產(chǎn)物分離、純化及復性的方法。本發(fā)明采用的pETT7RNA聚合酶自動誘導蛋白表達系統(tǒng)是建立在pET系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，主要是通過改變培養(yǎng)基的成分，從而使得不需要額外加入誘導劑而能表達目的蛋白。同時，這套系統(tǒng)特別適用于高通量篩選，因為這套系統(tǒng)解決了含有不同質(zhì)粒的菌很少同步搖起來的問題，從而使得進行高能量表達測試成為可能，并且可以提高目的蛋白的產(chǎn)量。具體來說，本發(fā)明rhVEGI-192重組蛋白自動誘導系統(tǒng)主要具有兩方面突出優(yōu)點降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效益。本發(fā)明使用乳糖代替了傳統(tǒng)的、較昂貴的誘導劑IPTG，一方面大大節(jié)約了培養(yǎng)基成本，經(jīng)濟成本為前者的約三十分之一；另一方面無需監(jiān)視細胞生長狀態(tài)以及手動添加誘導劑IPTG,極大方便了蛋白的生產(chǎn)操作；更加關(guān)鍵的是替換了非天然的有毒物質(zhì)IPTG的使用，更適合于醫(yī)藥領(lǐng)i或的應(yīng)用。本發(fā)明使用OrigamiB(DE3)作為表達的宿主菌，不僅可以擴大自誘導pET系統(tǒng)的優(yōu)勢，提高目的蛋白的產(chǎn)量，且表達出來的蛋白能形成正確折疊的二硫鍵，為后續(xù)的純化及復性帶來方便。OrigamiB菌林集BL21和Origami宿主菌的優(yōu)點于一體。OrigamiB宿主菌能根據(jù)IPTG的濃度精確調(diào)節(jié)表達產(chǎn)物，使得表達產(chǎn)物量呈現(xiàn)IPTG濃度依賴性。而且OrigamiB宿主菌能形成正確折疊的含有二硫鍵的蛋白，為后續(xù)的純化及復性帶來方便。本發(fā)明采用N產(chǎn)-NTA柱金屬螯合親和層析純化蛋白的方法對收集的重組蛋白包含體溶解液進行純化；并采用柱層析和梯度透析兩種復性方法以獲得高活性的蛋白。用N產(chǎn)-NTA樹脂進行的金屬鰲合層析分離純化N-端帶有6個連續(xù)組氨酸的融合蛋白，與其它蛋白純化提取系統(tǒng)相比具有獨特的優(yōu)點(1)融合標簽組氨酸在一般的蛋白質(zhì)中屬于稀有堿基，引入6個連續(xù)組氨酸的融合蛋白具有很高的特異性，弱親和性的雜蛋白較少被結(jié)合，在洗滌過程中易被清除，因而洗脫的目的蛋白純度相對更高；(2)N產(chǎn)-NTA樹脂可重復使用數(shù)次，有利于蛋白制備成本的控制。同時該純化方法快速、簡便、高效。下面將結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明。圖1是本發(fā)明IPTG誘導表達系統(tǒng)中高表達克隆的篩選獲得的16個克隆菌落裂解液的SDS-PAGE的一個優(yōu)選實施例的結(jié)果圖2是本發(fā)明IPTG誘導表達系統(tǒng)的條件優(yōu)化的SDS-PAGE—個優(yōu)選實施例的結(jié)果圖3是本發(fā)明自動誘導表達系統(tǒng)中高表達克隆的篩選獲得的8個克隆菌落裂解液的SDS-PAGE的一個優(yōu)選實施例的結(jié)果圖4是本發(fā)明自動誘導表達系統(tǒng)中高表達克隆的篩選獲得的2個克隆菌落裂解液的SDS-PAGE的一個優(yōu)選實施例的結(jié)果圖5是本發(fā)明自動誘導表達系統(tǒng)的不同誘導溫度下，七次用洗脫液洗脫下的目的蛋白的SDS-PAGE的一個優(yōu)選實施例的結(jié)果圖6是本發(fā)明自動誘導表達系統(tǒng)的不同誘導時間下的SDS-PAGE的一個優(yōu)選實施例的結(jié)果圖7是本發(fā)明中采用8種不同特性的變性劑溶解包含體檢測的最佳溶解方案；圖8是本發(fā)明中在變性條件下采用Ni-NTA柱金屬螯合親和層析技術(shù)純化提取重組蛋白的一個優(yōu)選實施例的結(jié)果圖9是本發(fā)明中鑒定目的蛋白的WesternBlotting的一個優(yōu)選實施例的結(jié)果圖IO是本發(fā)明MTT比色法檢測重組蛋白rhVEGI-192A體外劑量依賴性抑制牛主動脈內(nèi)皮細胞增殖的生物學活性的一個優(yōu)選實施例的結(jié)果圖11是本發(fā)明MTT比色法檢測重組蛋白rhVEGI-192A體外劑量依賴性抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖的生物學活性的一個優(yōu)選實施例的結(jié)果圖12是本發(fā)明AnnexinV-FITC/PI染色檢測rhVEGI-192A重組蛋白誘導內(nèi)皮細胞凋亡的生物學活性的一個優(yōu)選實施例的結(jié)果圖13是本發(fā)明采用雞胚絨毛尿嚢膜血管新生抑制試驗測定rhVEGI-192A重組蛋白體內(nèi)抑制血管新生活性的一個優(yōu)選實施例的結(jié)果圖。具體實施例方式為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例1:重組蛋白rhVEGI-192A表達載體的構(gòu)建通過PCR方法從人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞總RNA擴增獲得rhVEGI-192A目的基因。PCR上游引物為5'-TTCCATATGCAACTCACAAAGGGCCGTCT-3',下游引物為5，-CGCGGATCCCTATAGTAAGAAGGCTCCAAAGAAGGTT-3，。上下游引物都含有5'端的NdeI限制性酶切位點以及3'端的BamHI限制性酶切位點。再使用以上兩種限制性內(nèi)切酶雙酶切取目的基因，最后連接至表達載體pET-30a中構(gòu)建重組蛋白rhVEGI-192A表達載體。插入位點3'端含有編碼6個組氨酸的核普酸序列。rhVEGI-192A重組體的準確性正確讀碼框架均經(jīng)序列測定確認。實施例2:rhVEGI-192A在大腸桿菌中的IPTG誘導表達及高表達克隆的篩選。1.IPTG誘導采用表達載體pET-30a-rhVEGI-192A轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞8BL21(DE3)pLysS，隨機挑取16個克隆菌落到3mLLB培養(yǎng)基中，添加卡那霉素至終濃度5(Hig/ml,37。C復蘇培養(yǎng)過夜。次日測定每管菌液密度，如OD600在0.6至1之間就可加IPTG至一定終濃度，誘導培養(yǎng)4小時，陰性對照為不加IPTG誘導。通過SDS-PAGE分析重組表達的情況。獲得183個克隆菌落。2.LB培養(yǎng)基1%蛋白胨，0.5%酵母提取物，1%氯化鈉，pH7.0;羧千青霉素50mg/ml;IPTG溶液100mmol/L;3.篩選rhVEGI-192A蛋白高表達克隆應(yīng)用高通量SDS-PAGE的方法，從183個克隆菌落中篩選出表達效率最高的16個單菌落。圖1是IPTG誘導表達系統(tǒng)中高表達克隆的篩選獲得的16個克隆菌落裂解液進行的SDS-PAGE結(jié)果圖，其中1至16為高表達克隆菌落組，C為無IPTG誘導的克隆菌落組，M為蛋白質(zhì)分子量標準，宿主菌為BL21(DE3)pLysS。在進行后續(xù)表達、純化程序的同時低溫-80°C保種已篩選出的克隆菌落。SDS-PAGE后應(yīng)用凝膠掃描軟件分析目的蛋白表達量占到總菌體蛋白的44%。實施例3:IPTG誘導表達系統(tǒng)的條件優(yōu)化不同的培養(yǎng)條件影響目的蛋白表達量，包括溫度、IPTG濃度、誘導時工程菌的密度(OD600值)、宿主菌、誘導時間及誘導系統(tǒng)，通過預實驗摸索最佳表達條件。挑選#3號克隆菌落，進行蛋白誘導表達條件優(yōu)化實驗。圖2是本發(fā)明IPTG誘導表達系統(tǒng)的條件優(yōu)化，包括細菌誘導前培養(yǎng)時間和添加IPTG量，宿主菌為BL21(DE3)pLysS。每一組篩選更換一個參凄史，篩選最佳菌落時，使用的宿主菌為BL21(DE3)pLysS,誘導條件為IPTG:lmM,16h,溫度25°C;篩選最佳IPTG濃度時，使用的宿主菌為E.coliBL21(DE3)pLysS，誘導條件為16h，溫度25°C;篩選最佳誘導時間時，使用的宿主菌為BL21(DE3)pLysS，誘導條件為IPTG:lmM,溫度25°C;篩選最佳誘導溫度時，使用的宿主菌為BL21(DE3)pLysS，誘導條件為IPTG:lmM,16h;篩選最佳宿主菌時，誘導系統(tǒng)為自誘導系統(tǒng)，溫度為25。C,時間為16h。根據(jù)以上結(jié)果我們得出結(jié)論rhVEGI-192A蛋白在BL21(DE3)pLysS宿主菌誘導表達的最佳條件為IPTG添加量lmM，選定培養(yǎng)時間16h。實施例4:rhVEGI-192A在大腸桿菌中的自動誘導表M高表達克隆的篩選。1.自動誘導采用表達載體pET-30a-rhVEGI-192A轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞BL21(DE3)pLysS，隨機挑取一定數(shù)量克隆菌落到3mLLB培養(yǎng)基中，添加卡那霉素至終濃度50嗎/ml，37。C復蘇培養(yǎng)過夜。次日離心收集菌體沉淀，通過SDS-PAGE分析重組表達的情況。2.1000x微量金屬溶液0.05MFeCl3;0.12MHC1;0.02MCaCl2;0.01MMnCl2-4H20;0.01MZnS04-7H20;0.002MCoCl2-6H20;0.002MCuCl2-2H20;0.002MNiCl2-6H20;0.002MNa2Mo04-5H20;0.002MNa2SeOr5H20;0.002MH3B03.加雙蒸水定量到lOOml。3.自誘導表達培養(yǎng)基1%胰蛋白胨(tryptone),0.5%酵母提取物(yeastextract),25mMNa2HP04,25mMKH2P04,50mMNH4Cl,5mMNa2S04,2mMMgS04，0.2xmetals(10pMFe+9)，0.5%甘油(glycerol)(54mM),0.05%glucose(葡萄糖)(2.8mM),0.2。/。a-乳糖(a-lactose)(5.6mM)。4.應(yīng)用高通量SDS-PAGE的方法，從136個克隆菌落中篩選出表達效率最高的8個單菌落。圖3是本發(fā)明自動誘導表達系統(tǒng)中高表達克隆的篩選獲得的8個克隆菌落裂解液進行的SDS-PAGE結(jié)果圖，其中1至8為高表達克隆菌落組，C為轉(zhuǎn)化了空質(zhì)粒載體的克隆菌落組，M為蛋白質(zhì)分子量標準，宿主菌為BL21(DE3)pLysS。在進行后續(xù)表達、純化工作的同時低溫-80。C保種已篩選出的克隆菌落。SDS-PAGE后應(yīng)用凝膠掃描軟件分析目的蛋白表達量占到總菌體蛋白的50%。實施例5:自動誘導表達系統(tǒng)的條件優(yōu)化1.宿主菌優(yōu)化同時為改善rhVEGI-192的可溶性，我們更換宿主菌為OrigamiB(DE3),圖4是自動誘導表達系統(tǒng)中高表達克隆的篩選獲得的2個克隆菌落裂解液進行的SDS-PAGE結(jié)果圖，其中1至2為高表達克隆菌落組，C為轉(zhuǎn)化了空質(zhì)粒載體的克隆菌落組，M為蛋白質(zhì)分子量標準，宿主菌為OrigamiB(DE3)。其trxB和gor基因有突變，從而為重組蛋白在宿主菌中提供均衡氧化還原勢，以利于蛋白的正確空間折疊。根據(jù)上述實驗的結(jié)果，在兩種宿主菌中自動誘導rh-VEGI-192A重組蛋白的產(chǎn)量相差不大，但是在宿主菌OrigamiB(DE3)中自動誘導體系中背景雜蛋白較稍小，所以我們最終選擇宿主菌為OrigamiB(DE3)的#1號高表達克隆菌落，培養(yǎng)時間為16h，培養(yǎng)溫度為25°C，采用自誘導培養(yǎng)系統(tǒng)高密度培養(yǎng)來制備目的蛋白。2.誘導溫度優(yōu)化在10°C、25°C、37。C三種溫度下，自動誘導下大量表達rhVEGI-192A重組蛋白，并以包含體形式回收rhVEGI-192A。由結(jié)果可知誘導溫度越低，高活性的rhVEGI-192A重組蛋白(以二聚體或多聚體形式存在)越多。綜合產(chǎn)量和活性考量，我們選擇25。C誘導條件。圖5是自動誘導表達系統(tǒng)的誘導溫度條件優(yōu)化，分為三個梯度的溫度進行自動誘導10°C、25°C、37°C。El至E7分別表示七次用洗脫液洗脫下的目的蛋白進行的SDS-PAGE電泳條帶，BSA加樣量為2pg,M為蛋白質(zhì)分子量標準，宿主菌為OrigamiB(DE3)。3.誘導時間優(yōu)化在以下六個時間點2h，4h，8h，12h,16h，24h，分別收集菌液用裂解緩沖液裂解細菌進行SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白誘導產(chǎn)量。圖6是自動誘導表達系統(tǒng)的誘導時間條件優(yōu)化，分為以下六個時間點2h,4h,8h,12h，16h,24h。BSA加樣量為2嗎，M為蛋白質(zhì)分子量標準，宿主菌為OrigamiB(DE3)。由圖顯示，最佳誘導時間為16小時。實施例6:重組蛋白的純化與復性1.首先用8種不同特性的變性劑溶解包含體。圖7是采用8種不同特性的變性劑溶解包含體檢測的最佳溶解方案的比較圖。l至9分別表示為1:1%TritonX-100;2:0.1%TritonX畫100;3:CHAPS(3陽[(3-膽酰氨基丙基)二甲氨基]丙磺酸鹽)；4:PBS;5:Non-detergentsulfobetaines-195(l-(3-磺丙基)吡啶內(nèi)嗡鹽-195);6:8M尿素(Urea);7:4M尿素(Urea);8:0,3%N-十二烷?；“彼?N-Lauroylsarcosine);9:BSA(2嗎)，M為蛋白質(zhì)分子量標準，宿主菌為OrigamiB(DE3)。由此圖，得出最佳溶解方案利用8mM尿素溶解細菌和包含體。2.采用Ni-NTA柱金屬螯合親和層析技術(shù)純化提取重組蛋白1)取誘導培養(yǎng)的菌液，15000r/min，lmin離心收集菌體沉淀；加入1/100倍細菌培養(yǎng)液體積的細菌裂解液重懸細菌，15000r/min,lmin離心，收集上清液；2)在第1)步中收集到的上清液中加入1/4倍細菌培養(yǎng)液體積的50%Ni-NTAHis.Bind層析劑，然后將混合液放到搖床上，室溫下混合60min。(為了達到更好的結(jié)合效果，可以混合更長時間，不過如果時間^f艮長的話，應(yīng)在冰上操作，避免蛋白的降解)。將混合物裝柱，待柱料沉降完全后，收集剩余l(xiāng)mL上清，用于SDS-PAGE分析。3)用4ml洗滌液洗滌層析柱，流速約28-30滴/min,共洗滌8次，收集每次洗滌液/人層析柱流出的液體，用于SDS-PAGE分析。4)用0.5ml洗脫液洗脫目的蛋白，流速約28-30滴/min,共洗脫8次，收集每次洗滌液從層析柱流出的液體，用于SDS-PAGE分析。利用8mM尿素溶解細菌和包含體，采用Ni-NTA柱親和層析技術(shù)對收集的重組蛋白包含體溶解液進行純化。SDS-PAGE結(jié)果顯示，M2+-NTA親和層析柱與目的蛋白的結(jié)合能力很強，所以過柱后的流出液中幾乎無目的蛋白。鑒于我們的蛋白產(chǎn)量非常高，所以洗滌八次。洗脫的結(jié)果很好，SDS-PAGE結(jié)果顯示為電泳單帶，沒有其它的雜蛋白條帶，見圖8，圖8是本發(fā)明在變性條件下采用12Ni-NTA柱金屬螯合親和層析技術(shù)純化提取重組蛋白。Wl至W8為八次洗滌液點樣，E1至E8為八次洗脫液點樣，F(xiàn)T為過柱后流出液，BSA加樣量為2叫，M為蛋白質(zhì)分子量標準，宿主菌為OrigamiB(DE3)。3.重組蛋白的透析復性透析復性緩沖液(50xDialysisbuffer):購自Novagen公司，使用時稀釋成lxDialysisbuffer;lmol/LDTT:購自Novagerv^司；30%十二烷基月幾氨酸鈉溶液(N-lauroylsarcosine):購自Novagen公司；透析液A:1xDialysisbuffer,加入DTT至終濃度0.1mmol/L;透析液B:1xDialysisbuffer;透析液C:lxDialysisbuffer,加入lmmol/L還原型谷胱甘肽和0.2mmol/L氧化型谷胱甘肽。本實驗利用8mol/L尿素強變性劑保持蛋白的溶解性，在透析過程中使變性蛋白逐漸自然復性。將含有目的蛋白的洗脫液按比例用去離子水稀釋，加入4mol/L尿素溶液，裝入上述經(jīng)過預處理的透析袋中。取50倍于蛋白稀釋體積的透析液A，4。C透析3小時，更換透析液A繼續(xù)透析3小時。然后用透析液B透析3小時，更換透析液B繼續(xù)透析3小時。取25倍于蛋白稀釋體積的透析液C，4"C透析過夜。收集透析后蛋白，離心收集上清液。通過SDS-PAGE分析透析結(jié)果。對該純化蛋白應(yīng)用NovagenRefolding試劑盒結(jié)合陰離子交換樹脂的方法進行復性，成功建立了針對rhVEGI-192A的穩(wěn)定的復性方法，獲得可溶性的重組蛋白，復性得率約為60%。實施例7:WesternBlotting鑒定目的蛋白SDS-PAGE只能從分子量上去推測得到的是目的蛋白，要進一步確定得到的是目的蛋白，需要進行WesternBlotting。因為VEGI在牛主動脈內(nèi)皮細胞(ABAE)高表達，所以我們使用ABAE的細胞中的總蛋白作為陽性對照對我們實驗中表達出來的rhVEGIl-192A進行WesternBlotting分析。圖9是鑒定目的蛋白的WesternBlotting結(jié)果，其中，VEGI-192為本發(fā)明純化得到的重組蛋白，ABAE為收集牛主動脈內(nèi)皮細胞總蛋白中VEGI-192的表達水平。結(jié)果顯示與ABAE條帶平行的為單體，而上方的推測為多聚體，關(guān)于該13蛋白的高級結(jié)構(gòu)變性處理不充分，仍存在多聚體形式蛋白這在文獻有報道。這就證明我們純化提取的重組蛋白即為VEGI-192A。Westernblotting實驗方法將蛋白質(zhì)樣品進行SDS-PAGE,待溴酚藍跑出膠后停止電泳；準備好兩張3M濾紙和一張PVDF膜，浸入甲醇去離子水5分鐘，然后與專用濾紙和纖維墊浸泡于lx轉(zhuǎn)膜緩沖液中；剝下凝月交，去掉濃縮膠部分，并把濾紙和PVDF膜裁成凝膠大小；按照三明治夾心法轉(zhuǎn)膜，安置次序如下負極-纖維墊-1張專用濾紙-凝膠-PVDF膜-1張專用濾紙-纖維墊正極板，將其放入轉(zhuǎn)膜槽中；冰浴，300mA轉(zhuǎn)膜1小時；取出PVDF膜，封閉液封閉2小時；一抗孵育2小時；回收一抗，TBST洗膜，每次15min，重復3次；二抗孵育45-60min;回收二抗，TBST洗月莫，每次15min,重復3次；在暗房用ECL顯色液顯色。實施例8:濃度和純度的檢測1.純度檢測SDS-PAGE法檢測，96%單體，4%為多聚體。多聚體中95%為二聚體，3%為三聚體及多聚體。應(yīng)用透析法復性，并采用液相層析法去除內(nèi)毒素。以鱟試劑法檢測每批次蛋白內(nèi)毒素濃度均小于5EU/mg。2.濃度檢測采用BCA蛋白定量法對提取純化的rhVEGI-192A重組蛋白定量，得到定量標準曲線圖及濃度公式Y(jié)=0.046X+0.0382，相關(guān)系數(shù)R2達到0.999，結(jié)果準確度非常高。由此計算出獲取rhVEGI-192A重組蛋白最大產(chǎn)量達50mg/L(最佳產(chǎn)量菌抹并1號克隆)。蛋白表達量的測定方法(采用Novagen公司的BCAProteinAssayKit):1)繪制標準曲線，見表1。表1為繪制標準曲線加樣量的數(shù)據(jù)表。表l試管號12345678三蒸水(pL)25242321171395標準蛋白(nL)01248121620含量(fig)012481216202)將待測蛋白取2)iL,加入23|iL三蒸水。分別加入96孔板各孔中。3)配置工作反應(yīng)液A液B液為50:1，然后每孔加入200|liL工作14液，搖動30秒以混勻，37。C孵育30min。(A液和B液為Novagen公司的BCAProteinAssayKit試劑盒中提供)4)應(yīng)用酶標儀測定吸光度，然后根據(jù)標準曲線和吸光度計算蛋白的含量。實施例9:檢測rhVEGI-192A重組蛋白體外劑量依賴性抑制內(nèi)皮細胞增殖的生物學活性1.細胞培養(yǎng)牛主動脈內(nèi)皮細胞(ABAE)培養(yǎng)于含5。/。胎牛血清、2mML-谷氨酰胺、O.lmM非必需氨基酸、10mMHepes(羥乙基哌秦乙硫磺酸溶液)、100IU/ml青霉素和100嗎/ml鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基中，置于37°C、5%C02孵箱中孵育培養(yǎng)；傳代時用含0.02%EDTA的0.05%胰酶消化，以DMEM完全培養(yǎng)基終止消化。人臍靜脈內(nèi)皮細胞HUVEC培養(yǎng)于含20。/。胎牛血清HESFM培養(yǎng)基中，置于37。C、5%<:02孵箱中孵育培養(yǎng)；傳代時用上述胰酶消化，以胰酶抑制劑終止消化。2.MTT比色實驗將HUVEC和BAEC細胞消化后計數(shù)，按每孔1.0x104個細胞分別接種至96孔細胞培養(yǎng)板中，置于37。C、5。/。C02孵箱中孵育培養(yǎng)。24h后更換為含不同濃度的rhVEGI-192A的培養(yǎng)基，每個濃度均設(shè)3個平行復孔，繼續(xù)培養(yǎng)48h。隨后每孔加入5mg/mLMTT溶液20pL，37。C作用4h，離心后棄上清液，加入DMSO150jxL，振蕩器振蕩10min充分溶解結(jié)晶，置酶標儀上測定波長為570nm下的吸光度A值，按以下公式計算抑制率。細胞生長抑制率(％)=(對照組平均A值-實驗組平均A值)/對照組平均A值x100%。對照組即rhVEGI-192A濃度為0的培養(yǎng)孔。使用半數(shù)抑制濃度(IC50)計算軟件Bliss'ssoftware計算IC50,應(yīng)用SPSS軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。3.結(jié)果應(yīng)用MTT比色試驗法測定rhVEGI-192A重組蛋白對內(nèi)皮細胞生長增殖的抑制活性結(jié)果見圖10和圖11。圖10是本發(fā)明MTT比色法檢測重組蛋白rhVEGI-192A體外劑量依賴性抑制牛主動脈內(nèi)皮細胞增殖的生物學活性的一個優(yōu)選實施例的結(jié)果圖；圖ll是本發(fā)明MTT比色法檢測重組蛋白rhVEGI-192A體外劑量依賴性抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖的生物學活性的一個優(yōu)選實施例的結(jié)果圖。rhVEGI-192重組蛋白抑制內(nèi)皮細胞生長活性非常強，對HUVEC細胞系IC50為0.566185嗎/mL,對牛主動脈內(nèi)皮細胞系(ABAE)的IC50為0.100979嗎/mL。實施例10:AnnexinV-FITC/PI染色檢測rhVEGI-192A重組蛋白誘導內(nèi)皮細胞凋亡結(jié)果使用AnnexinV細胞染色分析檢測細胞早期凋亡指標。在正常細胞中，磷脂酰絲氨酸只分布在細胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在細胞凋亡早期，細胞膜中的磷脂酰絲氨酸由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。A皿exinV是一種的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過細胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結(jié)合。因此AnnexinV被作為檢測細胞早期凋亡的靈壽丈指標之一。將AnnexinV進行熒光素FITC標記，以標記了的AnnexinV作為熒光探針，利用熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶(PropidiumIodide,PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但對凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過細胞膜而使細胞核染紅。因此將AnnexinV與PI匹配4吏用，就可以將處于不同凋亡時期的細胞區(qū)分開來。AnnexinV-FITC/PI染色方法將HUVEC細胞分別用0.5|xg/mLrhVEGI-192A蛋白處理后，用細胞刮從培養(yǎng)亞上刮取細胞，1xPBS洗滌細胞二次(2000xrpm離心5min)，收集5x105個細月包。加入500的BindingBuffer懸浮細胞后，加入5|uLAnnexinV-FITC混勻，再加入5pL》典化丙4走(PI),混勻，室溫避光反應(yīng)5~15min。在1h內(nèi)，在熒光顯微鏡下進行觀察并拍照，AnnexinV-FITC熒光信號呈綠色，PI熒光信號呈紅色。:對HUVEC細胞用rhVEGI-192A重組蛋白0.5嗎/mL處理8小時后，結(jié)果見圖12，由圖可知，rhVEGI-192重組蛋白能夠誘導人臍靜脈內(nèi)皮細胞HUVEC的凋亡。實施例11:rhVEGI-192A嵌合蛋白的抑制雞胚絨毛尿嚢血管新生生物學活性檢測種蛋孵化第6天，在超凈臺上將蛋胚用酒精消毒后用牙科鉆或砂輪在蛋胚頂端戳一小口，然后小心地去掉周圍的蛋殼和殼膜，使開口約為L5cmxl.5cm大小。此時可以看到氣室底部隔著一氣室膜即為CAM膜，并且可以清楚地看到CAM膜上血管網(wǎng)的大小和分布位置以及ilt動的雞胚心臟。確定加樣部位后小心地用注射針頭從氣室與卵黃分隔處挑破氣室膜，注人l-2滴無菌水，使氣室膜與CAM膜分開，然后用鑷子輕輕去除上層的氣室膜,暴露下層的CAM膜。先期準備好樣品，并分為三組PBS對照組，I組(加rhVEGI-192A重組蛋白10mg)II組(加rhVEGI-192A重組蛋白20mg)，將樣品以10pL體積拌加到5mmx5mm大小的明膠海綿載體上風干后，用鑷子輕輕將載樣濾紙置于CAM和卵黃嚢膜處血管較少的部位，然后用滅菌透明膠封口，繼續(xù)孵育48h或更長時間。由觀察窗加入甲醇丙酮=1:1的固定液預固定15min，去掉雞胚，取下CAM并與蛋皮分離，完成后固定，將CAM平鋪在平板或濾紙上，可長期保存。解剖鏡下相同放大倍數(shù)計數(shù)血管，根據(jù)直徑分為大、中、小三種血管。以實驗部位邊緣lmm范圍內(nèi)為一級血管，以實驗部位邊緣5mm處為二級血管，一、二級管血管分別觀察分析。以被檢物為中心，周圍血管放射狀朝向被檢物的生長狀態(tài)，稱為血管輻揍。主干血管向載體盤的彎曲和靠近稱之為血管的吸引。在解剖顯微鏡觀察下，根據(jù)血管直徑將血管分為3類d>0.1mm為大血管;0.1mmXiX).05mm為中血管;dO.05mm為小血管(王蕾，張樹成，吳志奎，等，中國藥理與臨床，2000,16(6):46-47)。陽性標準表現(xiàn)出明顯的血管輻輳，以實驗部位為中心，尿囊膜血管大量向載體生長集中，排列成車輻狀，其中有l(wèi)條以上中血管或小血管成車輻狀，但同時有中等以上的血管吸引。陰性標準周圍血管形成正常，或血管反應(yīng)較輕，向載體生長的血管少而細，分布零亂，甚至產(chǎn)生視覺可見的無血管區(qū)域。居于二者之間的也定為陰性。血管計數(shù)可結(jié)合自動圖像分析系統(tǒng)、攝像等技術(shù)完成。我們觀察明膠海綿載體周圍lcm范圍內(nèi)與遠離(大于lcm)位置的血管密度，計算出現(xiàn)血管新生抑制的雞胚數(shù)目，數(shù)據(jù)進行方差分析。表2是rhVEGI-192A重組蛋白對雞胚尿囊膜一級血管，二級血管的抑制作用分析數(shù)據(jù)，表3是rhVEGI-192A重組蛋白對雞胚尿嚢膜大、中、小血管的抑制作用分析數(shù)據(jù)，圖13是采用雞胚絨毛尿囊血管新生抑制試驗測定rhVEGI-192A重組蛋白體內(nèi)抑制血管新生活性。用PBS作對照組，I組加rhVEGI-192A重組蛋白10mg，II組加rhVEGI-192A重組蛋白20mg。由結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)rhVEGI-192A重組蛋白組相比較于對照組，大血管數(shù)目變化不顯著，血管分支明顯減少,中小血管數(shù)目明顯降低,且隨著濃度增加抑制效果增強，說明兩組蛋白均濃度依賴性顯著抑制新生血管生成，且主要抑制中、小血管的新生。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>*P<0.05最后所應(yīng)當說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對本發(fā)明保護范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和范圍。權(quán)利要求1、一種人血管內(nèi)皮細胞生長抑制因子rhVEGI-192A的重組蛋白的制備方法，其特征在于，包括用VEGI-192A基因編碼的核苷酸序列構(gòu)建表達載體，并將所述表達載體在宿主細胞中誘導表達的步驟。2、一種人血管內(nèi)皮細胞生長抑制因子rhVEGI-192A的重組蛋白的制備方法，其特征在于，通過RT-PCR從人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞系HUVEC的總RNA擴增得到VEGI-192A目的基因片段，使用限制性內(nèi)切酶雙酶切取目的基因，連接至表達載體pET-30a中構(gòu)建重組蛋白rhVEGI-192A表達載體，再轉(zhuǎn)化至大腸桿菌宿主菌中誘導表達，最后純化蛋白。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述RT-PCR中使用的上游引物和下游引物分別為上游引物為5，-TTCCATATGCAACTCACAAAGGGCCGTCT-3，；下游引物為5'-CGCGGATCCCTATAGTAAGAAGGCTCCAAAGAAGGTT-3，；所述的上下游引物都含有5'端的Ndel限制性酶切位點以及3，端的BamHI限制性酶切位點。4、根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述的大腸桿菌宿主菌為OrigamiB(DE3)。5、根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述的轉(zhuǎn)化采用氯化鈣轉(zhuǎn)化方式。6、根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述的誘導采用pETT7RNA聚合酶復合自動誘導。7、根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述的純化采用鎳離子金屬螯合親和層析。全文摘要本發(fā)明提供了一種人血管內(nèi)皮細胞生長抑制因子rhVEGI-192A的重組蛋白的制備方法，包括用VEGI-192A基因編碼的核苷酸序列構(gòu)建表達載體，并將所述表達載體在宿主細胞中誘導表達的步驟。具體的，從人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞系HUVEC的總RNA擴增得到VEGI-192A基因片段，使用限制性內(nèi)切酶雙酶切取目的基因，連接至表達載體pET-30a中構(gòu)建重組蛋白表達載體，再轉(zhuǎn)化至大腸桿菌宿主菌中誘導表達，最后純化蛋白。該方法在保持rhVEGI-192重組蛋白天然空間構(gòu)象的基礎(chǔ)上，建立了高效、高產(chǎn)量、高活性、高純度表達目的蛋白的原核表達體系，優(yōu)化了表達條件，建立了目的產(chǎn)物分離、純化及復性的方法。文檔編號C12N15/63GK101503697SQ20091003770公開日2009年8月12日申請日期2009年3月9日優(yōu)先權(quán)日2009年3月9日發(fā)明者何振健,古明暉,吳玨珩,蕾夏,勛朱,李魯遠,潔袁,賀海朋,馬劍達,黎孟楓申請人:中山大學