專(zhuān)利名稱(chēng)：乳糖診斷/測(cè)定試劑(盒)及乳糖濃度測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種乳糖診斷/測(cè)定試劑(盒)，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定乳糖濃度的方
法，屬于醫(yī)學(xué)/食品檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
乳糖是嬰幼兒主要的能量來(lái)源，進(jìn)入體內(nèi)后經(jīng)小腸乳糖酶作用分解成葡萄糖和半 乳糖，半乳糖是嬰幼兒腦發(fā)育的必需物質(zhì)，與嬰幼兒大腦的迅速成長(zhǎng)有密切聯(lián)系。為防止乳 清粉中摻加用其他還原糖如葡萄糖替代乳糖，乳糖的檢測(cè)十分必要。 牛奶是一種營(yíng)養(yǎng)豐富的食品，但如飲用不當(dāng)，也會(huì)給健康帶來(lái)不良影B向。很多人在 飲奶后出現(xiàn)腹部不適、腹脹、多屁、腹痛甚至腹瀉等癥狀，這種現(xiàn)象在醫(yī)學(xué)上稱(chēng)為乳糖不耐 受癥，其原因是這些人小腸缺乏乳糖酶、不能消化牛奶中的乳糖，乳糖進(jìn)入結(jié)腸后，經(jīng)結(jié)腸 中的細(xì)菌發(fā)酵，產(chǎn)生大量氣體、醋酸等物質(zhì)所致。大量研究證實(shí)，患有乳糖不耐受的人還有 大部分沒(méi)有任何癥狀、只有人體生化指標(biāo)改變的隱性不耐受者，醫(yī)學(xué)上稱(chēng)為乳糖吸收不良 或乳糖酶缺乏。 據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界都存在乳糖不耐受的問(wèn)題，其中亞洲人發(fā)生率最高，為 95%-100%。據(jù)中國(guó)疾病控制中心調(diào)查，我國(guó)北京、上海、廣州等地3_13歲兒童乳糖不耐受 癥和乳糖吸收不良的發(fā)生率約為80%。乳糖不耐受除引起消化道癥狀外，還可造成人體營(yíng) 養(yǎng)吸收不良。據(jù)國(guó)外研究，乳糖不耐受可減少鈣的攝入、減少峰值骨量、增加骨丟失從而引 發(fā)骨質(zhì)疏松癥，乳糖不耐受可影響鐵和鋅的吸收，造成鐵缺乏和鋅缺乏，并可影響小兒的腦 發(fā)育，對(duì)人體健康危害很大。 在食品分析領(lǐng)域中，酶分析法是廣為使用并倍受諸如ISO等國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)機(jī)構(gòu)推薦的 一種方法。酶析法理論發(fā)展成熟并且已為實(shí)驗(yàn)室普遍接受。使用高質(zhì)量經(jīng)純化的酶可以實(shí) 現(xiàn)對(duì)復(fù)雜物質(zhì)中特定成份的檢測(cè)。該方法可以檢測(cè)的目標(biāo)代謝物有糖類(lèi)、酸類(lèi)及其鹽類(lèi)、醇 類(lèi)和其他物質(zhì)等。由此，各種食品樣品均可被快速檢測(cè)并獲得良好的結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提出一種利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，計(jì)量還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶) 在340nm波長(zhǎng)處吸光度的變化，得以測(cè)定乳糖濃度的方法，同時(shí)，本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn) 該方法的乳糖診斷/測(cè)定試劑(盒)，采用該試劑不僅可以在紫外/可見(jiàn)光分析儀或半、全 自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行乳糖濃度測(cè)定，而且測(cè)定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí)的推 廣應(yīng)用。 本發(fā)明乳糖濃度測(cè)定方法如下 乳糖+水乳糖酶半乳糖+葡萄糖 葡萄糖+氧葡萄糖氧化酶葡糖酸內(nèi)酯+過(guò)氧化氫 過(guò)氧化氫+輔酶NAD (P) H氧化酶還原型輔酶+氧
這種方法應(yīng)用乳糖酶(lactase ;EC 3. 2. 1. 108)酶(偶)聯(lián)葡萄糖氧化酶 (GlucoseOxidase ;EC 1. 1. 3. 4) 、 NAD(P)H氧化酶(NAD(P)H oxidase ;EC 1. 6. 3. 1)酶促反
應(yīng)比色終點(diǎn)法。乳糖酶酶解乳糖反應(yīng)產(chǎn)生葡萄糖，再通過(guò)(偶)聯(lián)合葡萄糖氧化酶、NAD(P) H氧化酶的作用，最終將輔酶(在340nm處沒(méi)有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處 有吸收峰)，從而得以測(cè)定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的程度，通過(guò)測(cè)量340nm處吸 光度上升的程度，可以測(cè)算乳糖的濃度大小。 實(shí)驗(yàn)表明，從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮，無(wú)論是單
劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明乳糖診斷/測(cè)定試劑(盒)較為理想 緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500mmol/L 輔酶 3mmol/L 乳糖酶 10000U/L 葡萄糖氧化酶 12000U/L NAD(P)H氧化酶 12000U/L 本發(fā)明的乳糖診斷/測(cè)定試劑(盒)可以是單劑，包括 緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、乳糖酶、葡萄糖氧化酶、NAD(P)H氧化酶。 試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，
直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑
試劑1 緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶。
試劑2 緩沖液、穩(wěn)定劑、乳糖酶、葡萄糖氧化酶、NAD (P) H氧化酶。 輔酶、乳糖酶、葡萄糖氧化酶、NAD(P)H氧化酶在試劑1或試劑2中的位置可以不 限。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑
試劑1 緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶。
試劑2 緩沖液、穩(wěn)定劑、葡萄糖氧化酶、NAD (P) H氧化酶。
試劑3 緩沖液、穩(wěn)定劑、乳糖酶。 輔酶、乳糖酶、葡萄糖氧化酶、NAD(P)H氧化酶在試劑1、試劑2或試劑3中的位置 可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試 劑，直接使用。 無(wú)論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測(cè)定乳糖濃度的方法，其輔酶可以是NADP+、 NAD+或thio-NAD+中的一種。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。
實(shí)施例一 本實(shí)施例的乳糖診斷/測(cè)定試劑為單試劑，包括 [O(HO] 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 500mmol/L
輔酶 3,1/L
乳糖酶 10000U/L
葡萄糖氧化酶 12000U/L
NAD (P) H氧化酶 12000U/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈 水，復(fù)溶后使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度《0. l，測(cè)
試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)乳糖樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)?br> 正反應(yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約0分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)
主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的程度，從而測(cè)算出乳糖的濃度大小。 實(shí)施例二 本實(shí)施例的乳糖診斷/測(cè)定試劑為雙試劑，包括
試劑l三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 50mmol/L
輔酶 3mmol/L
試劑2三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 50mmol/L 乳糖酶 10000U/L 葡萄糖氧化酶 12000U/L NAD (P) H氧化酶 12000U/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度《0. l，測(cè)
試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)乳糖樣品與試劑1、試劑2的體積比例為2/20/5，
反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約0分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)
主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的程度，從而測(cè)算出乳糖的濃度大小。 實(shí)施例三 本實(shí)施例的乳糖診斷/測(cè)定試劑為三試劑，包括
試劑1三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L












穩(wěn)定劑
輔酶
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
葡萄糖氧化酶 NAD (P)H氧化酶 試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑 乳糖酶
50mmol/L 3mmol/L
100,1/L 500,1/L 12000U/L 12000U/L
100,1/L 500,1/L 10000U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。
測(cè)定乳糖濃度時(shí)，在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng)時(shí)間IO分鐘，起始
吸光度《0. 1，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)乳糖樣品與試劑1、試劑2、試劑3 的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約0分鐘左右，檢測(cè) 時(shí)間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè) 主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的程度，從而測(cè)算出乳糖的濃度大小。 申請(qǐng)人:經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他測(cè)定方法均能達(dá)到本發(fā)明 的目的，鑒于測(cè)定步驟等情況與以上實(shí)施例類(lèi)同，不另一一例舉。 總之，實(shí)驗(yàn)證明采用本發(fā)明的測(cè)定方法完全可以通過(guò)一般生化分析儀器得出所 需的測(cè)定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0. 0007 ;吸光度時(shí)間反應(yīng)曲線應(yīng)呈上 升曲線直至終點(diǎn)；試劑可測(cè)有效(R > 0. 99)線形范圍可達(dá)20mmol/L ;試劑測(cè)試的不準(zhǔn)確 度，其相對(duì)偏差不超過(guò)±3% ;試劑測(cè)試的精密度(重復(fù)性)的變異系數(shù)(CV)《2% ;試劑 的靈敏度可達(dá)O. 0018±0. 0009 AA/mmol/L ;試劑在2-8"下保存，活性可以穩(wěn)定一年；—— 本發(fā)明靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，穩(wěn)定期長(zhǎng)，足以便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
一種酶比色法及酶聯(lián)法的乳糖的濃度測(cè)定方法，其方法如下乳糖+水 乳糖酶 半乳糖+葡萄糖葡萄糖+氧 葡萄糖氧化酶 葡糖酸內(nèi)酯+過(guò)氧化氫過(guò)氧化氫+輔酶 NAD(P)H氧化酶 還原型輔酶+氧將最終反應(yīng)物置于紫外/可見(jiàn)光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的程度，測(cè)算出乳糖的濃度大小測(cè)定結(jié)果。
2. —種乳糖診斷/測(cè)定試劑(盒)，主要成分包括緩沖液 20-500mmol/L穩(wěn)定劑 1-4000mmol/L輔酶 1-6mmol/L乳糖酶 1000——80000U/L 葡萄糖氧化酶 1000——80000U/L NAD (P) H氧化酶 1000-80000U/L試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好，在此范圍外，試劑仍會(huì) 反應(yīng)作用。其特征在于試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液 體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述乳糖診斷/測(cè)定試劑(盒)，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、乳糖酶、葡萄糖氧化酶、NAD(P)H氧化酶組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述乳糖診斷/測(cè)定試劑(盒)，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、乳糖酶、葡萄糖氧化酶、NAD(P)H氧化酶組成雙劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、乳糖酶、葡萄糖氧化酶、NAD(P)H 氧化酶組成。輔酶、乳糖酶、葡萄糖氧化酶、NAD(P)H氧化酶在試劑1或試劑2中的位置可 以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述乳糖診斷/測(cè)定試劑(盒)，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、乳糖酶、葡萄糖氧化酶、NAD(P)H氧化酶組成多劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、葡萄糖氧化酶、NAD(P)H氧化酶 組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、乳糖酶組成。輔酶、乳糖酶、葡萄糖氧化酶、NAD(P)H氧化酶 在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述乳糖診斷/測(cè)定試劑(盒)，其特征在于還包括穩(wěn)定劑 l-4000mmol/L或0. 1% _100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(A,niaSulfate)、甘油 (Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一 種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的乳糖診斷/測(cè)定試劑(盒)，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定乳糖濃度的方法、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)/食品檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑(盒)主要成分包括緩沖液、輔酶、乳糖酶、葡萄糖氧化酶、NAD(P)H氧化酶及穩(wěn)定劑；通過(guò)將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見(jiàn)光分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm處吸光度上升的程度，從而測(cè)算出乳糖的濃度大小。
文檔編號(hào)C12Q1/00GK101793803SQ20091002857
公開(kāi)日2010年8月4日 申請(qǐng)日期2009年2月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月4日
發(fā)明者王爾中 申請(qǐng)人:蘇州艾杰生物科技有限公司